唐冬梅，付麗新，周　彪，郭政宏，嚴亨秀（西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川成都610041）

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以多層磷酸鈣納米顆粒為載體的O型口蹄疫病毒VP1和VP2基因重組疫苗的構(gòu)建

唐冬梅，付麗新，周彪，郭政宏，嚴亨秀＊
（西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川成都610041）

摘 要：構(gòu)建以多層納米顆粒為載體的O型口蹄疫病毒基因重組疫苗。在GenBank中查詢編碼O型口蹄疫病毒（FMDV）VP1 141-160氨基酸和VP2 1-33氨基酸的核苷酸序列，合成該兩段基因的重組基因并命名為VP1-VP2基因。再通過PCR擴增VP1和VP2基因，并將VP1、VP2及VP1-VP2基因分別插入到真核表達載體pcDNA3.1中，構(gòu)建3種重組真核表達質(zhì)粒（pcDNA3.1-VP1、pcDNA3.1-VP2和pcDNA 3.1-VP1-VP2），并分別對重組質(zhì)粒進行酶切、PCR鑒定及測序分析。將構(gòu)建的重組質(zhì)粒制備成多層磷酸鈣納米顆粒，檢測其粒徑、穩(wěn)定性及體外轉(zhuǎn)染效率。重組質(zhì)粒酶切結(jié)果顯示，基因片段大小與預(yù)期相符；測序顯示與GenBank中相應(yīng)基因序列同源性為100%。制備的多層納米顆粒粒徑約為530nm；在4℃過夜保存后，溶液均勻透明；體外轉(zhuǎn)染HEK293細胞的轉(zhuǎn)染效率在9.6%左右。成功構(gòu)建了以多層磷酸鈣納米顆粒為載體的O型口蹄疫病毒VP1和VP2基因重組質(zhì)粒，為進一步研究該基因疫苗奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：口蹄疫；多層納米顆粒；VP1基因；VP2基因；磷酸鈣；基因疫苗

口蹄疫（Foot-and-mouth disease，F(xiàn)MD）是由口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease virus，F(xiàn)MDV）感染偶蹄動物和人所引起的一種急性、高接觸性的人畜共患傳染?。?］。我國將其列為一類動物傳染病，世界動物衛(wèi)生組織（OIE）將其列為必須報告的動物傳染病［2-3］。口蹄疫病毒屬小RNA病毒科口蹄疫病毒屬［4-5］，其抗原位點由4種結(jié)構(gòu)蛋白構(gòu)成，分別為VP1、VP2、VP3和VP4，其中VP1是唯一能夠產(chǎn)生保護性中和抗體的重要結(jié)構(gòu)蛋白［6-7］。有研究發(fā)現(xiàn)O型FMDV VP1的141-160氨基酸序列具有很好的免疫原性［8］。Fan H等［9］發(fā)現(xiàn)，當把豬或鼠的C3d基因與VP1基因偶連后能顯著提高VP1 DNA疫苗在豚鼠中的免疫反應(yīng)，這也顯示將C3d-VP1的嵌合體作為抗FMDV的新型疫苗具有很好的潛力。目前，對于O型FMDV結(jié)構(gòu)蛋白的研究主要集中在VP1結(jié)構(gòu)蛋白上，而對VP2結(jié)構(gòu)蛋白的研究報道很少。研究發(fā)現(xiàn)，在A型口蹄疫病毒中，VP2的1-33aa可提高VP1肽段的免疫原性，但對于O型口蹄疫中VP2肽段能否增強VP1肽段的免疫原性還未見報道［10］。

