趙國華， 方雅恒， 陳 貴

(1.嘉興學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院，浙江嘉興 314001; 2.嘉興市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境研究室，浙江嘉興 314016)

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生物發(fā)酵床養(yǎng)豬墊料中營養(yǎng)成分和微生物群落研究

趙國華1， 方雅恒1， 陳 貴2*

(1.嘉興學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院，浙江嘉興 314001; 2.嘉興市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境研究室，浙江嘉興 314016)

[目的] 探討發(fā)酵床養(yǎng)豬模式下不同使用年限微生物群落的變化以及不同使用時間、不同深度的發(fā)酵床墊料中墊料組分的變化。[方法] 采用常規(guī)分析方法測定樣品中的營養(yǎng)成分含量，對不同年限樣品中微生物分離提純后，結(jié)合16S rRNA分子生物學(xué)鑒定對其微生物群落進(jìn)行分析。[結(jié)果] 隨著發(fā)酵床使用時間的延長，墊料中的總氮、總磷、鉀、鈣、粗灰分和粗蛋白含量均顯著增加，而水分含量降低不明顯；使用1年和2年的墊料從上層到下層總氮、總磷、總鉀和鈣的濃度逐漸降低，不同使用時間、不同深度發(fā)酵床墊料中糞尿組水分、總氮、總磷、鉀、鈣、粗灰分、粗蛋白均高于其他組。隨著使用年限的增加，豬生物發(fā)酵床墊料中微生物群落的多樣性有降低的趨勢。芽孢桿菌屬細(xì)菌和梭菌屬細(xì)菌在1年期樣品和2年期樣品中都是優(yōu)勢菌，對豬生物發(fā)酵床墊料中有機質(zhì)的降解發(fā)揮著重要的作用。[結(jié)論]該研究可為墊料的資源化合理利用提供理論依據(jù)。

發(fā)酵床；微生物；多樣性；成分

規(guī)?；酿B(yǎng)殖推動了我國農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，但是隨之帶來的環(huán)境污染問題也越來越引起人們的重視。發(fā)酵床養(yǎng)殖作為新型養(yǎng)殖技術(shù)，自從引入我國后被大力地推廣和使用，為解決畜牧環(huán)境污染問題帶來了新途徑。發(fā)酵床養(yǎng)豬技術(shù)是基于控制畜禽糞便排放與污染的一種新型環(huán)保型養(yǎng)殖技術(shù)，將鋸末、稻殼、秸稈等材料接種土著微生物菌種，堆積發(fā)酵后用作墊料，在經(jīng)過改造的豬舍內(nèi)加入上述有機墊料制成發(fā)酵床。在發(fā)酵床上養(yǎng)豬，糞尿會被墊料吸附，微生物降解其中的有毒有害物質(zhì)，同時利用產(chǎn)生的生物熱殺滅糞便中的腸道寄生蟲卵，從而達(dá)到降低養(yǎng)殖舍內(nèi)有害氣體濃度、減少養(yǎng)殖污染排放以及提高豬的生長性能的目的[1-3]。發(fā)酵床養(yǎng)殖技術(shù)的核心是墊料中微生物群落的活動。筆者通過監(jiān)測嘉興某發(fā)酵床養(yǎng)豬場生長肥育豬舍使用1年2年的不同深度發(fā)酵床墊料中營養(yǎng)物質(zhì)成分(水、粗蛋白、粗灰分、鈣)的變化以及氮、磷、鉀含量的變化，探索墊料中這些元素的累積情況及動態(tài)變化規(guī)律，并通過對豬生物發(fā)酵床樣品進(jìn)行基因組DNA提取、16S rRNA擴(kuò)增、測序分析等，了解豬生物發(fā)酵床微生物的動態(tài)變化規(guī)律，以期為墊料的資源化合理利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料發(fā)酵床樣品均來由金鴻牧業(yè)有限公司提供。第1年和第2年的發(fā)酵床，采用對角線采樣法分別采集5個點的樣品(其中包含糞尿區(qū))[3]，每個點分別從上至下用刀取0～15 cm(上層)、30～40 cm(中層)和60～70 cm(下層)的墊料樣品，同一深度各2.0 kg樣品混合，然后再采用四分法取500 g，備用。糞尿點各層單獨取樣各2.0 kg，單獨混勻?；旌戏椒ǎ簩⑷〉玫拿繉訅|料樣品混在一起，用四分法選取500 g，置于自封袋中密封，防止水分揮發(fā)，置于有冰袋的保溫盒中，貼上標(biāo)簽迅速帶回實驗室備用。

