張小苗，張　恒，楊玉艾，張　志，孫　健，陶曉珊，李曉成，范根成＊，孫永科＊（.云南農業(yè)大學動物科學技術學院，云南昆明6500；.青島易邦生物工程有限公司山東省動物疫苗重點實驗室，山東青島664；.中國動物衛(wèi)生與流行病學中心，山東青島660）

表達豬瘟病毒E0-E2基因重組腺病毒疫苗在兔體上的免疫原性分析

張小苗1，2△，張恒2△，楊玉艾1，張志3，孫健2，陶曉珊2，李曉成3，范根成2＊，孫永科1＊
（1.云南農業(yè)大學動物科學技術學院，云南昆明650201；2.青島易邦生物工程有限公司
山東省動物疫苗重點實驗室，山東青島266114；3.中國動物衛(wèi)生與流行病學中心，山東青島266032）

摘 要：研究表達豬瘟病毒E0-E2基因重組腺病毒疫苗（rAd-E0-E2）在兔體上的免疫原性，并確定其最小免疫保護劑量。將rAd-E0-E2按10倍梯度稀釋為107.0IFU、106.0IFU、105.0IFU，分別免疫接種家兔，14 d后，用豬瘟脾淋苗對各組兔子進行攻毒。結果107.0IFU組和豬瘟脾淋苗組均未出現(xiàn)定型熱反應（0/4），脾重/體重指數(shù)比值分別為0.055%、0.05%，脾組織切片均未見充血、淤血，用RT-PCR和IFA方法均未檢測到脾臟內有豬瘟脾淋苗病毒；106.0IFU組3/4出現(xiàn)定型熱反應，脾重/體重指數(shù)比值為0.074%，脾組織切片3/4可見充血、淤血，用RT-PCR和IFA方法可檢測到3/4脾臟有豬瘟脾淋苗病毒；105.0IFU組和對照組全部出現(xiàn)定型熱反應（4/4），脾重/體重指數(shù)比值分別為0.099%和0.102%，脾組織切片充血、淤血嚴重，用RT-PCR和IFA方法均可檢測到兔子脾臟內有豬瘟脾淋苗病毒。結果表明與對照組均不保護和豬瘟脾淋苗組全部保護相比，rAd-E0-E2在兔體的最小免疫保護劑量為107.0IFU，本研究成功完成了rAd-E0-E2在兔體上的免疫原性分析。

關鍵詞：豬瘟病毒；E0-E2基因；重組腺病毒疫苗；兔；免疫原性

豬瘟（Classical swine fever，CSF）是由黃病毒科瘟病毒屬的豬瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）引起的一種豬的高度接觸性傳染病，病死率極高，給世界養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經濟損失。我國面對這樣的烈性傳染病采用疫苗接種來預防其發(fā)生，降低發(fā)病率和死亡率。豬瘟疫苗的發(fā)展經歷了早期的滅活疫苗、弱毒疫苗、基因工程疫苗。目前廣泛使用的是弱毒疫苗，我國批準使用的弱毒疫苗是由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所研制的豬瘟兔化弱毒疫苗［1］。長期以來，豬瘟兔化弱毒疫苗的普遍使用，使CSFV野毒株及兔化弱毒抗原發(fā)生了變異，出現(xiàn)了慢性感染、隱性感染等非典型流行形式，很難區(qū)分豬群中的疫苗免疫豬和野毒感染豬，致使疫情難以控制，或造成免疫失敗，這不但影響豬群中豬瘟的凈化，而且給豬肉出口造成障礙［2-3］。為此，研制更安全、更高效可以進行鑒別診斷的新型基因工程標記疫苗是全世界養(yǎng)豬業(yè)的迫切要求。本實驗室從pMD18-T-E0質粒、pMD18-T-E2質粒中擴增編碼E0、E2基因，構建重組腺病毒穿梭質粒pAd Track-E0、pAd Track-E2。通過PET32a載體將E0和E2基因串聯(lián)，形成PET-E0-E2，然后再將E0-E2克隆到腺病毒穿梭載體上得到重組腺病毒穿梭質粒pAd Track-E0-E2，轉化到大腸埃希菌BJ5183感受態(tài)細胞中，得到重組腺病毒骨架載體pAd Easy-E0-E2，轉染人胚胎腎細胞（HEK 293），獲得了含有目的基因的重組腺病毒（rAd-E0-E2）［4-7］。通過對家兔接種10倍梯度稀釋的rAd-E0-E2，14d后用豬瘟脾淋苗攻毒，每隔6h測兔體溫，通過體溫的變化、脾重/體重指數(shù)比（%）、脾臟組織病理學變化、RT-PCR和IFA方法對豬瘟脾淋毒攻毒兔進行檢測和分離鑒定等技術共同判斷說明rAd-E0-E2在兔體的免疫保護效力以及最小免疫保護劑量。分析表達豬瘟病毒E0-E2基因重組腺病毒疫苗（rAd-E0-E2）在兔體的免疫原性，確定出最小免疫保護劑量［8］。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1試驗用病毒、疫苗、細胞、實驗動物 豬瘟重組腺病毒疫苗（rAd-E0-E2），≥2×107.0IFU/mL［9］，