當前各國對口蹄疫的防控普遍采用疫苗接種。常規(guī)的口蹄疫疫苗包括滅活疫苗、多肽疫苗和弱毒疫苗等。但是這些疫苗存在免疫原性差、保護能力低、潛在安全風險等缺點。因此，研制高效安全的疫苗已成為口蹄疫防控領(lǐng)域的熱點。其中基因疫苗作為一種新型疫苗受到了高度關(guān)注。如何采用安全有效的載體將外源基因轉(zhuǎn)到受體細胞內(nèi)是基因疫苗發(fā)揮效應(yīng)的關(guān)鍵［11-12］?，F(xiàn)在普遍采用的DNA轉(zhuǎn)染系統(tǒng)包括非病毒載體介導(dǎo)和病毒載體介導(dǎo)，常見的病毒載體主要包括腺病毒、腺相關(guān)病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒等。病毒作為載體轉(zhuǎn)染效率高，但安全性低。因此，非病毒載體獲得了廣泛關(guān)注，其中磷酸鈣納米顆粒更成為研究的熱點。Chowdhury E H等［13］通過構(gòu)建用細胞外基質(zhì)蛋白包裹的DNA與磷酸鈣的復(fù)合物，實現(xiàn)了基因在哺乳動物細胞中的高效率表達。目前，研究中通常使用單層磷酸鈣納米顆粒作為轉(zhuǎn)染載體，通過加入鈣離子、磷酸根離子在DNA表面結(jié)合形成單層磷酸鈣結(jié)晶，從而對DNA形成保護，使其轉(zhuǎn)入機體后不容易被酶類降解掉［14］。Sokolova V V等［15］將DNA與磷酸鈣顆粒多次結(jié)合形成多層納米顆粒，在體外獲得了較好的轉(zhuǎn)染效率。在這些研究基礎(chǔ)上，本試驗嘗試將多層磷酸鈣納米作為FMDV抗原基因的載體，將O型口蹄疫病毒的VP1 141-160aa序列和VP2 1-33aa序列的核苷酸片段進行合成，并插入到pUC57表達載體中，獲得重組質(zhì)粒pUC57-VP1-VP2。將VP1-VP2從測序正確的上述重組質(zhì)粒中酶切下來，插入到真核表達載體pcDNA3.1中，構(gòu)建成重組質(zhì)粒pcDNA3.1-VP1-VP2。再采用PCR分別擴增VP1、VP2，插入到真核表達載體pcDNA3.1中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pcDNA3. 1-VP1和pcDNA3.1-VP2。將3種重組質(zhì)粒用磷酸鈣包裹成多層磷酸鈣納米顆粒，并檢測該顆粒的粒徑大小、穩(wěn)定性；將質(zhì)粒pcDNA3.1-GFP裹成多層磷酸鈣納米顆粒，以檢測此種納米顆粒的細胞轉(zhuǎn)染效率。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1主要試劑 限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和XhoⅠ、DNA連接酶為Fermentas公司產(chǎn)品；瓊脂糖干粉為Invitrogen公司產(chǎn)品；蛋白胨、酵母粉為OXOID公司產(chǎn)品；PCR試劑盒為TaKaRa公司產(chǎn)品；磷酸氫二銨、硝酸鈣、氫氧化鈉為成都科龍化學(xué)試劑廠產(chǎn)品；感受態(tài)細胞DH5α、DNA膠回收試劑盒、無內(nèi)毒素質(zhì)粒小提試劑盒為天根生化科技有限公司產(chǎn)品；胎牛血清（FBS）、胰酶和DMEM培養(yǎng)基為Gibco公司產(chǎn)品；質(zhì)粒pcDNA3.1-GFP、HEK293細胞由四川大學(xué)生物治療國家重點實驗室惠贈。

1.1.2儀器設(shè)備 PCR儀為Eppendorf公司產(chǎn)品；分光光度計為美國Varian公司產(chǎn)品；凝膠成像系統(tǒng)為BioRAD公司產(chǎn)品；pH計為METTER TOLEDO公司產(chǎn)品；粒度儀為英國馬爾文公司產(chǎn)品；熒光倒置顯微鏡為ZEISS公司產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1O型口蹄疫病毒VP1與VP2基因的化學(xué)合成 在GenBank中（AF308157.1）查詢豬O型口蹄疫病毒的VP1的141-160aa序列和VP2 1-33aa序列的核苷酸片段，然后將兩段基因重組并命名為VP1-VP2基因。設(shè)計核苷酸序列（圖1），將該序列委托金唯智公司合成，并重組到pUC57質(zhì)粒中并命名為pUC57-VP1-VP2，交由美吉公司測序鑒定。