1.2 墊料的測定指標(biāo)及方法水分含量測定：采集回的墊料用四分法選取500 g，先將墊料置于65 ℃烘箱烘至恒溫，用飼料粉碎機粉碎后通過40目篩，混勻樣品，裝入廣口瓶中貼上標(biāo)簽保存，待進(jìn)行其他各項指標(biāo)測定。墊料中水分、粗蛋白和粗灰分含量的測定方法參考《土壤農(nóng)業(yè)化學(xué)分析方法》[4]。全氮和全磷含量分別采用半微量凱氏定氮法和鉬黃顯色光度法測定；全鉀含量采用原子吸收分光光度法測定。

1.3 培養(yǎng)基牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏3.0 g、蛋白胨10.0 g、氯化鈉50.0 g、瓊脂20 g，蒸餾水溶解定容至1 L，調(diào)節(jié)pH至7.6，于121 ℃下高壓滅菌30 min。

1.4 微生物的分離、純化及保存試驗中分別用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、高氏一號培養(yǎng)基從稀釋的豬生物發(fā)酵床樣品中選擇性地分離細(xì)菌和放線菌，以供細(xì)菌16S rDNA分子生物學(xué)鑒定。

1.5 細(xì)菌16SrDNA片段的擴(kuò)增以細(xì)菌通用引物 27F：5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′，1492R：5′-TACGGT TAC CTT GTT ACG ACTT-3′為引物，豬生物發(fā)酵床分離培養(yǎng)的細(xì)菌基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系(50 μl)：25 μl 2×MightyAmp Buffer Ver.2(含Mg2+、dNTP plus)，正反向引物各15 pmol，基因組DNA(直接挑菌作為基因組DNA模板)，MightyAmp DNA Polymerase 1 μl。

PCR反應(yīng)程序：98 ℃預(yù)變性2 min；98 ℃變性10 s，60 ℃退火15 s，68 ℃延伸1.5 min， 30個循環(huán)；最后68 ℃延伸10 min。

PCR反應(yīng)結(jié)束后，取PCR產(chǎn)物5 μl和2 μl上樣緩沖液混勻后點樣于濃度1%的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測，于90 V電壓下電泳30 min。電泳結(jié)束后，立即在瓊脂糖凝膠成像系統(tǒng)下觀察，拍照并存盤。

1.6 細(xì)菌RFLP酶切分型分析克隆后，對陽性克隆子進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后使用限制性內(nèi)切酶對擴(kuò)增產(chǎn)物酶切，酶切DNA片段進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，所得DNA帶型圖譜通過凝膠分析軟件進(jìn)行比對，然后選取不同的操作單元，并將對應(yīng)的陽性克隆子送交測序公司測序。

1.7 Blast比對將測序結(jié)果在核酸數(shù)據(jù)庫(GenBank)中進(jìn)行Blast。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同深度發(fā)酵墊料中水分、粗蛋白和粗灰分含量的變化由表1可知，2年間不同深度發(fā)酵床墊料中，糞尿組水分含量均顯著高于其他組。使用第1年和第2年的發(fā)酵床墊料水分含量變化差異不顯著，這可能與發(fā)酵床墊料管理得好及定期深翻墊料有關(guān)。隨著墊料深度的增加，水分含量逐漸降低。墊料中的粗灰分主要來源于墊料組分及豬不斷排泄的糞污。該試驗結(jié)果表明，隨著墊料深度的增加，墊料粗灰分含量逐漸下降，這主要是由于豬的糞尿主要集中在表層的緣故。對比第1年和第2年的數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，墊料中粗灰分的濃度逐漸升高，表明粗灰分有累積作用。糞尿組各層顯著高于其他組。隨著墊料深度的增加，墊料中粗蛋白的濃度逐漸降低，這是由于糞尿中含有一定量的含氮化合物，因而墊料表層粗蛋白含量最高。隨著墊料使用時間的延長，墊料中粗蛋白的濃度逐漸升高，表明粗蛋白具有累積作用。糞尿組顯著高于其他組。