其毒價測定采用IFA方法［10-11］得到，由青島易邦生物工程有限公司技術中心（山東省動物疫苗重點實驗室）凍干保存，作為試驗樣品稀釋接種家兔；豬瘟活疫苗（兔源）簡稱豬瘟脾淋苗，批號201401，20頭份/mL，由青島易邦生物工程有限公司凍干苗車間生產，用于作為本試驗的陽性對照；ST細胞，由本實驗室液氮罐保存；1.5kg～3kg健康易感SPF家兔購自青島康大兔業(yè)發(fā)展有限公司。

1.1.2主要試劑及儀器 雙抗、1×PBS、80%冷丙酮、500 mL/L甘油，柱式動物RNAout提取試劑盒，北京天恩澤公司產品；兩步法RT-PCR試劑盒、Taq PCR Master Mix，TaRaKa公司產品；體溫計，上海鹿得醫(yī)療器械貿易有限公司產品；玻璃研磨均漿器，涿州市琦瑞玻璃制品廠產品；電子天平（JA1103型），上海民橋精密科學儀器有限公司產品；核酸電泳儀（YYD-8C型），北京六一儀器廠產品；PCR儀（Applied Biosystems），愛普拜斯應用生物系統(tǒng)貿易（上海）有限公司產品；BIO-RAD Gel Doc XR+凝膠成像系統(tǒng)，美國伯樂產品；CO2培養(yǎng)箱（RCO3000T-5-VBC），REVCO產品；熒光顯微鏡，Olympus公司產品。

1.2方法

1.2.1免疫前后體溫測定 購回兔子的第3天開始上下午各測體溫1次，連續(xù)測3d，從28只兔子中挑選體溫波動不大（±0.5℃）的20只，隨機分成5組，每組4只，1、2、3組按照107.0、106.0、105.0IFU/只劑量肌肉注射rAd-E0-E2疫苗；4組肌肉注射每頭份150倍稀釋的豬瘟脾淋苗；5組為生理鹽水對照。同時上、下午各測體溫1次，連續(xù)測3d。

1.2.2攻毒前后體溫測定 免疫后第14d攻毒，用無菌生理鹽水將每頭份豬瘟脾淋苗稀釋150倍，通過耳靜脈注射給每組家兔，攻毒劑量為1mL/只，攻毒前2d和攻毒當天上、下午各測體溫1次，攻毒24h后，每隔6h測體溫1次，連續(xù)測3d至體溫恢復正常。

1.2.3攻毒后脾重/體重指數(shù) 將攻毒后體溫恢復正常的家兔稱重、解剖取脾臟稱重，計算脾重/體重指數(shù)比（%），通過圖表說明rAd-E0-E2受保護組與未受保護組的差異情況，同時做脾臟切片，觀察脾臟的病理變化。

1.2.4RT-PCR檢測脾臟中豬瘟脾淋毒 取各組家兔脾臟用勻漿器充分研磨，按柱式動物RNAout提取試劑盒提取RNA，以豬瘟脾淋苗特異性引物進行RT-PCR檢測脾臟中的豬瘟脾淋疫苗毒，進一步證明rAd-E0-E2的保護效力［12-14］。

