楊　帆，趙振升，孟小賓，孔　濤，王國永，周變?nèi)A，郝雪琴（.河南科技大學動物科技學院，河南洛陽47003；.天津瑞普生物技術股份有限公司，天津300300）

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單次靜脈注射后多西環(huán)素在大鼠血漿和尿液中的藥物動力學研究

楊帆1，趙振升1，孟小賓2，孔濤1，王國永1，周變?nèi)A1，郝雪琴1
（1.河南科技大學動物科技學院，河南洛陽471003；2.天津瑞普生物技術股份有限公司，天津300300）

摘 要：選用7只平均體重為250g±31g的健康雄性成年大鼠，進行多西環(huán)素單劑量靜脈注射（10mg/kg體重）給藥途徑下的血漿和尿液藥物動力學研究。采用高效液相色譜法檢測血漿及尿液中的藥物濃度，之后分別采用房室分析和速度法計算血漿和尿液中多西環(huán)素的藥物動力學參數(shù)。健康大鼠靜脈注射多西環(huán)素后，血漿濃度-時間數(shù)據(jù)的最優(yōu)擬合模型為二室開放模型。主要藥物動力學參數(shù)如下：表觀分布容積（Vd）為（1 493.48±243.65）mL/kg、分布速率常數(shù)（α）為（13.70±5.92）h-1、消除速率常數(shù)（β）為（0. 15±0.03）h-1、體清除率（Cl）為（216.06±52.98）mL/h/kg。速度法計算得到的多西環(huán)素的藥物動力學參數(shù)如下：β為（0.13±0.02）h-1、腎排泄速度常數(shù)（ke）為（0.08±0.02）h-1、腎清除率（Clre）為（113.35±18. 02）mL/h/kg、肝清除率（Clhe）為（102.71±32.14）mL/h/kg。研究結果表明，多西環(huán)素在大鼠體內(nèi)分布廣泛、消除緩慢；此外，大鼠體內(nèi)多西環(huán)素的消除過程中，肝臟和腎臟均發(fā)揮了主要作用，且二者作用相當。

關鍵詞：多西環(huán)素；大鼠；血漿；尿液；藥物動力學

多西環(huán)素（doxycycline）是一種半合成的第二代四環(huán)素類藥物，對革蘭陰性菌和陽性菌及一些立克次體、衣原體、支原體、螺旋體及某些原蟲均有顯著的抑制作用［1］。因其抗菌譜廣、抗菌能力強、價格低廉、使用方便，被廣泛應用于獸醫(yī)臨床［2］。目前，多西環(huán)素的藥物動力學報道已見于多種動物［3-7］。但這些研究中均僅以血漿濃度-時間數(shù)據(jù)來評價多西環(huán)素的藥物動力學特征，目前國內(nèi)尚無多西環(huán)素在任何動物體內(nèi)的尿液藥物動力學研究報道。為此，本文以大鼠為實驗動物，開展了單次靜脈注射途徑下多西環(huán)素的血漿和尿液藥物動力學研究，以期更全面地了解多西環(huán)素的藥物動力學特征。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1試驗藥品與試劑 多西環(huán)素對照品，含量為86%，批號0485-0401，為中國食品藥品檢定研究院產(chǎn)品；鹽酸多西環(huán)素注射液：含量規(guī)格為5 mL∶0.5g，批號20130417，為洛陽惠中獸藥有限公司產(chǎn)品；肝素鈉，效價≥140U/mg，為北京奧博星生物技術有限責任公司產(chǎn)品；色譜純乙腈、甲醇為MERCK公司產(chǎn)品。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.2儀器設備 Dionex U-3000型高效液相色譜儀，配備四元泵、Dionex U-3000紫外檢測器、自動進樣器、柱溫箱、Chromeleon色譜工作站為Dionex公司產(chǎn)品；高速臺式冷凍離心機為Thermo Fisher Scientific公司產(chǎn)品；感量為0.000 1g AUX 220型電子分析天平為Shimadzu公司產(chǎn)品；pHs-25 型pH計為上海精科雷磁儀器廠產(chǎn)品；XW-80A型旋渦混合器為上海青浦瀘西儀器廠產(chǎn)品；MSI型微型混合器為IKA公司產(chǎn)品；4.6 mm×250 mm Hypersil BDS型C18色譜柱，粒徑為5μm，為大連伊利特公司產(chǎn)品；60mg/3mL StrataTM-X固相萃取小柱為Phenomenex公司產(chǎn)品。

