佘一凡，武　青，張春雷，房興堂，何丹丹，陳　宏(江蘇師范大學 細胞與分子生物學研究所 生命科學學院，江蘇 徐州 221116)

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科學研究

中國黃牛mtDNA 16S rRNA基因遺傳多樣性與系統(tǒng)進化分析

佘一凡，武青，張春雷，房興堂，何丹丹，陳宏*(江蘇師范大學 細胞與分子生物學研究所 生命科學學院，江蘇 徐州 221116)

[摘要]采用 PCR和 DNA 測序技術(shù)和生物信息學方法，測定分析了10個中國黃牛品種(群體)和2個外來牛品種共131個體的mtDNA 16S rRNA基因全序列的遺傳變異，并分析了品種(群體)間的親緣關(guān)系以及母系起源。結(jié)果表明，在12個群體131條16S rRNA基因序列中，共發(fā)現(xiàn)了78個變異位點，形成了40種單倍型，揭示了中國黃牛群體具有豐富的遺傳多樣性。總?cè)后w的平均單倍型多樣性指數(shù)(Hd)為0.857±0.024，平均核苷酸多樣性指數(shù)(Pi)為0.00582，Kimura雙參數(shù)品種間遺傳距離范圍為0.001～0.009，10個中國黃牛品種(群體)核苷酸多樣度高于2個外來牛品種?；贙imura-2-parameter距離采用NJ法構(gòu)建了10個中國黃牛品種(群體)分子系統(tǒng)樹，111個體聚為2簇，即分別與瘤牛和普通牛聚在一起，說明中國黃牛存在兩個母系起源，主要起源于瘤牛和普通牛。其中草原紅牛和蒙古牛起源于普通牛，恩施牛主要起源于瘤牛，但是對于親緣關(guān)系復雜的中原地區(qū)黃牛而言，瘤牛和普通牛對它們的影響力大小因品種而異。這些結(jié)果為我國黃牛的種質(zhì)資源保護、雜交育種和品種改良奠定了分子遺傳學基礎(chǔ)。

[關(guān)鍵詞]中國黃牛；mtDNA 16S rRNA；遺傳多樣性

我國地方黃牛種質(zhì)資源十分豐富，但是近年來由于對地方良種的品種特性認識不夠以及受外來肉用和乳用性能高的品種的雜交沖擊等原因[1]，我國地方良種黃牛品種資源數(shù)量和質(zhì)量都有不同程度的下降，保種工作面臨著巨大的挑戰(zhàn)。種質(zhì)資源的保存和利用的原動力則是品種間和品種內(nèi)的遺傳變異，即基因的多樣性和多態(tài)性，只有充分了解我國地方黃牛種間和種內(nèi)的親緣關(guān)系、起源進化和遺傳多樣性才能對其進行更好的保護和利用[2]。

線粒體 DNA 在哺乳動物作為唯一的核外遺傳物質(zhì)具有結(jié)構(gòu)簡單、重組率小、進化速度快、母系遺傳等特點[3]，目前成為研究動物母系起源進化、系統(tǒng)發(fā)育、親緣關(guān)系、基因流動的重要標記[4]，且大多集中在變異率大的mtDNA D-loop區(qū)[5-6]和 Cyt b[7-8]基因，以此揭示了動物的起源進化和品種間的親緣關(guān)系。Khan和吳夏等的研究表明，線粒體DNA 16S rRNA基因在生物中普遍存在，其功能相同，可變序列與進化距離相一致，可以準確反映生物之間的進化關(guān)系，是一個理想的遺傳標記，被譽為“分子鐘”[9]。16S rRNA基因現(xiàn)已廣泛用于魚類和昆蟲類的親緣關(guān)系和系統(tǒng)進化研究[10-13]。但關(guān)于中國黃牛mtDNA 16S rRNA基因多態(tài)性及其對中國黃牛系統(tǒng)進化的研究尚未見報道。因此，本研究通過對12個中外黃牛群體mtDNA 16S rRNA基因序列的比對，揭示了中國黃牛的遺傳多樣性及其類群間的親緣關(guān)系，為我國黃牛起源進化、種質(zhì)資源保護、雜交育種和品種改良選育提供科學依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗動物和血樣的采集