1.2.5IFA分離鑒定脾臟中豬瘟脾淋毒 取各組家兔脾臟加PBS（含雙抗）低溫下充分研磨，組織懸液離心后經0.22μm濾器過濾。同時，將豬睪丸細胞系（ST細胞）鋪平于6孔板中，當細胞長到80%單層時，接種過濾的懸液，盲傳3代。將ST細胞用冷丙酮2℃～8℃固定30min，1×PBS洗滌3次，將1∶300稀釋的豬瘟病毒特異性抗體加到固定好的ST細胞上，37℃孵育1h，1×PBS洗滌3次，再加1∶500稀釋的FITC標記的兔抗豬IgG，37℃孵育1h，1×PBS洗滌3次，6孔板中每個孔加適量500 mL/L甘油，在熒光顯微鏡下觀察試驗結果［15］。

2　結果

2.1免疫前、免疫后實際測溫結果

按照1.1的方法進行實際測溫，將結果繪制時間-體溫曲線（圖1），從圖1中可以看出，免疫前各組家兔體溫波動不大；用rAd-E0-E2（107.0、106.0、105.0IFU）免疫組家兔體溫在正常范圍內，用豬瘟脾淋苗免疫組家兔出現(xiàn)兔體反應熱（≥40.5℃）與常規(guī)豬瘟脾淋苗檢測結果一致［16］。

圖1　免疫前后實際測溫Fig.1 Actual temperature detected before and after immunization

2.2rAd-E0-E2對免疫兔的保護作用

免疫14d后，各組兔子用豬瘟脾淋苗攻毒，將實際測溫情況繪制時間-體溫曲線（圖2），從圖2中可以看出，攻毒前2d各組免疫兔體溫在正常波動范圍內（＜40.5℃），攻毒后107.0IFU組（0/4）和豬瘟脾淋苗組（0/4）均未出現(xiàn)定型熱反應，106.0IFU組（3/4）出現(xiàn)定型熱反應，105.0IFU（4/4）出現(xiàn)定型熱反應，對照組（4/4）出現(xiàn)定型熱反應［17-18］。

圖2　用豬瘟脾淋毒攻毒后免疫兔產生的定型熱反應Fig.2 Fever reactions of the immunized rabbits following challenge with CSF spleen virus

2.3攻毒后脾重/體重指數(shù)

經脾重/體重指數(shù)比分析發(fā)現(xiàn)（圖3），107.0IFU組與105.0IFU組、107.0IFU組與對照組差異顯著（P＜0.05）；豬瘟脾淋苗組與105.0IFU組、豬瘟脾淋苗組與對照組異顯著（P＜0.05）；然而，107.0IFU組與106.0IFU組、107.0IFU組與豬瘟脾淋苗組、106.0IFU組與105.0IFU組、106.0IFU組與豬瘟脾淋苗組、106.0IFU組與對照組、105.0IFU組與對照組差異不顯著（P＞0.05）。

圖3　脾重/體重指數(shù)比Fig.3 Percentage of spleen weight/body weight

2.4脾臟病理組織學觀察

將攻毒后體溫趨于正常的兔子剖檢，取脾臟做石蠟切片，顯微鏡下觀看脾臟病理組織變化（圖4）。107.0IFU組（圖4A）攻毒后脾組織切片未見充血、淤血；106.0IFU組（圖4B）攻毒后脾組織切片未見充血、淤血，而106.0IFU組（圖4C）攻毒后脾組織切片充血、淤血嚴重；105.0IFU組（圖4D）攻毒后脾組織切片充血、淤血嚴重；豬瘟脾淋苗組（圖4E）攻毒后脾組織切片未見充血、淤血；對照組（圖4F）攻毒后脾組織切片充血、淤血嚴重。

2.5RT-PCR檢測攻毒后免疫兔脾臟內豬瘟脾淋毒病毒

以豬瘟脾淋苗特異性引物為模板進行RT-PCR擴增，經瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果表明，107.0IFU組（0/4）和豬瘟脾淋苗組（0/4）攻毒后均未檢測到豬瘟脾淋苗病毒，對照組（4/4）均檢測到豬瘟脾淋苗病毒；106.0IFU組（3/4）能檢測到豬瘟脾淋苗病毒、105.0IFU組（4/4）均檢測到豬瘟脾淋苗病毒（表1）。

