毛　冉，李清泉，石劍華，王　敏,2，張廣和，韓天龍,2*(.赤峰市農(nóng)牧科學研究院，內(nèi)蒙古 赤峰 02403；2.吉林大學 動物醫(yī)學學院，吉林 長春 30062；3.赤峰市農(nóng)畜產(chǎn)品質(zhì)量安全管理站，內(nèi)蒙古 赤峰 024000)

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不同糖類稀釋液對低溫保存杜泊羊鮮精的影響

毛冉1，李清泉1，石劍華1，王敏1,2，張廣和2,3，韓天龍1,2*(1.赤峰市農(nóng)牧科學研究院，內(nèi)蒙古 赤峰 024031；2.吉林大學 動物醫(yī)學學院，吉林 長春 130062；3.赤峰市農(nóng)畜產(chǎn)品質(zhì)量安全管理站，內(nèi)蒙古 赤峰 024000)

[摘要]為了比較添加不同糖類(葡萄糖、果糖、D-半乳糖和蔗糖)稀釋液對杜泊羊鮮精品質(zhì)的影響，試驗選用3歲健康杜泊種公羊3只，采集精液，等量分裝，分別加入等量等溫的含不同糖類的精液稀釋保存液，并在0 h、6 h、24 h、30 h、48 h、54 h、72 h和78 h對精子活率、質(zhì)膜完整率和頂體完整率進行檢測。結(jié)果表明，混合糖精子活力、質(zhì)膜完整率和頂體完整率都最高，與其他組差異顯著(P<0.05)；D-半乳糖組質(zhì)膜完整率比葡萄糖組和果糖組高，差異顯著(P<0.05)，其他指標三者差異不顯著(P>0.05)；蔗糖組效果較差，與其他組差異顯著(P<0.05)，對照效果最差，與其他組差異極顯著(P<0.01)；有效存活時間和生存指數(shù)混合糖組最高。結(jié)果提示：添加葡萄糖、果糖和D-半乳糖的混合糖作為杜泊羊新鮮精液的保存液效果較好。

[關(guān)鍵詞]杜泊羊；精液稀釋液；糖；鮮精；品質(zhì)

糖類在精液稀釋保存液中有多種作用。首先，糖類是精液稀釋保存液中重要的滲透壓保護劑，能夠在親水組織中替代水分子，防止精子膜結(jié)構(gòu)因滲透壓變化而造成損傷[1]，有利于精子膜結(jié)構(gòu)的完整，從而提高精子活力[2-3]；其次，糖類可為精子補充能量，維持細胞基本代謝，減少精子自身能量消耗，延長精子在體外的存活時間，提高精子受精能力[4-5]。目前我國大部分養(yǎng)殖場杜泊羊都是采用凍精進行人工授精，但受胎率較低，在60%左右且不穩(wěn)定，而用常規(guī)液態(tài)保存的精液進行人工授精后效果比凍精好，且費用低、操作程序簡單，但是鮮精稀釋保存液大多數(shù)保存時間短，給生產(chǎn)帶來很多不便。綜合國內(nèi)外資料，羊凍精保存稀釋液主要有三類，即Tris-檸檬酸-糖類組合、EDTA-檸檬酸鈉-糖類組合和檸檬酸鹽-糖類組合[6]，都含有糖類；熊前等研究發(fā)現(xiàn)，含糖的稀釋液優(yōu)于不含糖的稀釋液[7]，而目前關(guān)于精子在體外長時間培養(yǎng)期間的糖代謝研究尚少[8]，所以篩選出適宜鮮精體外保存的糖類稀釋保存液非常重要。

本研究以杜泊羊為研究對象，通過比較稀釋液中添加葡萄糖、果糖、D-半乳糖、蔗糖對精液品質(zhì)的影響，以期，篩選出有利于杜泊羊鮮精液保存的最佳糖類稀釋液。

1材料與方法

1.1試驗動物

精液采自某羊場3只健康杜泊種公羊，年齡3歲，按常規(guī)飼養(yǎng)管理。

1.2試驗主要試劑

新鮮卵黃液；葡萄糖(Glucose，C6H12O6，180.16)，蔗糖(Sucrose，C12H22O11，342.29)，檸檬酸鈉(Sodium Citrate，C6H5Na3O7·2H2O，294.10)均購自天津市致遠化學試劑有限公司；果糖(Fructose，C6H12O6，180.16)購自上海恒遠生化制劑有限公司；D-半乳糖(D-galactose，C6H12O6，180.16)購自北京博奧公司；瑞氏-姬姆薩復合染液，購自Solarbio公司；滅菌蒸餾水。

