李　冰，劉麗穎，王輝暖，周鐵忠＊（.遼寧醫(yī)學(xué)院畜牧獸醫(yī)學(xué)院，遼寧錦州200；2.吉林大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，吉林長春0062；.營口市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，遼寧營口5004）

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歐洲型豬繁殖與呼吸綜合征病毒感染仔豬病理學(xué)特征及其組織內(nèi)病毒分布

李冰1，2，劉麗穎3，王輝暖1，周鐵忠1＊
（1.遼寧醫(yī)學(xué)院畜牧獸醫(yī)學(xué)院，遼寧錦州121001；2.吉林大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，吉林長春130062；3.營口市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，遼寧營口115004）

摘 要：為了研究仔豬感染歐洲型豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）的病理學(xué)特征及其病毒在組織內(nèi)的分布特點(diǎn)，用遼寧分離毒株EU-PRRSV LNEU12接種健康仔豬14d后，撲殺所有仔豬，觀察病理學(xué)特征并采用免疫組織化學(xué)方法分析組織內(nèi)抗原分布情況。結(jié)果表明，歐洲型PRRS主要的病理變化是多發(fā)性間質(zhì)性肺炎和淋巴結(jié)炎；病毒主要分布在肺臟、淋巴結(jié)、脾臟和腦組織中，其次為肝臟和腎臟。證明PRRS典型病理變化的產(chǎn)生與PRRSV分布情況具有明顯的相關(guān)性。

關(guān)鍵詞：豬繁殖與呼吸綜合征病毒；歐洲型；病理學(xué)特征；病毒分布；仔豬

豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome viruses，PRRSV）引起豬的以母豬繁殖障礙和各種年齡段豬呼吸系統(tǒng)障礙為特征的傳染?。?］。PRRS自1987年首次發(fā)生于美國以來，北美、歐洲及亞洲等多個(gè)國家均有發(fā)生和流行，給世界養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，已經(jīng)成為危害全球養(yǎng)豬業(yè)最嚴(yán)重的傳染病之一［2］。PRRSV是一種有囊膜、正鏈RNA病毒，屬于動(dòng)脈炎病毒科動(dòng)脈炎病毒屬成員［3］。目前，PRRSV主要分為2個(gè)基因型，即基因Ⅰ型（歐洲型）和基因Ⅱ型（美洲型）。研究表明，不同基因型毒株的毒力有所不同，而引起發(fā)病豬的臨床癥狀卻比較相似，其中美洲型毒株引起的呼吸道癥狀更加嚴(yán)重［4］。1991年初中國臺(tái)灣首次暴發(fā)以來，PRRS已在中國普遍存在，特別是在西南地區(qū)豬群感染率高達(dá)90%，而且所分離的毒株（包括HP-PRRSV）均以美洲型為主［5］。2011年在北京、內(nèi)蒙古首次分離到PRRSV歐洲型毒株以來，福建、江西、浙江、遼寧等地陸續(xù)分離到了歐洲型毒株，而且豬只感染有上升趨勢(shì)［6-8］。目前，我國關(guān)于PRRSV的研究多數(shù)集中在美洲型毒株，而對(duì)近年來分離的歐洲型PRRSV缺乏系統(tǒng)研究。本試驗(yàn)采用歐洲型豬繁殖與呼吸綜合征病毒遼寧分離株（EUPRRSV LNEU12）感染仔豬，觀察病理學(xué)特征及分析組織內(nèi)抗原的分布情況，為進(jìn)一步研究病毒在豬體內(nèi)的持續(xù)感染狀況和闡明EU-PRRSV的致病機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1毒株 歐洲型豬繁殖與呼吸綜合征病毒遼寧分離株LNEU12（KM196101），由遼寧醫(yī)學(xué)畜產(chǎn)品質(zhì)量安全與工程省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2試驗(yàn)用動(dòng)物 30日齡健康仔豬5頭，由遼寧醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，經(jīng)RT-PCR檢測(cè)PRRS抗原為陰性。隨機(jī)分為2組，A組3頭為試驗(yàn)組，B組2頭為對(duì)照組。豬只的飼養(yǎng)管理按照常規(guī)程序封閉飼養(yǎng)。

1.1.3主要試劑 DAB、兔抗豬二抗為上海索萊寶生物科技有限公司產(chǎn)品；EU-PRRS陽性血清由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所饋贈(zèng)；防脫片為北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；甲醛、蘇木素、PBS緩沖液、檸檬酸鹽緩沖液、30 mL/L甲醇-H2O2溶液、鹽酸酒精分化液等按常規(guī)方法配制。

