李　勇，郭　慧，鐘友寶（江西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，江西南昌330045）

?

人工感染豬圓環(huán)病毒2型仔豬的組織病理學(xué)觀察

李勇，郭慧，鐘友寶
（江西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，江西南昌330045）

摘 要：為探索豬圓環(huán)病毒2型（PCV-2）對(duì)仔豬的致病機(jī)理，采用免疫組化方法和HE染色對(duì)人工感染PCV-2仔豬的呼吸、消化及淋巴系統(tǒng)主要器官進(jìn)行抗原定位和組織病理觀察。結(jié)果顯示，淋巴器官的組織廣泛分布陽(yáng)性抗原，尤其在淋巴小結(jié)較為密集，組織出現(xiàn)不同程度的棕黃色著色，不均勻分布在胞質(zhì)中。消化與呼吸系統(tǒng)的實(shí)質(zhì)性器官功能性小葉不完整，組織結(jié)構(gòu)紊亂，組織細(xì)胞呈不同程度的胞質(zhì)溶解、胞核固縮及出現(xiàn)包涵體等病理變化。淋巴器官的組織細(xì)胞出現(xiàn)不同程度的裂解與消失，嚴(yán)重病例中大多數(shù)淋巴細(xì)胞成團(tuán)消失，難以發(fā)現(xiàn)較為完整的淋巴小結(jié)，并在細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)球形的包涵體，也具有呈單或團(tuán)狀的類上皮樣組織結(jié)構(gòu)，細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)溶解或消失，僅剩細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，出現(xiàn)胞核固縮，導(dǎo)致組織的空泡化現(xiàn)象。

關(guān)鍵詞：仔豬；豬圓環(huán)病毒2型；組織病理學(xué)

1974年德國(guó)Tischer發(fā)現(xiàn)豬圓環(huán)病毒（Porcine circovirus，PCV）是已知的最小動(dòng)物病毒之一。該病毒在分類學(xué)上屬圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬，是直徑為17nm、呈20面體對(duì)稱結(jié)構(gòu)、基因組大小約為1.76kb、無(wú)囊膜的單股環(huán)狀DNA病毒。PCV對(duì)外界理化因子的抵抗力較強(qiáng)，即便在pH 3的酸性或70℃的高溫環(huán)境中也能存活一段時(shí)間，氯仿作用不失活。現(xiàn)已知PCV有非致病性的PCV-1和致病性的PCV-2兩個(gè)血清型。豬對(duì)PCV-2具有較高的易感性，感染豬可自鼻液、糞便等排泄物中排出病毒，可經(jīng)口腔及呼吸道途徑感染不同年齡的豬。PCV-2是斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征（Postweaning multisystemic wasting syndrome，PMWS）和皮炎與腎病綜合征（Porcine dermatitis and nephropathy syndrome，PDNS）的主要病原。PMWS最早發(fā)現(xiàn)于加拿大，主要發(fā)生于5周齡～16周齡的豬，最常見(jiàn)于6周齡～8周齡的斷奶仔豬，極少感染乳豬。一般仔豬斷奶后2d～3d或1周開(kāi)始發(fā)病，急性發(fā)病豬群的病死率可達(dá)10%，耐過(guò)豬后期的生長(zhǎng)發(fā)育明顯受阻，常常由于并發(fā)或繼發(fā)細(xì)菌與病毒感染而使病死率增加至25%以上。研究發(fā)現(xiàn)PCV-2具有多種動(dòng)物易感性，除引起保育豬和育肥豬的系統(tǒng)性疾病和亞臨床感染，兩者共同表現(xiàn)為減少平均日增重［1］，此外還可以感染小牛和野豬［2-3］，在鳥(niǎo)類、蚊子和嚙齒類等動(dòng)物中也檢測(cè)到該病毒［2］，而且常與多種病菌混合感染，如細(xì)小病毒可能成為豬圓環(huán)病毒關(guān)聯(lián)疾病的重要因子［4］，PCV-2引起的多系統(tǒng)衰竭綜合征常意味著對(duì)養(yǎng)豬企業(yè)的巨大經(jīng)濟(jì)意義［5］，豬圓環(huán)病毒關(guān)聯(lián)疾病的細(xì)胞和分子發(fā)病機(jī)理復(fù)雜［6］，研究表明不同日齡感染豬漿細(xì)胞產(chǎn)生的IgA、IgG和IgM表現(xiàn)出隨小腸腺的高度降低而增多，而漿細(xì)胞分布密度從十二指腸至回腸逐漸呈現(xiàn)下降趨勢(shì)［7］。