1.1.3實驗動物 雄性Wistar大鼠7只，體重205g～300g，平均體重為250g±31g，購自南方醫(yī)科大實驗動物中心。試驗動物購回后，常規(guī)適應性飼養(yǎng)1周，自由飲水和采食，飼料為不含任何抗生素和抗菌藥的全價鼠糧。

1.2方法

1.2.1試液配制 多西環(huán)素標準儲備液（1 000μg/mL）：準確稱取116.3mg多西環(huán)素對照品，置于100mL容量瓶中，以甲醇溶解，定容至刻度，-20℃冰箱中避光保存。臨用前分取適量，用流動相稀釋，配制成7個濃度梯度的標準工作液，濃度范圍為2μg/mL～400μg/mL；EDTA-Na2-Mcllvaine緩沖液：準確稱取27.548 1g的磷酸氫二鈉、12.929 2g的檸檬酸和37.230 8g的EDTANa2，以1L超純水溶解，經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾后，置于4℃冰箱中備用。

1.2.2給藥及樣品采集 首先開展多西環(huán)素在大鼠血漿中的藥物動力學研究。每只大鼠稱重后保定，自尾靜脈注射鹽酸多西環(huán)素注射液，劑量為10 mg/kg體重（以多西環(huán)素計，下同），給藥后5、10、15、30、45min和1、2、3、4、6、8、12、24、36h分別自每只大鼠的眶下靜脈叢采集血液約200μL，用肝素鈉進行抗凝，之后以4 000r/min轉(zhuǎn)速離心10min，分離血漿樣品，置-20℃冰箱中保存。血漿藥物動力學結束10d（洗凈期）后，將每只大鼠單獨置于代謝籠中適應性飼養(yǎng)4d，之后開展多西環(huán)素的尿液藥物動力學研究：每只大鼠單劑量靜脈注射鹽酸多西環(huán)素注射液（10mg/kg體重），之后收集給藥后0～4、4～8、8～12、12～16、16～22、22h～28h內(nèi)的尿液樣品。準確記錄各時間段尿液體積，并預留2mL左右尿樣于-20℃冰箱中保存待測。

1.2.3樣品前處理 精密量取100μL血漿，加入60μL 0.1 g/mL的抗壞血酸溶液和40μL 180mL/L的高氯酸溶液，渦旋3min，15 000r/inm離心15min，之后將上清液轉(zhuǎn)移至內(nèi)襯管中，再置于進樣瓶中，進行高效液相色譜檢測。

準確量取1mL尿液于15mL離心管中，加入5mL Na2EDTA-Mcllvaine緩沖液，8 000r/min離心10min，上清液進一步用StrataTM-X固相萃取小柱凈化。凈化程序如下：上樣前，固相萃取小柱依次以5mL甲醇和5mL水活化平衡；平衡后上樣；上樣后，再依次以5mL水和5mL 50mL/L的甲醇水溶液淋洗，棄去全部淋洗液，減壓抽干；最后用8mL 100mL/L的甲醇乙酸乙酯溶液分3次（3mL+3 mL+2mL）洗脫。收集全部洗脫液，于50℃水浴下以空氣吹干。殘渣中加入0.5mL流動相，充分渦旋1min后，轉(zhuǎn)移到1.5mL離心管中，15 000r/min離心10min，上清液經(jīng)0.22μm針頭式濾器過濾后，置于尖底進樣瓶中。

1.2.4檢測方法

1.2.4.1色譜條件 色譜條件如下：BDS型C18色譜柱；柱溫為30℃；紫外檢測器，檢測波長為350nm；流動相為乙腈和0.01mol/L的草酸溶液，兩者比例為3∶7（V∶V），流速為1.0mL/min；進樣量為50μL。