1.2方法

1.2.1人工感染 按照文獻(xiàn)［9］建立的人工感染方法進(jìn)行病毒接種。將試驗(yàn)組豬只飼養(yǎng)至30日齡時(shí)，A組滴鼻接種EU-PRRSV LNEU12株的細(xì)胞培養(yǎng)物2mL/頭（104.8TCID50/mL）；B組滴鼻接種無PRRSV的細(xì)胞培養(yǎng)物2mL/頭。隔離飼養(yǎng)，每天觀察仔豬臨床表現(xiàn)，于攻毒14d后撲殺所有豬只。

1.2.2病理剖檢及樣品采集 攻毒14d后撲殺所有豬只，按常規(guī)的病理剖檢技術(shù)進(jìn)行尸檢，并詳細(xì)記錄各器官的病理變化，同時(shí)采集病死豬的肺、淋巴結(jié)、腦、心、肝、脾、腎、腎上腺和部分空腸，用100mL/L福爾馬林溶液固定。

1.2.3病原檢測(cè) 無菌操作挑取攻毒豬只的脾臟、肺臟，在血瓊脂平板上劃線進(jìn)行細(xì)菌分離，經(jīng)37℃培養(yǎng)24h后觀察結(jié)果。同時(shí)采集試驗(yàn)豬的肺、脾、腎、淋巴結(jié)等組織，經(jīng)混樣處理，采用張戰(zhàn)峰等［10］建立的RT-PCR方法檢測(cè)試驗(yàn)豬EU-PRRSV感染情況。另外，采用已建立的方法對(duì)試驗(yàn)豬進(jìn)行NAPRRSV、CSFV的PCR檢測(cè)［11-12］。

1.2.4病理組織學(xué)觀察 按常規(guī)石蠟切片技術(shù)方法制作組織切片，經(jīng)HE染色，應(yīng)用光學(xué)顯微鏡觀察病理組織學(xué)變化并記錄結(jié)果。

1.2.5免疫組織化學(xué)檢測(cè) 采用間接免疫組織化學(xué)酶標(biāo)染色法（SABC），將防脫組織切片60℃烤片2h，水化后高壓抗原修復(fù)，經(jīng)100mL/L小牛血清封閉后，滴加EU-PRRS陽性血清（一抗），濕盒4℃過夜，甩干搖洗后加入羊抗豬過氧化物酶標(biāo)抗體（二抗）濕盒37℃孵育30min，DAB顯色后，經(jīng)蘇木素復(fù)染、鹽酸分化、脫水、封片、鏡檢。試驗(yàn)設(shè)一抗陰性對(duì)照，在陰性對(duì)照成立情況下，被檢樣品中出現(xiàn)棕褐色顯色，則判為陽性；不出現(xiàn)棕褐色顯色，則判為陰性。

2　結(jié)果

2.1病原檢測(cè)結(jié)果

血瓊脂血平板上沒有任何細(xì)菌生長；對(duì)試驗(yàn)豬的組織進(jìn)行EU-PRRSV的RT-PCR檢測(cè)，均可擴(kuò)增出約576bp大小的條帶（圖1），美洲型PRRSV傳統(tǒng)毒株、變異毒株和豬瘟病毒的檢測(cè)結(jié)果均為陰性。2.2 剖檢變化結(jié)果

試驗(yàn)豬A組接種病毒3d后，體溫升高到39.6℃，攻毒第9天時(shí)體溫最高達(dá)40.5℃。出現(xiàn)厭食、嗜睡、呼吸困難、耳部皮膚輕度發(fā)紺等癥狀，對(duì)照豬B組未出現(xiàn)明顯的異常表現(xiàn)。攻毒14d后撲殺所有豬只，按常規(guī)的病理剖檢技術(shù)進(jìn)行尸檢。主要病變?cè)诜魏土馨徒Y(jié)，肺臟間質(zhì)增寬，有不同程度的充血、出血，暗紅或灰紅色病灶處實(shí)變，切面氣管腔內(nèi)有黏液性分泌物；全身淋巴結(jié)腫大，其中肺門淋巴結(jié)、下頜淋巴結(jié)、腹股溝深淺淋巴結(jié)、腸系膜淋巴結(jié)腫大明顯，切面多汁；腦軟膜血管充血明顯；肝臟表面有大小不等云霧樣灰白色病灶；脾臟輕度腫大、淤血；腎臟有輕度的充血、出血；其他器官變化不明顯（圖2）。