免疫器官在對(duì)抗病毒的侵襲中承擔(dān)關(guān)鍵作用，對(duì)感染豬的免疫器官研究具有重要意義，尤其是斷奶仔豬的免疫器官正處于發(fā)育過(guò)程中，免疫器官功能還未完善，如受到病毒的感染易使免疫器官發(fā)生病理變化。以往研究顯示圓環(huán)病毒感可導(dǎo)致豬免疫器官淋巴組織T細(xì)胞和B細(xì)胞減少，且淋巴細(xì)胞數(shù)量的變化受伴發(fā)病原的影響，其中豬瘟病毒影響最大，偽狂犬病病毒和豬繁殖與呼吸綜合征病毒次之［8］。大多數(shù)研究認(rèn)為僅從臨床癥狀、肉眼病變及分子檢測(cè)不足以對(duì)豬圓環(huán)病毒病進(jìn)行診斷［9］，為深入探索人工感染PCV-2仔豬的病理變化，分別應(yīng)用免疫組化方法定位淋巴器官的PCV-2的分布，經(jīng)典HE染色觀察致病豬的呼吸與消化系統(tǒng)主要器官及相關(guān)淋巴器官的組織病理變化，尤其是分析淋巴器官的病理?yè)p害，通過(guò)對(duì)組織病理特征的綜合評(píng)估，探討此病毒致病的病理變化規(guī)律。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1試驗(yàn)用動(dòng)物 試驗(yàn)選用健康SPF仔豬經(jīng)鼻噴入PCV-2病毒感染致病，待仔豬出現(xiàn)明顯臨床癥狀，處死剖檢仔豬，觀察主要內(nèi)臟器官的大體病理變化，并迅速采集呼吸與消化系統(tǒng)的主要器官，淋巴結(jié)及脾臟經(jīng)PBS洗凈后置入Bouin氏液和40g/L多聚甲醛溶液進(jìn)行固定保存。

1.1.2主要儀器設(shè)備和試劑 XSP-12CE電腦型生物顯微鏡為上海長(zhǎng)方光學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；JD4000-2電子分析天平為沈陽(yáng)龍騰電子有限公司產(chǎn)品；YD-202A-Ⅲ型電腦快速冷凍石臘兩用切片機(jī)為浙江省金華市益迪醫(yī)療設(shè)備有限公司產(chǎn)品；KD-P電腦生物組織攤片機(jī)、KD-H電腦生物組織烘片機(jī)為浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司產(chǎn)品；DK-8D電熱恒溫水槽為上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司產(chǎn)品；WDP-9162電熱恒溫培養(yǎng)箱為上海安亭科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；SZ-2自動(dòng)雙重蒸餾水器為上海滬西分析儀器廠產(chǎn)品；TFG-1200通風(fēng)柜為蘇州蘇潔凈化設(shè)備有限公司產(chǎn)品；HE染液等。

1.2方法

1.2.1切片制作及HE染色 將固定器官經(jīng)脫水、透明、浸蠟、包埋、并制作5μm厚的切片。采用HE染色，經(jīng)XSP-12CE電腦型生物顯微鏡觀察和拍照。1.2.2 免疫組化染色 切片脫蠟、水化；30mL/L H2O2室溫孵育、抗原修復(fù)、羊血清室溫封閉；滴加稀釋的兔抗PCV-2多克隆抗體及IgG抗體，室溫孵育、PBS沖洗、DAB顯色［10-11］；經(jīng)復(fù)染、脫水、透明及封片。用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，采用XSP-12CE電腦型生物顯微鏡觀察和拍照。PCV-2抗原陽(yáng)性細(xì)胞呈棕黃色，陰性細(xì)胞不著色。