1.2.4.2標準曲線與線性范圍 取1.2.1中的多西環(huán)素標準工作液適量，分別加入到空白血漿（100μL）或空白尿液（1mL）樣品中，制得血漿及尿液的添加樣品，添加濃度范圍分別為0.1μg/mL～20μg/mL（血漿）和0.05μg/mL～20μg/mL（尿液）。之后按上述方法進行樣品前處理和檢測，獲得不同添加濃度樣品中多西環(huán)素的色譜峰面積，最后以峰面積對添加濃度進行線性回歸，獲得多西環(huán)素在血漿及尿液中的標準曲線。

1.2.4.3回收率與變異系數(shù) 取100μL空白血漿和1mL空白尿液樣品，添加多西環(huán)素標準工作液，在標準曲線范圍內(nèi)，分別制得0.1、1、20μg/mL的血漿添加樣品及0.05、1、10μg/mL的尿液添加樣品，每批每個濃度均同時重復5個樣品，共進行3個批次，按上述方法進行樣品前處理和檢測，同時直接制得3個相當濃度的標準工作液，直接進樣。將經(jīng)過前處理的生物樣品所獲得的多西環(huán)素色譜圖峰面積與直接進樣得到的峰面積進行比較，計算出多西環(huán)素的絕對回收率，并計算批內(nèi)和批間變異系數(shù)。

1.2.4.4檢測限和定量限 取大鼠空白的血漿（100μL）和尿液（1mL）樣品，添加多西環(huán)素標準工作液適量，使得血漿及尿液樣品中多西環(huán)素的濃度分別為0.025、0.05、0.1、0.5、1、2μg/mL。每個濃度6個平行，按上述方法進行樣品前處理和檢測，以最低檢出濃度計算，3倍信噪比（S/N）為檢測限（LOD），10倍信噪比為定量限（LOQ）。

1.2.5藥物動力學分析 以WinNonlin軟件（5.2. 1版，美國Pharsight公司），利用房室分析法計算多西環(huán)素的血漿藥物動力學參數(shù)，以“AIC最小”為原則，輔以眼觀比較來選擇最佳房室模型及權重。尿液藥物動力學參數(shù)則以速度法計算。

2　結果

2.1檢測方法的線性范圍與標準曲線

以多西環(huán)素的濃度（C）為縱坐標，對應的色譜峰面積（S）為橫坐標進行線性回歸分析，獲得血漿及尿液中多西環(huán)素的標準曲線分別為C=3.590 2S-0.066 4和C=1.391 5S+0.102 6，相關系數(shù)分別為0.999 6和0.999 5。本檢測方法的線性范圍為0.1μg/mL～20μg/mL（血漿）和0.05μg/mL～20μg/mL（尿液）。

2.2檢測方法的回收率和變異系數(shù)

本研究所建立的多西環(huán)素在大鼠血漿及尿液兩種基質(zhì)中檢測方法的回收率及變異系數(shù)結果見表1。

表1　大鼠血漿及尿液中多西環(huán)素的回收率（±SD，n=5）和變異系數(shù)Table 1 Recovery（-x±SD，n=5）and coefficient of variation for doxycycline in plasma and urine samples of rats

表1　大鼠血漿及尿液中多西環(huán)素的回收率（±SD，n=5）和變異系數(shù)Table 1 Recovery（-x±SD，n=5）and coefficient of variation for doxycycline in plasma and urine samples of rats