圖1　感染仔豬病原學(xué)PCR檢測(cè)結(jié)果Fig.1 PCR results for pathogens of infected piglets

圖2　感染仔豬的主要癥狀與剖檢變化Fig.2 The main clinical signs and lesions of infected piglets

2.3病理組織變化

肺主要呈多發(fā)性間質(zhì)性肺炎，肺間質(zhì)增寬，間質(zhì)內(nèi)分散多量的細(xì)胞碎片和紅細(xì)胞，肺泡壁不完整，個(gè)別肺泡腔內(nèi)含有漿液、少量白細(xì)胞和紅細(xì)胞；淋巴結(jié)組織內(nèi)淋巴細(xì)胞、網(wǎng)狀細(xì)胞壞死，數(shù)量減少，淋巴竇內(nèi)可見多核巨噬細(xì)胞，淋巴組織充血、大量紅細(xì)胞滲出。腦血管擴(kuò)張充血出血，血管壁外圍間隙增寬有少量炎性細(xì)胞，神經(jīng)細(xì)胞不同程度變性壞死，出現(xiàn)衛(wèi)星現(xiàn)象和噬神經(jīng)現(xiàn)象；脾臟淤血、出血，淋巴細(xì)胞、網(wǎng)狀細(xì)胞壞死，脾竇間隙內(nèi)布滿大量紅細(xì)胞；肝臟淤血、肝細(xì)胞變性；腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生顆粒變性、水泡變性和脂肪變性，嚴(yán)重的發(fā)生壞死，間質(zhì)充血、出血及炎性細(xì)胞浸潤，詳見圖3。

圖3　感染仔豬的病理組織變化（HE，200×）Fig.3 The histopathological lesions of infected piglets（HE，200×）

2.4免疫組織化學(xué)觀察結(jié)果

免疫組織化學(xué)觀察結(jié)果顯示，EU-PRRSV存在于多種組織器官，主要有肺、淋巴結(jié)、脾臟、腦組織、肝臟、腎臟，其中陽性強(qiáng)度較高的器官為肺臟、淋巴結(jié)、脾臟和腦組織，其次為肝臟和腎臟。心肌、空腸和腎上腺組織未發(fā)現(xiàn)陽性細(xì)胞分布。

肺間質(zhì)的巨噬細(xì)胞胞漿、毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞胞漿檢測(cè)到了陽性抗原；淋巴結(jié)的陽性細(xì)胞主要分布在髓索內(nèi)、皮質(zhì)和髓質(zhì)淋巴竇周圍；腦組織神經(jīng)元胞漿和膠質(zhì)細(xì)胞見有陽性反應(yīng)；脾臟的陽性細(xì)胞主要分布于脾小體和脾竇周圍；肝臟的匯管區(qū)浸潤的少量巨噬細(xì)胞中檢測(cè)到陽性抗原；腎小管間質(zhì)的單核細(xì)胞和毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞檢測(cè)到陽性抗原，詳見圖4。

圖4　免疫組織化學(xué)染色結(jié)果（IHC，400×）Fig.4 Immunohistochemical staining results（IHC，400×）

3　討論

本研究用歐洲型分離毒株進(jìn)行人工感染健康仔豬后，試驗(yàn)豬出現(xiàn)了發(fā)熱、厭食、呼吸困難、皮膚輕度發(fā)紺，但未出現(xiàn)急性死亡現(xiàn)象；剖檢觀察到病變主要在肺臟和淋巴結(jié)，其次為腦和腎臟。Kim H K等［7］報(bào)道用EU-PRRSV G2446株攻毒仔豬，其剖檢變化主要在肺臟、淋巴結(jié)和心肌組織，這一特點(diǎn)與本試驗(yàn)結(jié)果基本相似。1996年郭寶清等報(bào)道引起仔豬發(fā)生藍(lán)耳病的毒株為美洲型，其發(fā)病特點(diǎn)為呼吸困難、耳部皮膚發(fā)紺、體溫升高、全身淋巴結(jié)腫大、肺臟淤血、間質(zhì)增寬等，以上特點(diǎn)與本試驗(yàn)結(jié)果也很相似。這也證實(shí)了不同基因型的PRRSV引起豬發(fā)病后的癥狀與病變基本相似的特點(diǎn)（高致病性豬藍(lán)耳病除外）。但是，本次攻毒試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)除了肺、淋巴結(jié)和腦以外，在腎臟和胃黏膜也出現(xiàn)了病理變化，這可能與分離株的毒力有關(guān)，也可能與試驗(yàn)環(huán)境條件等因素有一定關(guān)系。目前認(rèn)為豬繁殖與呼吸障礙綜合征是多因素共同作用的結(jié)果，臨床和人工復(fù)制的差異較大，試驗(yàn)感染不能全部復(fù)制出臨床上典型的病變。