1.3稀釋液的組成

采用本實驗室對8種常用精液稀釋液進行篩選后得出的效果較好的配方(檸檬酸鈉-卵黃為基礎，pH值為6.8)作為基礎配方，分別添加不同的糖類組成試驗用稀釋液(見表1)。

表1　含不同糖類的精液稀釋液配方

1.4精液采集與處理

采用假陰道法采集精液，精液采集后放入預熱的集精杯中，立即送往實驗室，室溫下進行活率檢測。為防止因杜泊羊個體差異造成的試驗誤差，把活率達到0.8以上、色澤和氣味正常且密度3.5×109個/mL以上的精液進行混合，等量分裝6份，分別加入預溫好的6種稀釋液(按照精液與稀釋液1∶2稀釋)，每組設1個重復，置于4 ℃保存。隔3 d后，繼續(xù)按上述方法采集精液檢測作為重復，重復2次。

1.5檢測指標

1.5.1精子活率的檢測取上述保存0 h、6 h、24 h、30 h、48 h、54 h、72 h、78 h的精液，用生理鹽水進行1∶10稀釋后，光學顯微鏡下400 ×觀察活率并記錄，每次設3個重復。

依據(jù)精子活率檢測結(jié)果，分別計算精子有效存活時間和精子生存指數(shù)。精子有效存活時間是指精子活力在0.6以上的保存時間；精子生存指數(shù)是指平均存活時間，表示精子活力下降速度，即相鄰兩次精子活力的平均數(shù)與間隔時間乘積的總和。

1.5.2精子質(zhì)膜完整率取10 μL精液加入100 μL果糖檸檬酸鈉等溫低滲液中，37 ℃孵育30 min。400 ×顯微鏡下計數(shù)彎尾精子數(shù)。每次檢測200個精子。

1.5.3精子頂體完整率用瑞-姬氏染色法測定精子頂體完整率[9]。于1000 ×顯微鏡下觀察頂體完整數(shù)，每次檢測200個精子。頂體完整率=頂體完整精子數(shù)/計數(shù)精子數(shù)×100 %。

1.6數(shù)據(jù)分析

采用SPSS18.0軟件進行方差分析，采用標準差(mean±SD)表示 。

2結(jié)果與分析

2.1不同糖類稀釋液對鮮精活率、存活時間和生存指數(shù)的影響

由表2可知，精子經(jīng)含不同糖類稀釋液保存后，精子活力隨保存時間的延長而逐漸下降。6 h時，對照組精子活率下降到62%，混合糖組活率最高為90%；24 h時，對照組降到45%，混合糖組仍可達到82%，葡糖組、果糖組和D-半乳糖組僅次于混合糖組，活率可達到78%，蔗糖組差，活率為63%，對照組最差；48 h時精子活率大于60%的只有葡萄糖組、果糖組、D-半乳糖組和混合糖組，對照組已經(jīng)降到12%；78 h時還有存活的只有葡萄糖組、果糖組、D-半乳糖組和混合糖組，且活率達40%以上，其中混合糖組活率最高，對照組和蔗糖組活率為0。

表2　不同糖類稀釋液中精子的平均活率

由表3知，混合糖組最高精子的有效存活時間為57.7 h，是對照組的9倍，與其他組差異顯著(P<0.05)；其次是葡萄組、果糖和D-半乳糖組，為49 h左右，三者間差異不顯著(P>0.05)，是對照組的7倍；蔗糖組效果相對較差，有效存活時間為28.1 h，是對照組的4倍，與其他組差異顯著(P<0.05)。

生存指數(shù)表示精子活率下降速度，指數(shù)越高，說明活率越強，品質(zhì)越好。由表3可知，混合糖組精子生存指數(shù)達到60.0以上，與其他組差異顯著(P<0.05)；其次是葡萄組、果糖組和D-半乳糖組，可達到50.0以上，三者間差異不顯著(P>0.05)；蔗糖組差，為30.5，與其他組差異顯著(P<0.05)，對照組最差，與其他組差異顯著(P<0.05)。

表3　不同糖類稀釋液稀釋中精子的存活時間及生存指數(shù)

注：同行數(shù)據(jù)相同字母表示差異不顯著(P>0.05)；不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

Notes:In same line,same lowercase superscripts mean insignificant difference(P>0.05),different lowercase superscripts mean significant difference(P<0.05) .