圖4　不同組脾臟病理組織學觀察結果（HE，200×）Fig.4 Histopathological observation results of spleen in different groups（HE，200×）

表1　RT-PCR檢測豬瘟脾淋毒病毒Table 1 RT-PCR detection of CSF spleen virus

2.6IFA分離鑒定脾臟中豬瘟脾淋毒

間接免疫熒光（IFA）結果顯示，107.0IFU組（圖5A）和豬瘟脾淋苗組（圖5E）均未出現(xiàn)特異性綠色熒光（0/4）；而對照組（圖5F）均出現(xiàn)特異性綠色熒光（4/4）；106.0IFU組（圖5B）能起保護作用的兔子IFA檢測未出現(xiàn)特異性綠色熒光（1/4），而106.0IFU組（圖5C）沒有能起保護作用的兔子IFA檢測出現(xiàn)特異性綠色熒光（3/4）；105.0IFU組（圖5D）IFA檢測出現(xiàn)特異性綠色熒光（4/4）。

3　討論

本研究是在前期已經構建的表達豬瘟病毒E0-E2基因重組腺病毒疫苗（rAd-E0-E2）的基礎上，以SPF家兔作為實驗動物模型，通過測兔體定型熱反應、脾重/體重指數(shù)比、RT-PCR、IFA、病理組織學變化等免疫學、病理學、分子生物學技術共同評價了rAd-E0-E2在兔上的免疫保護效力。

圖5　不同組脾臟IFA特異性鑒定（200×）Fig.5 Specificity identification of spleens in different groups by indirect IFA（200×）

通過以上方法比較分析發(fā)現(xiàn)，107.0IFU組和豬瘟脾淋苗組均未出現(xiàn)定型熱反應（0/4）；脾組織切片未見充血、淤血；用RT-PCR和IFA方法均未檢測到兔子脾臟內豬瘟脾淋苗病毒，說明rAd-E0-E2 （107.0IFU）在兔體的免疫攻毒保護試驗中起到保護作用（4/4）。106.0IFU組出現(xiàn)定型熱反應（3/4）；相對應的兔脾組織切片可見充血、淤血（3/4）；用RTPCR和IFA方法可檢測到對應兔子脾臟內豬瘟脾淋苗病毒（3/4），說明rAd-E0-E2（106.0IFU）在兔體的免疫攻毒保護試驗中起到保護作用（1/4）。105.0IFU組和對照組全部出現(xiàn)定型熱反應（4/4）；脾組織切片充血、淤血嚴重（4/4）；用RT-PCR和IFA方法均可檢測到兔子脾臟內豬瘟脾淋苗病毒（4/4），說明rAd-E0-E2（105.0IFU）在兔體的免疫攻毒保護試驗中沒有起到保護作用（0/4）。以上結果進一步分析表明，rAd-E0-E2可誘導機體產生豬瘟特異性免疫，此抗體在最小免疫保護劑量是107.0IFU時對豬瘟脾淋苗病毒攻擊具有保護作用。試驗中脾重/體重指數(shù)比、RT-PCR、IFA、病理組織學變化檢測結果與家兔體溫反應結果一致，四種試驗方法檢測結果可以有效地對體溫反應可疑或者輕熱的家兔進行判定，避免了體溫反應結果產生的不確定性。本試驗結果的一致性為四種試驗方法用于rAd-E0-E2在家兔上的免疫原性分析提供有力依據(jù)。

根據(jù)中華人民共和國獸用生物制品規(guī)程（2000版）和中華人民共和國獸藥典（2010年版）規(guī)定，現(xiàn)行的豬瘟疫苗免疫效力檢驗主要依靠家兔或豬進行動物試驗［19-20］。因用豬進行檢驗成本太高、不易操作、耗時長，故在生產實際中多采用兔體定型熱反應，但是兔體定型熱反應仍然存在試驗耗時、操作繁瑣、重復性較差、敏感性較低等缺點，且受試驗動物的個體差異、環(huán)境因素等多方面影響，因此本試驗通過比較rAd-E0-E2家兔體溫反應熱與脾重/體重指數(shù)比、RT-PCR、IFA、病理組織變化檢測結果的相關性，給出了脾重/體重指數(shù)比、RT-PCR、IFA、病理組織學變化等方法用于rAd-E0-E2在家兔上的免疫原性分析的可行性。本研究依然采用家兔進行效檢，同時用以上四種方法進行驗證，避免了傳統(tǒng)方法因家兔質量和環(huán)境等因素對體溫檢測結果的影響，提高了檢測結果的可靠性和可重復性。