對(duì)試驗(yàn)感染的仔豬組織器官進(jìn)行組織病理學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，絕大部分臟器都有明顯的組織學(xué)病變，其中肺臟的多發(fā)性局灶性間質(zhì)性肺炎最為明顯，其次為淋巴結(jié)炎和非化膿性腦炎變化，這與Kim H K等報(bào)道的歐洲型豬繁殖與呼吸綜合征的病理組織學(xué)變化基本一致。另外，本試驗(yàn)也觀察到了脾臟、肝臟和腎臟的眼觀病變，但病變較輕且不明顯，而顯微鏡下可觀察到一定組織學(xué)病變并且免疫組化染色后也可觀察到陽性細(xì)胞，這說明了EU-PRRSV可以在脾臟、肝臟和腎臟中復(fù)制。

通過間接免疫組化法對(duì)試驗(yàn)豬主要器官中的抗原進(jìn)行了定位，發(fā)現(xiàn)EU-PRRSV抗原主要存在于肺臟、淋巴結(jié)、腦、脾臟、肝臟和腎臟的巨噬細(xì)胞中，并且存在于這些細(xì)胞的胞漿內(nèi)，這表明PRRSV的原始靶細(xì)胞為巨噬細(xì)胞，病毒的復(fù)制是在胞漿內(nèi)進(jìn)行的。從各組織中出現(xiàn)陽性信號(hào)的強(qiáng)弱程度來看，肺臟、淋巴結(jié)的陽性信號(hào)最強(qiáng)，腦組織、脾臟的陽性信號(hào)依次較弱，肝臟、腎臟的陽性信號(hào)最弱，心肌、空腸和腎上腺組織未發(fā)現(xiàn)陽性細(xì)胞。從EU-PRRS病豬的病理組織學(xué)觀察結(jié)果來看，肺臟、淋巴結(jié)、腦組織、肝臟、脾臟和腎臟等組織器官均有病理變化，剖檢可見其典型病變?cè)诜闻K、淋巴結(jié)和腦組織，這與免疫組化所檢測(cè)到的PRRSV抗原分布結(jié)果相一致，以上研究結(jié)果可以證明PRRS典型病理變化的產(chǎn)生與PRRSV分布情況具有明顯的相關(guān)性。

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Pathological Features and Antigen Distribution in Tissues of Piglets Infected with EU-PRSSV

LI Bing1，2，LIU Li-ying3，WANG Hui-nuan1，ZHOU Tie-zhong1
（1.College of Animal Husbandry and Veterinary Medicine，Liaoning Medical University，Jinzhou，Liaoning，121001，China；
2.College of Veterinary Medicine，Jilin University，Changchun，Jilin，130062，China；
3.Yingkou Center for Disease Control and Prevention，Yingkou，Liaoning，115004，China）

Abstract：In order to investigate the pathological features of piglets infected with European-type porcine reproductive and respiratory syndrome viruses and its distribution characteristics of the viruses in the tissues，healthy piglets were inoculated with isolated EU-PRRSV LNEU12.After 14days，all the piglets were killed to observe the pathological features and analyze the distribution of antigen in the tissues using immunohitochemical method.The results showed that the main pathological lesions of European-type PRRS are multiple interstitial pneumonia and lymphadenitis；Viruses are mainly distributed in the lungs，lymph nodes，spleen，and brain tissues，while livers and kidneys in the second place.The results proved that the generation of typical pathological lesions of PRRS is obviously relevant to the antigen distribution of PRRSV.

Key words：Porcine reproductive and respiratory syndrome；European-type；pathological feature；antigen distribution；piglet

作者簡介：李 冰（1975-），男，遼寧錦州人，獸醫(yī)博士，主要從事家畜傳染病學(xué)研究。＊通訊作者

基金項(xiàng)目：遼寧省教育廳科研項(xiàng)目（L2014327）；遼寧省百千萬人才工程資助項(xiàng)目（2014921012）

收稿日期：2015-01-24

中圖分類號(hào)：S852.31；S852.659.6

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1007-5038（2015）07-0067-04