2.2不同糖類稀釋液對精子質(zhì)膜完整率的影響

由表4可知，隨著時間的延長，各組精子的質(zhì)膜完整率逐漸下降。6 h時，混合糖組質(zhì)膜完整率最高，為86.6%，與其他組差異顯著(P<0.05)，葡萄組、果糖和D-半乳糖組效果次之，三者差異不顯著(P>0.05)；48 h精子質(zhì)膜完整率大于60%的只有D-半乳糖組和混合糖組，且混合糖組最高，為63.7%，D-半乳糖組為60.1%，二者相比差異顯著(P<0.05)；葡萄組和果糖組次之，二者差異不顯著(P>0.05)；蔗糖較差，與其他組差異顯著(P<0.05)；對照組最差，與其他組差異極顯著(P<0.01);78 h時，質(zhì)膜完整率以混合糖最高，其次是D-半乳糖組，差異顯著(P<0.05)。

表4　不同糖類稀釋液中精子質(zhì)膜完整率

注：同列數(shù)據(jù)相同字母表示差異不顯著(P>0.05)；不同字母表示差異顯著(P<0.05)，大寫字母不同者差異極顯著；(P<0.01)。下同。

Notes:In same column,same lowercase superscripts mean insignificant difference(P>0.05)，different lowercase superscripts mena significant difference(P<0.05),and different uppercase mean extremely significant difference(P<0.01) .The same below.

2.3不同糖類稀釋液對精子頂體完整率的影響

由表5可知，鮮精液稀釋保存液中精子頂體完整率隨著時間的延長而降低，48 h精子頂體完整率大于70%的只有葡萄組、果糖組、D-半乳糖組和混合糖組，且混合糖組最高，但與葡萄組、果糖組和D-半乳糖組相比無顯著性差異(P>0.05)；蔗糖組次之，與其他組差異顯著(P<0.05)，對照組效果最差；78 h時，葡萄組、果糖組、D-半乳糖組和混合糖組頂體完整率仍可達到60%，各組間差異不顯著(P>0.05)。

表5 不同糖類稀釋液中精子頂體完整率

3討論

用羊凍精進行人工授精繁殖的受胎率低于自然配種及鮮精人工授精[10]。凍精經(jīng)過冷凍和解凍過程后使有效精子濃度降低，且冷凍精子的質(zhì)膜、頂體結(jié)構(gòu)都會受到破壞，這些都影響著凍精受胎率。鮮精精子活率高、密度大、受胎率高，生產(chǎn)中平均受胎率能達到70%以上。但鮮精稀釋后在高溫保存時活率下降快，精子的有效存活時間較短，僅數(shù)小時過后即會失去應用價值[11]。

目前，常用的精液稀釋液中糖類主要有果糖、葡萄糖及蔗糖等，且多數(shù)都應用于凍精，在杜泊羊鮮精稀釋保存液上研究的相對少，尤其是D-半乳糖研究的更少。

精子活率是反映精子功能狀態(tài)的一個重要指標，是保證精子通過雌性生殖道并與卵子相遇、穿透卵膜的重要條件[12]。張叔山等[13]比較了在冷凍保存液中添加不同水平海藻糖、蔗糖和乳糖對豬精液冷凍保護的效果，結(jié)果表明，添加3種雙糖均能提高精液的冷凍保護效果，其中海藻糖和蔗糖的保護效果顯著高于乳糖和對照組。

活率高的精子不等于精子質(zhì)膜完整，精子質(zhì)膜受到破壞，會導致其存活率和受精率的下降，死精子則完全喪失了膜的通透性[14-15]，同樣失去受精能力。精子質(zhì)膜的完整性對于維持自身新陳代謝、獲能、頂替反應、粘附和穿透卵母細胞透明帶等至關(guān)重要[16]，所以精子質(zhì)膜完整性是精子死活的一個間接檢測指標[17]。本研究顯示混合糖效果最好，其次是D-半乳糖，48 h精子質(zhì)膜完整率都大于60%，二者差異顯著(P<0.05)，再次是葡萄糖和果糖，蔗糖效果差。研究表明葡萄糖、果糖及D-半乳糖均能對精子的質(zhì)膜完整率起到較好的保護作用，其中D-半乳糖效果優(yōu)于葡萄糖和果糖；蔗糖效果差。

擁有完整的頂體才能發(fā)生頂體反應，這是受精成功的關(guān)鍵。如果精子的頂體落破損或缺失，頂體酶類丟失，受精過程就不能進行[18]。因此，頂體完整率是評價精液品質(zhì)一項重要指標。本研究顯示葡萄糖、果糖和D-半乳糖都能提高精子頂體完整率。72 h時，精子頂體完整率均大于60%，其中混合糖組最高，但與葡萄糖、果糖和D-半乳糖組相比無顯著性差異(P>0.05)。說明葡萄糖、果糖和D-半乳糖在保護頂體完整過程中差別不大。