本試驗通過表達豬瘟病毒E0-E2基因重組腺病毒疫苗（rAd-E0-E2）在兔體上的免疫原性分析，不僅能夠檢驗rAd-E0-E2的保護效力，還確定出最小免疫保護劑量，有利于rAd-E0-E2效力質量檢測應用，更對后期的大規(guī)模生產培養(yǎng)工藝優(yōu)化具有積極的評價指導作用，具有廣闊的應用前景。

參考文獻：

［1］ Sun S Q，Yin S H，Guo H C，et al.Genetic typing of classical swine fever virus isolates from China［J］.Transb Emerg Dis，2013，60（4）：370-375.

［2］ Leifer I，Everett H，Hoffmann B，et al.Escape of classical swine fever C-strain vaccine virus from detection by C-strain specific real-time RT-PCR caused by apoint mutation in the prime-binding site［J］.J Virol Meth，2010，166（1-2）：98-100.

［3］ Everett HE，Crudgington BS，Sosan-Souule O，et al.Differential detection of classical swine fever virus challenge strains in C-strain vaccinated pigs［J］.BMC Vet Res，2014，10（1）：281.

［4］ 孫永科，楊玉艾，張彥明，等.表達豬瘟病毒石門株E0抗原的重組腺病毒構建及免疫性的研究［J］.畜牧獸醫(yī)學報，2007，38 （5）：482-487.

［5］ 孫永科，楊玉艾，張彥明，等.表達豬瘟病毒石門株E2抗原的重組腺病毒構建及免疫性研究［J］.病毒學報，2007，23（2）：137-141.

［6］ 楊玉艾，初曉輝，孫永科，等.豬瘟病毒E0和E2蛋白融合表達的重組腺病毒構建及免疫保護性研究［J］.中國預防獸醫(yī)學報，2010，32（6）：419-423.

［7］ 孫永科.表達豬瘟病毒石門株E0/E2基因重組腺病毒的構建

及其免疫效果研究［D］.陜西楊凌：西北農林科技大學，2007.

［8］ 李傳龍，張 恒，崔治中，等.ALV-J相關的雞急性纖維肉瘤發(fā)病模型的建立［J］.中國農業(yè)科學，2012，45（3）：548-555.

［9］ Sun Y K，Yang Y A，Zheng H L.Co-expression of Erns and E2 genes of classical swine fever virus by replication-defective recombinant adenovirus completely protects pigs against virulent challenge with classical swine fever virus［J］.Res Vet Sci，2013，94：354-360.

［10］ 張 恒，李傳龍，崔治中，等.禽白血病A亞群病毒gp85的單因子血清制備及其特異性鑒定［J］.微生物學報，2011，51（1）：134-140.

［11］ 張恒，范根成，杜元釗，等.一種豬瘟病毒基因重組腺病毒載體疫苗病毒含量測定方法［P］.中華人民共和國國家知識產權局.CN 104535764A，2015.04.22.

［12］ 蔣 卉，戴志紅，王在時，等.豬瘟兔化弱毒疫苗效力檢驗替代方法研究Ⅰ家兔效力檢驗ELISA方法初探［J］.中國獸醫(yī)雜志，2013，49（5）：9-12.

［13］ 祖立闖，謝金文，沈志強，等.豬瘟疫苗質量的替代檢驗方法研究進展［J］.動物醫(yī)學進展，2015，36（2）：76-79.

［14］ 陳 鍇，姚華偉，王長江，等.熒光定量PCR作為豬瘟兔化弱毒疫苗效價檢驗替代方法的研究與應用［J］.中國農業(yè)科學，2013，46（1）：162-169.

［15］ 李春紅，唐滿華，陳瑞愛.豬瘟兔化弱毒疫苗效檢替代方法研究進展［J］.當代畜牧，2014（12）：34-38.