圖1　重組基因的核苷酸序列Fig.1 The nucleotide sequence of recombinant gene

1.2.2真核表達載體pcDNA3.1-VP1-VP2的構(gòu)建在5mL含Amp的LB培養(yǎng)基中加入20μL測序驗證的pUC57-VP1-VP2菌液，置于37℃振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。次日，按質(zhì)粒提取試劑盒說明書中的方法小量抽提質(zhì)粒pUC57-VP1-VP2。利用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和XhoⅠ對質(zhì)粒pUC57-VP1-VP2酶切；用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和XhoⅠ對質(zhì)粒pcDNA3.1酶切。分別以10g/L瓊脂糖凝膠電泳后進行膠回收純化。用DNA連接酶連接目的基因和表達載體，然后進行轉(zhuǎn)化，挑菌和提取質(zhì)粒，得到重組真核表達質(zhì)粒pcDNA3.1-VP1-VP2。利用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和XhoⅠ對其酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)10g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定。將酶切鑒定正確的重組質(zhì)粒交由美吉公司測序鑒定。

1.2.3真核表達載體pcDNA3.1-VP1和pcDNA3. 1-VP2構(gòu)建 用軟件Primer 5.0設(shè)計引物。VP1引物序列如下：上游5′-TAGAATTCGGCACCATGACTAACAACGTGAGAGG-3′，下游：5′-GGGCTCGAGTTAGGGCAGAGTTCTTTC-3′。VP2引物序列如下：上游：5′-GGGGAATTCGCCACCATGGA-3′，下游：5′-ATCTCGAGTCAAGTCACCCCGACGCTA-3′。在上、下游分別引入EcoRⅠ酶切位點和XhoⅠ酶切位點（下劃線部分），并委托金唯智生物公司合成。分別PCR擴增VP1 141-160氨基酸序列的核苷酸片段和VP2 1-33氨基酸序列的的核苷酸片段。PCR擴增反應(yīng)體系為50μL：其中ddH2O 34.75μL，25 mmol/L MgCl23μL，2.5mmol/L dNTP mix 4μL，10×PCR buffer 5μL，Taq polymerase 0.25μL，上下游引物各1μL，取1μL質(zhì)粒pUC57-VP1-VP2作為模板。PCR擴增條件：95℃3 min；95℃0.5 min，VP1 64℃0.5min，VP2 65℃0.5min，72℃20s，30個循環(huán)；72℃10min，最后于12℃終止反應(yīng)。擴增產(chǎn)物用10g/L瓊脂糖凝膠電泳分離并膠回收純化。用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、XhoⅠ分別對VP1基因、VP2基因和質(zhì)粒pcDNA3.1雙酶切，酶切產(chǎn)物電泳后進行膠回收純化。用DNA連接酶連接目的基因和表達載體，然后進行轉(zhuǎn)化，挑菌和提取質(zhì)粒，得到重組真核表達質(zhì)粒pcDNA3.1-VP1和pcDNA3.1-VP2。然后利用酶EcoRⅠ和XhoⅠ對pcDNA3.1-VP1和pcDNA3.1-VP2分別進行酶切，再將酶切產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳鑒定。對上述重組質(zhì)粒進行PCR鑒定。將酶切鑒定正確的重組質(zhì)粒交由美吉公司測序鑒定。

1.2.4多層納米顆粒制備 參照文獻［15］，制備多層納米顆粒（圖2）。配制18mmol/L Ca（NO3）2溶液，10.8mmol/L（NH4）2HPO4溶液，用0.1mmol/ L NaOH溶液將pH均調(diào)為9。所有溶液過濾除菌。在無菌玻璃圓底燒瓶中加入Ca（NO3）2和（NH4）2HPO4預(yù)混30s，取50μL混合液與10μg DNA混合，制成負載DNA的磷酸鈣納米顆粒溶液，進行磁力攪拌，逐滴加入25μL Ca（NO3）2溶液，隨后再逐滴加入25μL（NH4）2HPO4溶液，從而在上述顆粒表面形成磷酸鈣結(jié)晶。再次加入10μg質(zhì)粒DNA混合，磁力攪拌3h，形成多層磷酸鈣納米顆粒。

圖2　多層納米顆粒的結(jié)構(gòu)示意圖Fig.2 Schematic representation of multi-shell calcium phosphate/DNA nanoparticles

1.2.5多層納米顆粒粒徑和穩(wěn)定性檢測 將3種已構(gòu)建成功的真核表達載體（pcDNA3.1-VP1、pcDNA3.1-VP2和pcDNA3.1-VP1-VP2）按上述方法制備成多層磷酸鈣納米顆粒。用粒度儀檢測其粒徑大小。觀察溶液顏色、氣味、濁度、沉淀物等物理特性，再通過于4℃靜置過夜后溶液的變化檢測其穩(wěn)定性。試驗重復(fù)3次。