2　結(jié)果

2.1癥狀與剖檢變化

試驗(yàn)證明經(jīng)鼻腔呼吸感染屬于該病毒傳播的有效途經(jīng)，仔豬難以抵抗經(jīng)呼吸道的病毒侵入。感染仔豬在不同時(shí)期出現(xiàn)明顯臨床癥狀，諸如呼吸困難、咳嗽、厭食、精神委糜、被毛粗亂等，嚴(yán)重患病仔豬臥地不起，呼吸衰竭甚至死亡。病理剖檢顯示，肺存在實(shí)質(zhì)性病理變化并腫大，顏色由粉紅色變?yōu)樯罴t色，成為最嚴(yán)重的病變器官。除了呼吸道沿線的淋巴結(jié)和扁桃體呈現(xiàn)嚴(yán)重腫大、出血、大理石花紋等病變之外，位于其他部位的淋巴結(jié)，諸如腹股溝淋巴結(jié)、肩前淋巴結(jié)、髂下淋巴結(jié)等均出現(xiàn)腫大、出血等不同程度的病理變化。

2.2呼吸與消化主要器官的組織病理

整個(gè)肝組織結(jié)構(gòu)較為散亂，肝小葉的組織邊界不明顯，細(xì)胞邊緣模糊，大小形態(tài)不清晰，相鄰的肝細(xì)胞出現(xiàn)融合或腫大，胞核出現(xiàn)固縮或崩解，在病變嚴(yán)重的區(qū)域肝組織甚至出現(xiàn)空泡化（圖1A中的a）。肺的組織結(jié)構(gòu)出現(xiàn)實(shí)質(zhì)性病理變化，細(xì)胞增生及組織細(xì)胞浸潤(rùn)并填充肺泡，肺泡間隔纖維化，肺泡崩裂至界限不清晰并填充較多血細(xì)胞（圖1B中的b）。小腸黏膜上皮脫落，邊緣模糊，且較為凌亂，隱窩被組織填充，固有膜中淋巴集結(jié)形態(tài)不一，稍增大且出現(xiàn)類上皮樣組織增生，淋巴細(xì)胞分布疏松，可見(jiàn)明顯的空隙，細(xì)胞具有融合及腫大現(xiàn)象，細(xì)胞核固縮甚至消失（圖1D中的c），并出現(xiàn)病毒包涵體（圖1D中的d）。

2.3外周淋巴器官的組織病理

在檢測(cè)的淋巴結(jié)、脾及扁桃體等外周淋巴器官中，組織細(xì)胞出現(xiàn)不同程度的裂解與消失，嚴(yán)重病例的淋巴器官可見(jiàn)淋巴小結(jié)中大多數(shù)淋巴細(xì)胞成團(tuán)消失，難以發(fā)現(xiàn)較為完整的組織，而且在細(xì)胞質(zhì)中具有較多小球形的包涵體（圖1D、E、F中的d），圍繞小結(jié)中心出現(xiàn)呈單或團(tuán)狀的類上皮樣組織（圖1F中的e），細(xì)胞腫大，細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)溶解或消失，僅剩下細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，同時(shí)有些細(xì)胞出現(xiàn)核固縮，比正常細(xì)胞核更小，導(dǎo)致組織的空泡化現(xiàn)象。而癥狀較輕的病例則出現(xiàn)細(xì)胞腫脹、胞核固縮、細(xì)胞邊界不清晰、胞核不明顯等組織病理變化（圖1F）。脾小結(jié)中心結(jié)構(gòu)不完整，細(xì)胞排列出現(xiàn)紊亂，中心的較多細(xì)胞類上皮樣化，細(xì)胞出現(xiàn)核固縮甚至崩解，同時(shí)淋巴小結(jié)周圍結(jié)締組織增生。