本研究所采集的是12個黃牛品種(群體)的131不同個體，其中中國黃牛有10個品種(群體)，包括6個地方黃牛品種秦川牛、南陽牛、郟縣紅牛、恩施牛、早勝牛、蒙古牛和3個培育品種夏南牛(法國夏洛萊牛X南陽牛)、中國荷斯坦牛(荷蘭荷斯坦牛X中國黃牛)和草原紅牛，1個正在培育的徳南牛(德國黃牛X南陽牛)，2個外來牛品種是安格斯牛和日本和牛；采集方法是進行頸靜脈采血，每頭牛采集10 mL血樣，常溫運輸帶回實驗室，并置于-20 ℃冷凍冰箱保存。12個牛品種(群體)樣本數(shù)以及品種英文名稱簡寫見表 1。

表1　12個黃牛類群mtDNA 16S rRNA序列多態(tài)性位點

1.2基因組的DNA提取及檢測

采用常規(guī)酚-氯仿法進行牛血樣全基因組DNA的提取，用1%的瓊脂糖凝膠電泳以及Nanodrop 2000雙重檢測提取DNA的濃度和純度，并將產(chǎn)物置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3mtDNA 16S rRNA基因引物設(shè)計

在GenBank中查找普通牛完整線粒體基因組序列(AY526085)，根據(jù)基因的核苷酸序列設(shè)計一對引物。16S rRNA-F: GCATCCAGTTTACACCTAGA，16S rRNA-R:GCTCTGCCACCTTAACTA。擴增片段的長度約為1 729 bp。

1.4mtDNA 16S rRNA基因擴增與測序

PCR反應體系總體積為30 μL，含1.2 μL (50 ng/μL)的基因組DNA 作為模板，15 μL 2×Reaction Mix，11.16 μL ddH2O，1.2 μL (10 pmol/μL)16S rRNA-F，1.2 μL (10 pmol/μL)16S rRNA-R，0.24 μL(2.5 U/μL) Golden DNA 聚合酶。PCR反應程序94 ℃預變性3 min，9 4 ℃變性45 s，57 ℃退火1 min，72 ℃延伸90 s，共35個循環(huán)，72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后送至上海生工生物工程公司進行正、反雙向測序。

1.5數(shù)據(jù)處理

首先根據(jù)測序峰圖用DNAMAN 7.0對序列進行拼接編輯。利用ClusalX 2.0軟件進行序列轉(zhuǎn)換比對，并輔以人工校對。其次使用Mega 5.0計算mtDNA 16S rRNA基因序列堿基組成、變異位點以及堿基轉(zhuǎn)換、顛換值；基于Kimura-2-Parameter模型計算類群間的遺傳距離，采用NJ法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，且系統(tǒng)發(fā)育樹各分支的置信度( bootstrap) 均進行1000次重復檢驗。接著運用Dnasp 5.0分析黃牛12個類群的單倍型多樣性Hd、核苷酸多樣性Pi，并進行Tajima' s D中性檢驗。采用NETWORK 4.6.1.3 軟件繪制單倍型間的進化網(wǎng)絡圖[14]。

2結(jié)果與分析

2.1黃牛類群mtDNA 16S rRNA基因的核苷酸組成

通過整理去除測序結(jié)果的兩端多余序列，得到12個黃牛類群mtDNA 16S rRNA基因全序列，長度為1 570 bp，堿基排列相對保守，胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)、腺嘌呤(A)、鳥嘌呤(G)四種核苷酸的平均比例分別是23.7%(23.5%～23.9%)、20.9%(20.6%～21.0%)、37.8%(37.4%～38.0%)、17.6%(17.5%～18.0%)，A+T平均含量為61.6%(60.9%～61.9%)顯著高于C+G平均含量38.4%(38.1%～39.0%)。核苷酸組成表現(xiàn)出明顯的堿基偏倚性。核苷酸組成上中國地方黃牛與雜交培育品種、外國牛品種沒有明顯差異。