1.2.6多層納米顆粒體外轉(zhuǎn)染細胞 用胰酶消化HEK293細胞，鋪于24孔板中，每孔細胞數(shù)為2×104個。將pcDNA3.1-GFP按2.4所述方法包裹成多層磷酸鈣納米顆粒。按文獻［16］方法，將包裹完成的多層納米顆粒按每孔2μg DNA的量加入到細胞中，同時加500μL含100mL/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基。設(shè)立陰性對照組，對照組每孔加入2μg沒有包裹成納米顆粒的裸露質(zhì)粒pcDNA3.1-GFP，加入500μL培養(yǎng)基。12h后，更換新培養(yǎng)基；轉(zhuǎn)染48h后，用熒光倒置顯微鏡觀測轉(zhuǎn)染效率。每組細胞鏡下隨機選取5個視野，記錄每個視野的轉(zhuǎn)染效率并統(tǒng)計。

2　結(jié)果

2.1重組質(zhì)粒pUC57-VP1-VP2的構(gòu)建與測序分析

將VP1 141-160aa和VP2 1-33aa的核苷酸序列重組，構(gòu)建質(zhì)粒pUC57-VP1-VP2，并對其測序鑒定。測序結(jié)果用Blast軟件比對，結(jié)果顯示質(zhì)粒pUC57-VP1-VP2中合成的VP1基因序列（VP1）與在GenBank上已發(fā)表的豬O型口蹄疫病毒株（DQ248888.1）的目的核苷酸序列同源性為100%；合成的VP2基因序列（VP2）與在GenBank上已發(fā)表的豬O型口蹄疫病毒株（AF308157.1）的目的核苷酸序列同源性為100%（圖3）。

圖3　重組質(zhì)粒中VP1和VP2基因序列Blast比對結(jié)果Fig.3 The result of Blast about VP1and VP2gene sequences

2.2重組質(zhì)粒pcDNA3.1-VP1-VP2酶切分析鑒定

利用酶EcoRⅠ、XhoⅠ對已經(jīng)測序鑒定正確的重組質(zhì)粒pUC57-VP1-VP2酶切，回收酶切產(chǎn)物后，插入質(zhì)粒pcDNA3.1構(gòu)建重組質(zhì)粒pcDNA3.1-VP1-VP2。利用酶EcoRⅠ和XhoⅠ對pcDNA3.1-VP1-VP2進行雙酶切后電泳鑒定。從電泳中獲得228bp的DNA片段，與目的基因片段VP1-VP2 （228bp）大小相符（圖4）。這表明VP1-VP2基因片段已被成功重組到該真核表達載體pcDNA3.1中。

2.3重組質(zhì)粒pcDNA3.1-VP1和pcDNA3.1-VP2的酶切分析和PCR鑒定

重組質(zhì)粒pcDNA3.1-VP1和pcDNA3.1-VP2經(jīng)酶EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切后，得到大小約為84 bp或123bp DNA片段，與預(yù)期結(jié)果相符（圖5）。對這兩種進行PCR鑒定，獲得大小約為84bp或123bp片段，與預(yù)期結(jié)果相符（圖6）。說明VP1與VP2成功插入到真核表達載體pcDNA3.1中。

圖4　酶切鑒定重組質(zhì)粒pcDNA3.1-VP1-VP2Fig.4 Identification of recombinant plasmid pcDNA3.1-VP1-VP2by enzyme digestion

圖5　重組質(zhì)粒pcDNA3.1-VP1和pcDNA3.1-VP2的酶切分析Fig.5 Identification of the recombinant plasmid pcDNA3.1-VP1 and pcDNA3.1-VP2by enzyme digestion

圖6　重組質(zhì)粒pcDNA3.1-VP1和pcDNA3.1-VP2 PCR鑒定Fig.6 Identification of the recombinant plasmid pcDNA3.1-VP1 and pcDNA3.1-VP2by PCR

2.4重組質(zhì)粒測序分析

取經(jīng)酶切正確的質(zhì)粒pcDNA3.1-VP1、pcDNA3.1-VP2及pcDNA3.1-VP1-VP2送公司測序鑒定，所得基因序列經(jīng)Blast軟件比對。結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒中VP1基因序列與在GenBank上已發(fā)表的豬O型口蹄疫病毒株（DQ248888.1）的目的核苷酸序列同源性為100%；重組質(zhì)粒中VP2基因序列與在GenBank上已發(fā)表的豬O型口蹄疫病毒株（AF308157.1）的目的核苷酸序列同源性為100%。序列比對結(jié)果與圖3所示相同。