基質(zhì)Matrix濃度/（μg?mL-1）Concentrations回收率/% Recovery rate 第1批Batch 1 第2批Batch 2 第3批Batch 3批內(nèi)變異系數(shù)/% Intra-assay coefficients of variation 第1批Batch 1 第2批Batch 2 第3批Batch 3批間變異系數(shù)/% Inter-assay coefficients of variation血漿Palsma 0.1 　72.53±8.77 73.06±2.46 75.32±5.14 12.09 　3.36 6.83 　7.78 1 　69.96±2.22 71.33±2.42 73.92±5.57 3.17 　3.39 7.54 　5.37 20 　65.07±1.89 68.73±1.01 60.97±2.12 2.91 　1.47 3.47 　5.63尿液Urine 0.05 　94.96±2.76 96.88±1.18 93.82±3.43 2.90 　1.21 3.66 　2.90 1 　98.16±1.80 96.08±1.83 94.80±3.66 1.84 　1.90 3.86 　2.89 10 　98.33±1.25 98.50±0.88 97.67±1.75 1.27 　0.89 1.79 　1.32

2.3檢測方法的檢測限和定量限

本研究所建立的檢測方法在大鼠血漿中的LOD和LOQ分別為0.05μg/mL和0.1μg/mL，尿液中則分別為0.025μg/mL和0.05μg/mL。

2.4多西環(huán)素在血漿和尿液中的濃度

大多數(shù)大鼠給藥后36h血漿中藥物濃度即達到LOQ附近，具體的濃度-時間曲線見圖1。本研究中，前期一些時間點血漿中多西環(huán)素的濃度超出了標準曲線的上限，在檢測過程中先以空白血漿對濃度超過標準曲線上限的樣品進行了適當稀釋后再進行前處理和定量分析。而大鼠單次靜脈注射多西環(huán)素后累積尿藥-時間曲線見圖2。

圖1　大鼠（n=7）單次靜脈注射多西環(huán)素（10mg/kg體重）后血漿藥物濃度（-x±SD）-時間半對數(shù)圖Fig.1 Semi-logarithmic plot showing the-x±SD plasma concentration-time profile of doxycycline in rats（n=7）after single intravenous injection at 10mg/kg

圖2　大鼠（n=7）單次靜脈注射多西環(huán)素（10mg/kg體重）后累積尿藥（-x±SD）-時間曲線圖Fig.2 Cumulative amount（-x±SD）of doxycycline excreted in urine after single intravenous injection at 10mg/kg in rats（n=7）

2.5血漿及尿液中多西環(huán)素的藥物動力學參數(shù)

血漿濃度-時間數(shù)據(jù)的最優(yōu)擬合模型為二室開放模型，權重為1/C2，其中C為檢測到的藥物濃度。以WinNonlin軟件計算得到的多西環(huán)素的血漿藥物動力學參數(shù)見表2。

表2　大鼠（n=7）單次靜脈注射多西環(huán)素（10mg/kg體重）后血漿藥物動力學參數(shù)（-x±SD）Table 2 Plasma pharmacokinetics parameters（-x±SD）of doxycycline after single intavenous injection at 10mg/kg bw in rats（n=7）

以不同時間段尿液中多西環(huán)素排泄率的自然對數(shù)對各段采樣時間中點作圖（圖3），利用殘數(shù)法即可求算出消除速率常數(shù)β及keBV1，而V1和B值在血漿藥物動力學部分已經(jīng)求得（表2），因此本研究通過尿藥數(shù)據(jù)計算得到多西環(huán)素的β為（0.13±0.02）h-1，ke為（0.08±0.02）h-1，而腎清除率（Clre）可通過ke與表觀分別容積（Vd）的乘積計算得到，因此多西環(huán)素在大鼠體內(nèi)的Clre等于（113.35±18.02）mL/h/kg。故而大鼠體內(nèi)多西環(huán)素的非腎清除率（即肝清除率Clhe）應為（102.71±32.14）mL/h/kg。

3　討論

3.1多西環(huán)素的血漿藥物動力學

單次靜脈注射后，大鼠血漿中多西環(huán)素濃度-時間數(shù)據(jù)的最優(yōu)擬合模型為二室開放模型，這與Vargas-Estrada D等［8］報道的結果一致，但Michel G等［9］的研究結果卻顯示大鼠單次灌胃多西環(huán)素以后最優(yōu)擬合模型為有吸收的一室開放模型，這可能與給藥途徑不同有關。在以往不同種屬動物的研究中，豬［10］、雞［11］、山羊［12］、綿羊［13］等動物體內(nèi)均采用了二室開放模型來描述多西環(huán)素的處置特征。這與多西環(huán)素的理化性質(zhì)有關，多西環(huán)素較第1代四環(huán)素類藥物比，脂溶性更強。因此，其組織分布更廣，容易在脂肪組織中蓄積，脂肪組織極易成為其周邊室的主要組成部分，這也預示著多西環(huán)素在動物體內(nèi)的消除會較緩慢。