2.2黃牛類群mtDNA 16S rRNA基因的核苷酸多樣性

在131個個體中共發(fā)現(xiàn)78個突變位點，約占全長的4.94%，其中單一多態(tài)位點38個，簡約信息位點40個(見表1)，其中能穩(wěn)定區(qū)分與標準序列不同的位點有13個。從12個黃牛類群內(nèi)分析，荷斯坦牛多態(tài)位點最多為37個，其中有10個單態(tài)變異位點，荷斯坦牛較其他類群多態(tài)性更為豐富。10個國內(nèi)品種變異位點高于2個外來品種。序列變異中存在轉(zhuǎn)換、顛換兩種核苷酸變異類型，未發(fā)現(xiàn)堿基的缺失或插入。在所有的核苷酸突變中，轉(zhuǎn)換的發(fā)生頻率占62.3%，顛換的發(fā)生頻率僅占37.8%。其中腺嘌呤(A)與鳥嘌呤(G)之間的轉(zhuǎn)換占總轉(zhuǎn)換數(shù)的37.4%，胞嘧啶(C)與胸腺嘧啶(T)之間的轉(zhuǎn)換占24.9%，總體轉(zhuǎn)換/顛換偏倚R值為1.65。據(jù)研究發(fā)現(xiàn)，通常親緣關(guān)系較近的分類階元之間核苷酸替換主要為轉(zhuǎn)換，而在親緣關(guān)系較遠的分類階元之間，核苷酸替換率則以顛換為主[15-16]。本研究發(fā)現(xiàn)黃牛mtDNA 16S rRNA基因核苷酸突變位點的變異類型以轉(zhuǎn)換為主，驗證了上述規(guī)律。

2.312個黃牛類群基于mtDNA 16S rRNA基因的單倍型系統(tǒng)進化分析

從已獲得的131條16S rRNA基因全長序列中定義了40種單倍型：Hap1～Hap40(見表2)。其中單倍型頻率較多的是Hap4和Hap2，Hap4在所有種群中出現(xiàn)38次，占所有種群的29.4%；Hap2次之，占23.3%。圖1是基于mtDNA 16S rRNA基因40種單倍型聚類網(wǎng)絡圖，從圖1可以看出12個黃牛類群40種單倍型被劃分為兩個聚類簇，表明本研究中黃牛存在兩個母系起源，其中Hap4和Hap2在網(wǎng)絡的中心位置，群體中出現(xiàn)頻率最高，Hap6、Hap22、Hap28單倍型頻率高于其他單倍型。圖1中Hap23偏離中心位置，表明該單倍型較為特殊。

表2　12個類群黃牛mtDNA 16S rRNA基因的單倍型分布

圖1　不同黃牛類群16S rRNA單倍型聚類網(wǎng)絡圖

2.4中國黃牛mtDNA 16S rRNA基因的遺傳多樣性分析

12個黃牛類群mtDNA 16S rRNA基因單倍型、核苷酸多樣性分析及Tajima's D中性檢驗結(jié)果如表3所示。由表3可知，12個類群的總體平均單倍型多樣性指數(shù)Hd為0.857±0.024，平均核苷酸多樣性指數(shù)Pi為0.00582。單倍型的多樣性變化范圍在0.786～0.977之間，種群內(nèi)核苷酸多樣性變化范圍在0.00367～0.01024之間，其中荷斯坦牛核苷酸多樣性最高且單倍型多樣性較高，日本和牛核苷酸多樣性最低且單倍型多樣性最低，說明其遺傳變異最小，即該品種的遺傳一致性最高。10個中國黃牛品種(群體)核苷酸多樣度高于2個外來牛品種(除恩施牛和草原紅牛)，這說明中國黃牛品種的遺傳變異較大，具有豐富的遺傳多樣性。

對黃牛12個類群mtDNA 16S rRNA基因全序列基于Tajima's D值進行中性檢驗(表3)，檢測結(jié)果總?cè)后wD值為-1.41198，差異不顯著(P>0.10)，說明本研究黃牛類群在進化過程基本遵循中性進化模型，群體大小保持相對穩(wěn)定。

2.5中國黃牛類群間的遺傳距離及其起源進化分析

遺傳距離最早是用來估計不同群體之間遺傳分化程度的指標[17]，中國黃牛12個類群間Kimura-2-Parameter遺傳距離范圍為0.001～0.010，由表4可以看出，草原紅牛與日本和牛遺傳距離最小為0.001，并且分別與恩施牛、徳南牛遺傳距離最大。

由圖2可以看出，早勝牛和蒙古牛首先聚在一起，然后與草原紅牛、日本和牛聚為一類，再與荷斯坦牛和秦川牛聚在一起，最后與郟縣牛和安格斯牛聚成一個大類；另外一大類是由親緣關(guān)系相對較遠的恩施牛與徳南牛、夏南牛與南陽牛聚成。