2.5多層納米顆粒的制備及粒徑和穩(wěn)定性檢測

將構(gòu)建成功的真核表達載體pcDNA3.1-VP1、pcDNA3.1-VP2、pcDNA3.1-VP1-VP2制備成多層磷酸鈣納米顆粒復(fù)合體。該復(fù)合體無色無氣味，無沉淀且均勻透明。該多層磷酸鈣納米顆粒復(fù)合體置于4℃過夜后，復(fù)合體均勻透明，無沉淀生成。用馬爾文納米粒度儀檢測該納米顆粒粒徑，檢測結(jié)果顯示制備的多層磷酸鈣納米顆粒粒徑在530nm左右。2.6 多層磷酸鈣納米顆粒的轉(zhuǎn)染效率

將質(zhì)粒pcDNA3.1-GFP包裹成多層磷酸鈣納米顆粒，轉(zhuǎn)染HEK 293細胞48h后，在熒光顯微鏡下檢測轉(zhuǎn)染效率。其轉(zhuǎn)染效率約為9.60%± 0.58%；而用裸露的熒光質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞，鏡下僅觀察到少量熒光，轉(zhuǎn)染率在2.00%±0.70%左右，見圖7。結(jié)果顯示，多層磷酸鈣納米顆粒載體可攜帶DNA進入細胞。

3　討論

口蹄疫作為危害畜牧業(yè)的重大傳染病，各國都在加強對其的研究力度，尤其新型基因疫苗的研發(fā)備受關(guān)注。在對FMDV的研究中發(fā)現(xiàn)，O型口蹄疫病毒VP1的141-160位氨基酸所處的G-H環(huán)是重要的保護性抗原位點［17］。也有研究發(fā)現(xiàn)，在A型口蹄疫病毒中VP2 1-33位氨基酸能夠增強VP1肽段的免疫原性［8］。但在O型口蹄疫免疫治療中，VP2能否增強VP1的免疫原性，還未見報道。

Graham F L等［18］在早期研究中發(fā)現(xiàn)磷酸鈣可作為載體將外源DNA轉(zhuǎn)入細胞。一定濃度的氯化鈣與DNA結(jié)合后，在電荷作用下可與磷酸根離子在DNA表面形成磷酸鈣結(jié)晶，從而包裹DNA，形成納米顆粒。細胞通過內(nèi)吞作用將磷酸鈣納米顆粒攝取進入細胞，細胞內(nèi)的囊泡將其攝取并與溶酶體融合，再將磷酸鈣-DNA復(fù)合體釋放到細胞質(zhì)內(nèi)。DNA以這種方式負載進入體內(nèi)后，可以大大降低DNA在細胞內(nèi)的降解率［19］。Sokolova V V等［15］發(fā)現(xiàn)將鈣離子、磷酸根離子與DNA制成多層磷酸鈣顆粒后，可提高體外細胞轉(zhuǎn)染效率。

圖7　質(zhì)粒pcDNA3.1-GFP轉(zhuǎn)染HEK293細胞Fig.7 HEK293cells transfected with multi-shell CaPi-pcDNA3.1-GFP DNA

本研究將O型FMDV的VP1 141-160aa的核苷酸序列和VP2 1-33aa的核苷酸序列進行成功重組，并利用質(zhì)粒pcDNA3.1構(gòu)建3種真核表達載體pcDNA3.1-VP1、pcDNA3.1-VP2和pcDNA3.1-VP1-VP2。對3種質(zhì)粒進行酶切，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定發(fā)現(xiàn)酶切所獲的DNA片段與目的基因大小一致。再將酶切鑒定正確的質(zhì)粒進行PCR鑒定，獲得對應(yīng)的DNA片段。將3種重組質(zhì)粒進行測序鑒定，測序結(jié)果顯示重組質(zhì)粒中的外源基因序列與GenBank中O型口蹄疫病毒基因序列比對，同源性為100%，說明VP1、VP2和VP1-VP2已分別插入到pcDNA3.1質(zhì)粒中，成功構(gòu)建了重組真核表達載體。將構(gòu)建的3種真核表達載體包裹為多層磷酸鈣納米顆粒，檢測其粒徑、穩(wěn)定性；將質(zhì)粒pcDNA3.1-GFP裹成多層磷酸鈣納米顆粒，以檢測此種納米顆粒體外轉(zhuǎn)染細胞效率。試驗結(jié)果顯示該納米顆粒粒徑大小約為530nm，粒徑小于600nm，易于被細胞內(nèi)吞。置于4℃過夜后，該顆粒復(fù)合體均勻透明，無沉淀生成，顯示該納米顆粒穩(wěn)定性較好。通過轉(zhuǎn)染HEK293細胞，發(fā)現(xiàn)此種顆粒復(fù)合體轉(zhuǎn)染效率約為9.6%，顯示其能有效的攜帶DNA進入細胞內(nèi)。