［16］ 何 雷，張彥明，徐彥召，等.共表達豬瘟病毒E2基因和豬白細胞介素2基因的重組腺病毒的構建及其免疫原性研究［J］.病毒學報，2010，26（5）：385-391.

［17］ 何 雷，張彥明，向 華，等.表達豬白介素2基因重組腺病毒的構建及其免疫增強作用［J］.西北農業(yè)學報，2010，19（11）：1-7.

［18］ 孫 元，祁巧芬，仇華吉，等.表達豬瘟病毒E2蛋白的重組腺病毒的構建及其在兔體內的免疫原性分析［J］.生物工程學報，2008，24（10）：1734-1739.

［19］ 農業(yè)部第四屆獸用生物制品規(guī)程委員會.中華人民共和國獸用生物制品規(guī)程［M］.北京：化學工業(yè)出版社，2000.

［20］ 中國獸藥典委員會.中華人民共和國獸藥典［M］.北京：中國農業(yè)出版社，2011.

Immunogenicity Analysis of Recombinant Adenoviruses Expressing E0-E2 Genes of Classical Swine Fever Virus Vaccine in Rabbits

ZHANG Xiao-miao1，2，ZHANG Heng2，YANG Yu-ai1，ZHANG Zhi3，
SUN Jian2，TAO Xiao-shan2，LI Xiao-cheng3，F(xiàn)AN Gen-cheng2，SUN Yong-ke1
（1.College of Animal Science and Technology，Yunnan Agricultural University，Kunming，Yunnan，650201，China；
2.Key Laboratory for Animal Vaccine of Shandong Province，YEBIO Bioengineering Co.Ltd of Qingdao，
Qingdao，Shandong，266114，China；3.China Animal Health and Epidemiology Center，Qingdao，Shandong，266032，China）

Abstract：Study on the immunogenicity of recombinant adenoviruses expressing E0-E2genes of classical swine fever virus vaccine（rAd-E0-E2）in rabbits and determination of the minimum vaccination dose were conducted.Ten-fold dilution of rAd-E0-E2into 107.0IFU，106.0IFU，105.0IFU was made.Rabbits were vaccinated by each dilution and challenged with CSF spleen vaccine virus 14dpi.In group 107.0IFU and group CSF spleen vaccine，there were no Stereotypia thermal response（0/4），the mean value of spleen weight/ body weight in both groups were respectively 0.055%，0.05%，the histopathologic examination of the spleens turned out without hyperemia or congestion.There was no CSF spleen vaccine virus detected by RT-PCR and IFA methods；In Group 106.0IFU，3/4rabbits showed Stereotypia thermal response，the mean value of spleen weight/body weight was 0.074%，the histopathologic examination of the spleens showed 3/ 4hyperemia or congestion.3/4CSF spleen vaccine virus is detected by RT-PCR and IFA methods；In Group 105.0IFU and the control group，all appeared Stereotypia thermal response（4/4），the mean values of spleen weight/body weight in both were respectively 0.099%，0.102%，the histopathologic examination of the spleens showed serious hyperemia and congestion，CSF spleen vaccine virus was detected by RT-PCR and IFA methods.Compared to the control group，which offers 0% protection and group CSF spleen vaccine，which offers 100% protection，the minimum vaccination dose of rAd-E0-E2to protect the rabbit is 107.0IFU.This study successfully completed the immunogenicity analysis of rAd-E0-E2and detemined the minimum vaccination dose in rabbits.

Key words：Classical swine fever virus；E0-E2gene；recombinant adenovirus vaccine；rabbit；immunogenicity

作者簡介：張小苗（1989-），女，云南保山人，碩士研究生，主要從事分子病原學與免疫學研究。張 恒（1987-），男，山東新泰人，碩士，獸醫(yī)師，主要從事動物分子病毒學與新型動物疫苗研究?！魍蓉暙I作者。＊通訊作者

基金項目：云南省高校獸醫(yī)公共衛(wèi)生重點實驗室資助（A3007954）

收稿日期：2015-07-09

中圖分類號：S852.651

文獻標識碼：A

文章編號：1007-5038（2015）09-0008-05