圖3　大鼠（n=7）單次靜脈注射多西環(huán)素（10mg/kg體重）后各時間段內(nèi)多西環(huán)素隨尿排泄率與采樣時間中點的線性回歸圖Fig.3 Mean excretion rate of doxycycline versus midpoint time of urine collection curve after single intravenous administration at 10mg/kg bw in rats（n=7）

單次靜脈注射后，多西環(huán)素在大鼠體內(nèi)的消除半衰期（t1/2β）為4.96h±1.12h，稍大于Michel D等［9］報道的結果（2.47h～3.85h），這可能和2個研究中所使用的檢測方法不同有關。本研究中所建立的高效液相色譜法，血漿中多西環(huán)素的LOQ低達0.05μg/mL，而Michel D等的研究中則使用了微生物法，定量限約為0.2μg/mL，無法對消除相后段更多的樣品進行濃度定量，因此較難獲得足夠多的濃度-時間數(shù)據(jù)對消除相進行準確描述。本研究得出的多西環(huán)素的t1/2β與山羊［12］（4.11h±0.46h）和肉雞［11］（4.75h±0.21h）體內(nèi)的結果接近，但遠大于豬［10］（1.73h±0.1h）、遠小于綿羊［13］（7.027h～12.11h）體內(nèi)的結果。這一區(qū)別可能與動物種屬間的差異有關。單次靜脈注射以后，多西環(huán)素在大鼠體內(nèi)的表觀分布容積（Vd）為1493.48mL/kg±243.65 mL/kg，與綿羊［13］（1.820L/kg～2.690L/kg）和豬［14］（1.04L/kg±0.09L/kg）體內(nèi)的結果接近，但要大于肉雞［11］（0.28L/kg±0.02L/kg）體內(nèi)的結果，相反小于山羊［12］（4.91L/kg±0.13L/kg）體內(nèi)的結果。考慮到不同動物的體重或體型差別，該結果表明多西環(huán)素在大鼠體內(nèi)分布廣泛。

3.2多西環(huán)素的尿液藥物動力學參數(shù)

目前尚無多西環(huán)素在大鼠體內(nèi)尿排泄的報道，本文在確定了多西環(huán)素在大鼠體內(nèi)的處置特點符合二室開放模型的基礎之上，以速度法處理了多西環(huán)素的尿藥數(shù)據(jù)，計算得到β為（0.13±0.02）h-1、ke為（0.08±0.02）h-1、Clre為（113.35±18.02）mL/h/kg、Clhe為（102.71±32.14）mL/h/kg。該結果說明，大鼠體內(nèi)肝臟和腎臟清除多西環(huán)素的能力相當。Ghani F等［15］也通過類似的方法研究了成年人體內(nèi)多西環(huán)素隨尿排泄情況，其研究結果顯示人體內(nèi)多西環(huán)素的Clre為（29.4±3.4）mL/h/kg，要遠小于大鼠體內(nèi)的數(shù)值，這說明大鼠體內(nèi)多西環(huán)素的腎排泄速度要遠快于人體，這可能是由兩者間尿液形成及排泄速度間的差別所致。Whelton A等［16］則比較了健康和腎損傷成年男性體內(nèi)多西環(huán)素藥物動力學特征間的差別，研究結果表明，兩者間腎實質(zhì)中多西環(huán)素濃度沒有明顯差別，但腎損傷患者體內(nèi)多西環(huán)素的Clre顯著降低，這與本研究獲得的結果一致，說明在多西環(huán)素清除過程中腎臟起到了重要作用。