2.4淋巴器官的抗原分布

病變淋巴器官的免疫組化觀察與分析結(jié)果顯示，藍(lán)色為組織的背景色，攜有陽(yáng)性抗原的組織出現(xiàn)不同程度的棕黃色顆粒著色，不均勻分布在胞質(zhì)中。淋巴器官均有陽(yáng)性抗原的分布，嚴(yán)重病例的淋巴結(jié)陽(yáng)性著色區(qū)域分布非常密集，呈現(xiàn)許多大小不規(guī)則的顆粒狀（圖2A中的f），與細(xì)胞核著色呈明顯對(duì)照性的兩個(gè)區(qū)域，而較為完整的組織則難以觀察到陽(yáng)性著色顆粒，這些免疫組化結(jié)果顯示陽(yáng)性抗原分布的組織染色程度與病理組織的損傷程度表現(xiàn)一致，即淋巴器官的組織病理變化越嚴(yán)重，其病毒抗原分布越多。此外，不同的淋巴器官或同一淋巴器官的不同部位呈現(xiàn)不同程度的陽(yáng)性著色。根據(jù)PCV-2陽(yáng)性顯色細(xì)胞基本可分為嚴(yán)重、中等及輕微3個(gè)不同等級(jí)的群體，但在所有淋巴器官中較為共同的特征是著色區(qū)域常出現(xiàn)在淋巴小結(jié)或淋巴組織的中心部位，并且不管是嚴(yán)重病例或是輕微病例均以沿其中心的方向出現(xiàn)陽(yáng)性著色逐漸增加這一趨勢(shì)。

圖2　陽(yáng)性抗原分布Fig.2 Distribution of positive antigen

3　討論

在檢測(cè)的消化、呼吸及淋巴器官中，肺的組織病理變化最為嚴(yán)重，同時(shí)消化器官尤其是肝和小腸也出現(xiàn)病理變化，而與之相對(duì)應(yīng)的淋巴器官則呈現(xiàn)淋巴小結(jié)細(xì)胞核固縮、淋巴細(xì)胞消失等常見(jiàn)變化，同時(shí)出現(xiàn)淋巴細(xì)胞類上皮樣變化及結(jié)締組織增生。其中部分嚴(yán)重病例的淋巴器官出現(xiàn)淋巴細(xì)胞減少、壞死，甚至形成肉芽腫和大小不等的球形包涵體，與之前野外感染的病理變化具有類似特征［12］。

淋巴器官及組織病理的結(jié)果可以說(shuō)明應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法有助于查找PCV-2抗原分布及輔助診斷其所致PMWS疾病，病毒侵襲及所造成的病理?yè)p傷與陽(yáng)性抗原的分布呈現(xiàn)一致性，根據(jù)以上結(jié)果建立淋巴器官的組織病理?yè)p害程度，有利于深入探尋這種病毒的致病性規(guī)律。

參考文獻(xiàn)：

［1］ López S S，Sibila M，Nofrarías M，et al.Effect of porcine circovirus type 2（PCV2）load in serum on average daily weight gain during the postweaning period［J］.Vet Microbiol，2014，174（3-4）：296-301.

［2］ Halami M Y，F(xiàn)reick M，Shehata A A，et al.Susceptibility of calves to porcine circovirus-2（PCV2）［J］.Vet Microbiol，2014，173（1-2）：125-131.

［3］ An Dong-jun，Lim Seong-In，Kim Yong Kwan，et al.Genetic characterization of porcine circovirus type 2in the Korean wild boar population［J］.Vet Microbiol，2013，169（3-4）：147-153.

［4］ Tanja Opriessnig，Xiao Chao-Ting，Gerber Priscilla F，et al. Identification of recently described porcine parvoviruses in archived North American samples from 1996and association with porcine circovirus associated disease［J］.Vet Microbiol，2014，173（1-2）：9-16.