表4　黃牛12個類群16S rRNA序列遺傳距離

Note:The figures in the table are expanded 100 times

圖2　12個黃牛品種的UPGMA聚類圖

3討論

3.1中國黃牛類群的遺傳多樣性

從試驗結(jié)果得到中國黃牛16S rRNA基因序列A+T平均含量為61.6%顯著高于C+G平均含量38.4%，核苷酸組成表現(xiàn)出明顯的A、T堿基偏倚性。在黃牛的線粒體基因組中，張桂香等[18]測得黃牛D-loop區(qū)，A+T平均含量為61.7%。蔡欣等[20]測得Cyt b基因序列富含堿基A和T，A+T平均含量為56.2%。綜上，16S rRNA和D-loop區(qū)為非蛋白編碼序列，A+T含量大于Cyt b基因蛋白質(zhì)編碼序列，表明非編碼序列比編碼序列具有更高的A、T堿基偏倚性。研究認為牛亞科線粒體基因的堿基偏倚性及其密碼子的使用情況和線粒體基因序列一樣，均可以用于物種的親緣關(guān)系研究[19]。本研究中共發(fā)現(xiàn)了78個突變位點，約占全長的4.94%。彭華[6]研究發(fā)現(xiàn)D-loop區(qū)突變率為11%，ND5 基因約為2%，因此D-loop和16S rRNA基因是用來分析品種間系統(tǒng)發(fā)育最有效的工具。

通常認為，群體中的單倍型多樣性(Hd)和核苷酸多樣性(Pi)是衡量一個群體線粒體DNA變異程度的兩個重要指標，其值與群體遺傳多樣性呈正相關(guān)。本研究平均單倍型多樣性和核苷酸多樣性指數(shù)低于Cyt b基因研究結(jié)果[20](Hd=0.783±0.046 Pi=0.0828)，同時也低于王朝峰[21]所測中國黃牛mtDNA D-loop。證明中國黃牛mtDNA 16S rRNA基因序列進化穩(wěn)定，同時也具有豐富的遺傳多樣性。對比武志娟[22]研究西藏牦牛類群16S rRNA基因序列發(fā)現(xiàn)，中國黃牛核苷酸多樣性和單倍型多樣性高于西藏牦牛(Hd=0.850±0.0009 Pi=0.0291 )，這與中國黃牛地理分布廣、種群龐大和起源復雜有著密切的關(guān)系。

中國黃牛在16S rRNA基因總體上較外來牛種相比具有相對豐富的多態(tài)性，而且各個品種內(nèi)也顯示出豐富程度不同的核苷酸多樣性。12個黃牛品種兩兩之間表現(xiàn)出的遺傳距離可能與不同品種的地理分布具有一定的關(guān)系，草原紅牛、荷斯坦牛和日本和牛分別與恩施牛、德南牛品種間的遺傳距離較大而他們彼此間的距離相對較低，這種差異可能是由地理隔離導致北方黃牛和南方黃牛之間不易發(fā)生基因交流從而具有一定的群體遺傳分化，此觀點與常洪等[23]的研究結(jié)果基本吻合。