精子存活時間和存活指數(shù)檢查與受精率密切相關(guān)，同時也是鑒定稀釋液和精液處理效果的一種方法[19-20]。精子存活時間是指精子在體外的總生存時間，而精子生存指數(shù)是指平均存活時間，表示精子活率下降速度。精子存活時間越長，指數(shù)越大，說明精子生活率越強，品質(zhì)越好[21]。本研究顯示精子的有效存活時間葡萄糖、果糖和D-半乳糖和混合糖組較高，達到48 h以上，其中混合糖組最高達到57.7 h，與葡萄糖、果糖和D-半乳糖組相比差異顯著(P<0.05)；生存指數(shù)只有混合糖組達到60.0以上。

本研究中，有糖類添加的稀釋保存液組精子各項指標都顯著高于對照組，且差異極顯著(P<0.01)，不同糖類對精子的作用存在一定的差別。D-半乳糖除在質(zhì)膜完整率上較葡萄糖、果糖好外，其他指標三者差異不顯著(P>0.05)；蔗糖效果較差，有的研究認為添加蔗糖的精液稀釋液保存效果好，可能因為不同糖類對同一種動物精子保護效果不同，同一種糖對不同種動物精子冷凍保護效果也存在差別；對照效果最差。因混合糖中含有蔗糖，且蔗糖組效果較差，因此稀釋液中添加葡萄糖、果糖和D-半乳糖混合效果可能會更好，有待進一步試驗證實。

4結(jié)論

本研究表明，鮮精稀釋保存液中添加葡萄糖、果糖和D-半乳糖的混合糖，有利于維持精液品質(zhì)和延長精子在體外的有效存活時間；其次是添加D-半乳糖的精液稀釋液；添加蔗糖的精液稀釋液效果最差。

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Effect of Sugar Dilutions on Cryopreserved Fresh Semen Quality of Dorper Sheep

MAO Ran1，LI Qing-quan1，SHI Jian-hua1，WANG Min1,2，ZHANG Guang-he2,3，HAN Tian-long1,2,*

(1.ChifengAcademyofAgricultureandAnimalHusbandrySciences,Chifeng,InnerMongolia024031,China.

2.CollegeofVeterinaryMedicine，JilinUniversity,Changchun, 130062,China;

3.ChifengAgriculturalandLivestockProductsQualityandSafetyManagementStation,Chifeng,InnerMongolia024000,China.)

Abstract：To compare the effect of semen dilution supplemented with different sugars (glucose,fructose,galactose and sucrose) on the fresh semen quality of Dorper sheep,semen of three healthy Dorper sheep (3-year-old) were randomly divided into six groups,and added equal amounts of isothermal different sugars to semen dilutions,to detect their sperm motility,membrane integrity, acrosome integrity, survival time and survival index respectively at 0 h,6 h,24 h,30 h,48 h,54 h,72 h and 78 h. The results showed that the the sperm motility,the membrane integrity and the acrosome integrity were highest in semen dilution within mixture sugar; Compared with other groups, the difference is significant(P<0.05);D-galactose membrane integrity was better than glucose group and fructose group, the difference is significant(P<0.05),other indicators were not significant in other indexes (P>0.05), the addition of sucrose was poor,it is significantly different with other groups, the worst results was in the control group,there revealed extremely significant difference with other groups(P<0.01);Effective survival time and survival index of mixture sugar group was the highest. The results suggest that adding glucose, fructose and galactose mixture sugar to semen dilution works better in preserving the fresh semen of Dorper sheep.

Key words：Dorper sheep；semen extender；sugar；fresh semen；quality

[文章編號]1005-5228(2015)12-0024-05

[中圖分類號]S811.5

[文獻標識碼]A

*[通訊作者]韓天龍(1983-)，男，內(nèi)蒙古赤峰人，在讀博士，副研究員，主要從事臨床獸醫(yī)學與動物營養(yǎng)學研究。E-mail：hantian212@sina.com

[作者簡介]毛冉(1985-)，女，內(nèi)蒙古赤峰人，碩士，助理研究員，主要從事臨床獸醫(yī)學研究。E-mail：maorank1@163.com

[基金項目]赤峰市農(nóng)牧科學研究院自選項目(NkZZ201405)

*[收稿日期]2015-04-30修回日期：2015-05-11