綜上所述，本研究獲得了O型FMDV VP1 141-160aa和VP2 1-33aa的核苷酸片段的重組質(zhì)粒，并將其包裹成有效轉(zhuǎn)染細胞的多層磷酸鈣納米顆粒，為O型口蹄疫新型重組基因疫苗的進一步研究奠定了基礎(chǔ)。本研究中構(gòu)建的O型口蹄疫病毒VP1和VP2重組基因多層磷酸鈣納米顆粒在體外獲得了一定的轉(zhuǎn)染效率，而在體內(nèi)多層磷酸鈣納米顆粒能否有效負載FMDV免疫原性DNA，VP1和VP2能否高效表達，以及VP2是否增強VP1的免疫原性，都將是我們進一步研究的內(nèi)容。

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Construction of a Recombinant VP1 and VP2 of Type O Foot-and-Mouth Disease Virus DNA Vaccine Coated with Multi-shell Calcium Phosphate Nanoparticles

TANG Dong-mei，F(xiàn)U Li-xin，ZHOU Biao，GUO Zheng-hong，YAN Heng-xiu
（College of Life Sicence and Technology，Southwest University for Nationalities，Chengdu，Sichuan，610041，China）

Abstract：A recombinant gene vaccine containing VP1and VP2genes which encoding VP1 141-160and VP2 1-33aa of type O foot-and-mouth disease virus coated multi-shell calcium phosphate nanoparticles was constructed.The VP1and VP2genes encoding VP1 141-160and VP2 1-33aa of type O FMDV were synthesized and linked as recombinant VP1-VP2gene，whose sequences came from the Genbank.Then the VP1gene and VP2gene were amplified by PCR from the recombinant VP1-VP2gene.After that，the VP1 gene，VP2gene and the recombinant VP1-VP2gene were constructed separately into eukaryotic expression vector pcDNA3.1as recombinant plasmids pcDNA3.1-VP1，pcDNA3.1-VP2and pcDNA3.1-VP1-VP2. Then the recombinant plasmids were identified by enzymatic digestion，PCR and sequence analysis.At last，the plasmids DNA were encapsulated in multi-shell calcium phosphate nanoparticles.And the diameters，stability and transfection efficiency of these nanoparticles were detected in vitro.The enzymatic digestion and PCR assay of the recombinant plasmids indicated that the exogenous gene was cloned successfully into expression vector pcDNA3.1.Sequence analysis indicated the recombinant plasmids were 100% homology with the sequence of FMDV in GenBank.The average diameters of conducted nanoparticles were about 530nm detected by particle sizer.The stability analysis showed that the nanoparticles were transparent，well-distributed and deposit-free after stored at 4℃for 24hours.The transfection efficiency of the CaPi-pDNA-GFP on human embryonic kidney 293（HEK 293）cells in vitro was about 9.6%.The recombinant new gene plasmid embedded multi-shell calcium phosphate nanoparticles was successfully constructed.These results encouraged further research for the development of DNA vaccines against FMDV" O" and provided the basis of research for DNA vaccines.

Key words：Foot-and-mouth disease virus；multi-shell nanoparticle；VP1gene；VP2gene；calcium phosphate；DNA vaccine

作者簡介：唐冬梅（1988-），女，四川眉山人，碩士研究生，主要從事動物免疫學(xué)研究。＊通訊作者

基金項目：西南民族大學(xué)研究生創(chuàng)新型科研項目資助（CX2014SZ86）

收稿日期：2015-01-20

中圖分類號：S852.659.6；Q786

文獻標識碼：A

文章編號：1007-5038（2015）07-0001-06