表1 不同使用時間、不同深度發(fā)酵床墊料中水分、粗蛋白、粗灰分含量的變化 %

樣品來源第1年水分粗灰分粗蛋白第2年水分粗灰分粗蛋白糞尿上65.5426.501.6557.8634.061.70糞尿中54.6524.950.9152.1832.051.03糞尿下49.6322.750.6847.3724.530.69其他上50.3421.590.9949.0130.051.11其他中45.8718.940.7544.4727.090.84其他下43.1518.040.6342.9723.860.65

2.2 2年間不同深度發(fā)酵床墊料中總氮、總磷、總鉀和鈣含量發(fā)酵床墊料中的總氮、總磷、總鉀和鈣含量主要來源于2個方面：一方面是墊料中的鋸末、秸稈和稻殼，另一方面是豬糞污。飼料中的營養(yǎng)成分被豬消化吸收后，排泄物主要是以糞污的形式不間斷排泄。由表2可知，墊料中總氮、總磷、總鉀和鈣的濃度隨墊料使用時間的延長逐漸升高。隨著墊料深度的增加，墊料中總氮、總磷、總鉀和鈣的濃度逐漸降低。糞尿組上、中、下層總氮、總磷、總鉀、鈣的濃度均明顯高于其他組上、中、下層。這表明豬的習(xí)性是群居，這不利于充分利用發(fā)酵床的功能特性。該試驗結(jié)果與其他研究結(jié)果一致[5-7]。

表2 不同使用時間、不同深度發(fā)酵床墊料中氮、磷、鉀和鈣含量的變化 %

2.3 微生物總基因組DNA將所采集到的樣品經(jīng)過前處理后，提取微生物總基因組DNA并進(jìn)行純化，再進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測。從圖1可以看出，微生物總基因組DNA完整、無拖尾和雜帶，能滿足后續(xù)試驗要求。

2.4 保育期不同年限樣品的16SrDNA序列比對結(jié)果將保育1年、保育2年的樣品分別與GeneBank 進(jìn)行Blastn序列比對，發(fā)現(xiàn)保育期1年的樣品微生物(相似度達(dá)99%)主要有：芽胞桿菌屬(Bacillussp)、產(chǎn)堿桿菌屬(Alcaligenessp.)、破傷風(fēng)桿屬(Clostridiumsp.)，藤黃單胞菌屬(Luteimonassp.)、外硫紅螺菌屬(Ectothiorhodospriasp.)、海桿菌屬(Marinobactersp.)，假單胞菌屬(Pseudomonassp)和索氏菌屬(Thauerasp)等。保育期2年的樣品中微生物(相似度達(dá)99%)主要有：芽胞桿菌屬(Bacillussp.)、破傷風(fēng)桿屬(Clostridiumsp.)、Uncultured bacterium，細(xì)桿菌屬(Microbacteriumsp)、節(jié)細(xì)菌屬(Arthrobactersp)、鏈霉菌屬(Streptomycessp)、芽胞八疊球菌屬(Sporosarcinasp.)、寡養(yǎng)單胞菌屬(Stenotrophomonassp.)等。生物發(fā)酵床保育1年樣品中與芽孢桿菌