［5］ Alarcon P，Rushton J，Wieland B.Cost of post-weaning multisystemic wasting syndrome and porcine circovirus type-2subclinical infection in England-An economic disease model［J］. Prev Vet Med，2013，110（2）：88-102.

［6］ Dvorak Cheryl M T，Puvanendiran S，Murtaugh M P.Cellular pathogenesis of porcine circovirus type 2infection［J］.Virus Res，2013，174（1-2）：60-68.

［7］ Bianco C，F(xiàn)elice V，Panarese S，et al.Quantitative immunohistochemical assessment of IgA，IgM，IgG and antigen-specific immunoglobulin secreting plasma cells in pig small intestinal Lamina propria［J］.Vet Immunol Immunop，2014，160（3-4）：281-287.

［8］ 聶立欣，羅滿林，孔小明，等.豬圓環(huán)病毒感染后部分免疫器官的組織化學(xué)檢測(cè)［J］.動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2006，27（1）：58-61.

［9］ 尹業(yè)師，黃偉堅(jiān)，陳 瓊，等.豬圓環(huán)病毒感染的病理組織學(xué)和致病機(jī)理研究進(jìn)展［J］.動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2006，27（11）：18-21.

［10］ Kawashima K，Yamada S，Kobayashi H，et al.Detection of porcine reproductive and respiratory syndrome virus and Mycoplasma hyorhinis antigens in pulmonary lesions of pigs suffering from respiratory distress［J］.J Comp Pathol，1996，114：315-323.

［11］ Kawashima K，Tsunemitsu H，Horino R，et al.Postweaning multisystemic wasting syndrome in pigs in Japan：clinical manifestation of the diseased pigs，experimental infection of porcine circovirus type 2，and epidemiological investigation of PCV2and PMWS［J］.Bulletin of the National Institute of Animal Health，2002，109：9-16.

［12］ 聶立欣，孔小明，羅滿林，等.仔豬感染PCV-2的病理組織學(xué)變化［J］.畜牧與獸醫(yī)，2006，38（8）：51-52.

Histopathological Observation on Piglets Artificially Infected with PCV-2

LI Yong，GUO Hui，ZHONG You-bao
（College of Animal Science and Technology，Jiangxi Agricultural University，Nanchang，Jiangxi，330045，China）

Abstract：In order to investigate pathogenesis of piglets artificially infected with PCV-2，histopathological observation and antigen location of main organs in respiratory，digestive and lymphatic system of piglets artificially infected with PCV-2were carried out by immunohistochemistry method and HE staining.The results showed as follows：positive antigen distributes widely in tissues of lymphatic organs，especially intensively in lymphoid follicles.Brown yellow staining occurs in lymph tissues at different extent and distributes unevenly in cytoplasm.Functional leaflets in parenchymatous organs of digestive and respiratory systems are not integrated.Histological structures are in disorder，with pathological lesions such as plasmolysis，karyopycnosis and inclusion bodies at uneven extent and so on.Histocytes in lymphatic organs clearage and disappear variously.Most of lymphocytes disappear in clusters at severe piglet cases.It is difficult to find intact lymphoid follicles，moreover，global inclusion bodies emerge in cytoplasm with simple or group epithelium tissue structures.Cytoplasm becomes dissolved and disappeared，and cellular membrane is only left with karyopycnosis leading to vacuolization phenomenon.

Key words：piglet；PCV-2；pathology

作者簡(jiǎn)介：李 勇（1970-），男，江西蘆溪人，副教授，博士，主要從事畜禽組織結(jié)構(gòu)研究。

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31360592）；江西省科技廳支撐計(jì)劃（贛財(cái)教［2007］173號(hào)）；江西省教育廳科技計(jì)劃項(xiàng)目（GJJ13288）；江西省農(nóng)業(yè)廳項(xiàng)目；江西農(nóng)業(yè)大學(xué)博士基金項(xiàng)目

收稿日期：2014-12-09

中圖分類號(hào)：：S852.31；S852.659.2

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1007-5038（2015）07-0071-04