3.2中國黃牛mtDNA 16S rRNA基因系統(tǒng)進化關(guān)系

中國黃牛的起源進化一直是中外學者最感興趣的研究課題之一，但中國黃牛起源復雜。邱懷等[24]將同種異名的黃牛歸并后，確定我國尚有28個地方固有黃牛品種；同時把中國黃牛按地理分布區(qū)域，分為北方黃牛、中原黃牛和南方黃牛三大類。陳宏等[25]通過對黃牛Y染色體多態(tài)性進行分析，發(fā)現(xiàn)北方黃牛受普通牛的影響大,南方黃牛受瘤牛的影響大，中原黃牛同時受普通牛和瘤牛的影響。本研究以mtDNA 16S rRNA為標記，選擇我國10個黃牛品種進行系統(tǒng)進化分析，定義了40種單倍型，構(gòu)成2個主要單倍型組并從單倍型網(wǎng)絡關(guān)系圖上看出分為2個聚類簇，說明中國黃牛存在2個母系來源。根據(jù)遺傳距離構(gòu)建了NJ系統(tǒng)進化樹，表明草原紅牛和蒙古牛起源于普通牛屬于北方牛種，恩施牛和徳南牛主要起源于瘤牛，原因是由于分布于長江以南地區(qū)，地理位置較為接近，遺傳距離近，瘤牛的特征非常明顯，屬于南方牛種。其他牛種同時含有普通牛和瘤牛血統(tǒng)，但是不同品種受普通牛和瘤牛的影響程度有所差別。其中南陽牛和夏南牛受瘤牛影響較大，荷斯坦牛和早勝牛主要受普通牛影響較大。這與彭華[6]基于D-loop區(qū)分析我國地方黃牛品種間的相互關(guān)系及其起源進化結(jié)果一致。秦川牛、郟縣牛、屬于中原牛種，受普通牛和瘤牛的影響均等。這在分子水平上印證了陳宏等[25]的結(jié)果。并與陳幼春從頭顱骨分類、毛色、血液蛋白多態(tài)性、體型體態(tài)研究中國黃牛起源結(jié)果一致。

本研究利用mtDNA 16S rRNA基因?qū)ξ覈?0個黃牛品種進行序列分析，揭示了中國黃牛具有豐富的遺傳多樣性據(jù)此可以制定種質(zhì)資源保護計劃和方案；同時通過黃牛品種間親緣關(guān)系的遠近還可以預測不同品種在雜交改良中的利用效果；只有在對地方品種進行保護的基礎(chǔ)上采取適當?shù)碾s交改良，才能使現(xiàn)存的優(yōu)良資源得到可持續(xù)發(fā)展。

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Genetic Diversity and Phylogenetic Analysis of mtDNA 16S rRNA

Gene of Chinese Yellow Cattle Breeds

SHE Yi-Fan, WU Qing , ZHANG Chun-Lei, FANG Xing-Tang, HE Dan-dan, CHEN Hong*

(InstituteofCellularandMolecularBiology,SchoolofLifeScience,JiangsuNormalUniversity,XuzhouJiangsu,221116,China)

Abstract:Through PCR and DNA sequencing and bioinformatics methods, genetic variation of the full sequence of the mtDNA 16S rRNA gene, the genetic relationships and maternal origins were studied on the research of 131 samples, including ten breeds of Chinese cattle and two foreign breeds. Among the 131 genetic sequences of these twelve breeds, 78 variable sites were detected and they formed 40 kinds of haplotypes, which indicates the genetic diversity of Chinese cattle. Among the breeds, the average haplotype diversity index was 0.857±0.024. The average nucleotide diversity index was 0.00582 and the genetic distance between Kimura two-parameter breeds was 0.001～0.009.The nucleotide diversity of the ten breeds of Chinese cattle is higher than the two foreign breeds. The neighbor-joining phylogenetic tree of the Chinese yellow cattle based on the Kimura-2-parameter distance indicated that the 111 individuals were grouped into two clades, which suggests that the Chinese cattle have two maternal origins, mainly from Bos taurus and Bos indicus. The Grassland red cattle and the Mongolia beef originate from Bos taurus and Enshi cattle mainly originates from Bos indicus. These results lay the foundation of molecular genetics for Chinese yellow cattle's development, utilization of hybrid vigor and cultivation of new beef cattle.

Key words:Chinese yellow cattle breeds; 16S rRNA; genetic diversity

[文章編號]1005-5228(2015)12-0012-07

[中圖分類號]S811.5

[文獻標識碼]A

*[通訊作者]陳宏(1955-)，男，陜西西安人，教授，博士生導師。研究方向：分子遺傳學與家畜育種。E-mail：chenhong1212@263.net

[作者簡介]佘一凡(1991-)，女，江蘇南通人，碩士研究生，研究方向：動物分子生態(tài)與系統(tǒng)進化。E-mail：892281967@qq.com

[基金項目]現(xiàn)代農(nóng)業(yè)(肉牛)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專項(cars-38)；陜西省科技統(tǒng)籌創(chuàng)新工程計劃項目(2014kTZB02-02-02-02，2015kTcL02-08)；國家發(fā)改委生物育種能力建設(shè)與產(chǎn)業(yè)化專項(2014-2573)。

*[收稿日期]2015-10-07修回日期：2015-11-13