本研究利用尿液中藥物濃度-時間數(shù)據(jù)計算得到的β與利用血漿濃度-時間數(shù)據(jù)計算得到的結果非常接近，兩者間無顯著差異，表明以上兩種方法計算結果準確可靠。除速度法以外，還可以應用虧量法計算藥物的尿液藥物動力學參數(shù)，但虧量法需要測定所有經(jīng)尿液排出的藥物總量，需要時間較長，因此本文未采用虧量法計算。大鼠是最常見的實驗動物，常用于藥物的臨床前藥物動力學評價研究，但前述討論部分已表明多西環(huán)素在大鼠體內(nèi)的藥物動力學參數(shù)與其他動物差異較大，因此有必要進一步開展其他動物體內(nèi)多西環(huán)素的尿液藥物動力學研究，以了解多西環(huán)素在其他動物體內(nèi)更全面的藥物動力學特征。

目前，血漿是獸醫(yī)藥物動力學試驗中最常使用的樣品，但采樣過程對動物傷害較大，且采樣時間點過多時會導致動物血量減少，會影響動物健康及藥物處置過程。而相比而言，尿藥法取樣對動物機體沒有損傷，采樣方便，因此尿藥法在獸醫(yī)藥物動力學分析中具有重要的應用前景。目前尿藥法在獸醫(yī)藥物動力學研究中應用較少，本文以大鼠為實驗動物，開展了單次靜脈注射后多西環(huán)素的血漿和尿液藥物動力學研究，結果表明尿藥法在獸醫(yī)藥物動力學研究中完全可行。同時，本文研究結果還表明，多西環(huán)素在大鼠體內(nèi)分布廣泛、消除緩慢；另外，大鼠體內(nèi)多西環(huán)素清除過程中，肝臟和腎臟起到了主要作用，且作用相當。

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Pharmacokinetics Studies of Doxycycline in Rats′Plasma and Urine after Single Intravenous Administration

YANG Fan1，ZHAO Zhen-sheng1，MENG Xiao-bin2，KONG Tao1，WANG Guo-yong1，ZHOU Bian-hua1，HAO Xue-qin1
（1.College of Animal Science and Technology，Henan University of Science and Technology，Luoyang，Henan，471003，China；2.Ringpu（Tianjin）Biological Pharmaceutical Co.，LTD.，Tianjin，300300，China）

Abstract：Seven healthy adult male Wistar rats，with an average weight of 250g，were used to study the pharmacokinetics characteristics of doxycycline in plasma and urine after intravenous administration at 10mg/kg.The doxycycline concentrations in plasma and urine samples were determind by a high performance liquid chromatography method.Then the plasma concentrations versus time data were subjected to compartmental analysis to obtain its pharmacokinetics parameters in plasma，while rate method was used to calculate the pharmacokinetics parameters in urine.The disposition of doxycycline after single intravenous injection was best described by a two-compartment open model.And the main plasma pharmacokinetics parameters were as flows：the volume of distribution（Vd）was（1493.48±243.65）mL/kg，distribution rate constant（α）was（13.70±5.92）h-1，elimination rate constant（β）was（0.15±0.03）h-1，and body clearence（Cl）was（216.06±52.98）mL/h/kg.The pharmacokinetics parameters of doxcycline derived from rate method were listed below：βwas（0.13±0.02）h-1，renal excretion rate constant（ke）was （0.08±0.02）h-1，renal clearence（Clre）was（113.35±18.02）mL/h/kg，and hepatic clearence（Clhe）was（102.71±32.14）mL/h/kg.In conclusion，doxycycline was distributed extensively and eliminated slowly in rats after intravenous administration.Liver and kidney shared the same abilities for elimination of doxcycline from rats.

Key words：doxycycline；rat；plasma；urine；pharmacokinetics

作者簡介：楊 帆（1982-），男，河北盧龍人，講師，博士，主要從事獸醫(yī)藥物代謝動力學研究。

基金項目：河南科技大學博士啟動基金項目（09001677）

收稿日期：2014-12-26

中圖分類號：S859.796

文獻標識碼：A

文章編號：1007-5038（2015）07-0052-05