圖1 微生物總基因組DNA的提取結(jié)果

屬(Bacillussp．)相關(guān)的克隆子數(shù)有36個，占所有克隆子數(shù)的28.57%；與破傷風(fēng)桿屬(Clostridiumsp．)相關(guān)的克隆子有32，占所有克隆子的35.40%，因此樣品中芽孢桿菌屬和破傷風(fēng)桿屬占優(yōu)勢。生物發(fā)酵床保育2年期樣品中克隆子較多的序列歸屬于芽孢桿菌屬和破傷風(fēng)桿屬有克隆子27個和23個，分別占21.60%和18．40%，在樣品中占有優(yōu)勢，為優(yōu)勢菌。

芽孢桿菌屬(Bacillus)和梭菌屬(Clostridium)在生物發(fā)酵床保育期樣品中發(fā)揮著重要的作用，與其他研究結(jié)果相一致[8-9]。另外，有幾個序列與已知的細(xì)菌序列沒有任何的相似性，它們在生物發(fā)酵床中的作用還需要進(jìn)一步研究。

3 小結(jié)

(1)不同使用時間、不同深度發(fā)酵床墊料中，糞尿組水

分、粗灰分、粗蛋白、總氮、總磷、總鉀和鈣含量均顯著高于其他組。

(2)從豬生物發(fā)酵床樣品中分離到的16SrDNA序列可以看出，隨著發(fā)酵床使用年限的增加，發(fā)酵床內(nèi)的微生物群落也在不斷地更替演變，保育2年時微生物群落的減少，說明隨著使用年限的增加，豬生物發(fā)酵床墊料內(nèi)的微生物群落的多樣性有降低的趨勢。在保育期樣品中，芽孢桿菌屬和梭菌屬始終是獨立的的分支，對發(fā)酵床物質(zhì)代謝和能量代謝發(fā)揮著巨大的作用。

[1] 畢小艷，張彬．發(fā)酵床生態(tài)養(yǎng)殖模式在養(yǎng)豬生產(chǎn)中的應(yīng)用研究進(jìn)展[J]．中國動物保健，2010(9)：50-51．

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Study on the Nutritional Components and Microbial Community in the Beddings of Pig Raising by Bio-fermentation Bed

ZHAO Guo-hua1, FANG Ya-heng1, CHEN Gui2*

(1.College of Biological and Chemical Engineering, Jiaxing University, Jiaxing, Zhejiang 314001; 2.Laboratory for Agricultural Ecological Environment in Jiaxing Academy of Agricultural Sciences, Jiaxing, Zhejiang 314016)

[Objective] The research aimed to discuss the changes of microbial community with different years under the swine raising model of fermentation bed and the components in the beddings of fermentation bed with different depth in different years.[Method] The contents of nutritional components in the samples were determined by using conventional analysis method.The microbe were isolated and purified from samples with different years.Based on 16S rRNA molecular biological identification, the microbial community was analyzed.[Result] With the prolonging the using years of fermentation bed, the contents of total nitrogen, total phosphorus, K, Ca, crude ash and crude protein in the beddings were significantly increased, but the water content had no obvious decrease.The concentrations of total nitrogen，total phosphors, total K and Ca in the bedding with one using years and two using years were gradually decreased from the upper layer to the lower layer.The contents of water, total nitrogen，total phosphors, K, Ca, crude ash and crude protein in the beddings with different depth and different using years in the group of feces and urine were higher than that in other groups.With the increasing the using years, the diversity of microbial community in the beddings of swine micro-fermentation bed had the trend of decreasing.Bacillus bacteria and Clostridium bacteria were dominant bacteria in the first and second year of samples, which played an important role in depredating organic matter in micro-fermentation beddings.[Conclusion] The research could provide theoretical basis for the rational utilization of beddings resources.

Bio-fermentation bed; Microbial community; Diversity; Nutritional components

嘉興市科技計劃項目(2011AY1043)。

趙國華(1980- )，女，山西運城人，講師，博士，從事固體廢物處理與資源化研究。*通訊作者，助理研究員，博士，從事農(nóng)業(yè)生態(tài)方面的研究。

2015-01-22

S 188+.4

A

0517-6611(2015)08-098-02