解銀麗，馬 琪，李志勇

(中國農業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所，家畜疫病病原生物學國家重點實驗室，甘肅蘭州 730046)

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O型口蹄疫病毒衣殼蛋白在昆蟲細胞中的表達及其抗原性鑒定

解銀麗，馬 琪，李志勇*

(中國農業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所，家畜疫病病原生物學國家重點實驗室，甘肅蘭州 730046)

為構建并表達O型口蹄疫病毒( Foot-and-mouth disease virus，FMDV)的空衣殼蛋白的重組桿狀病毒并鑒定其抗原性。以質粒pMD19-P12A3C為模板，擴增出編碼O型FMDV衣殼蛋白前體P12A及其蛋白酶3C的P12A3C基因，插入至桿狀病毒轉移載體pFastBacDual PH啟動子下，構建出重組轉移載體pFastBacDual-P12A3C，并轉化DH10BacTM大腸桿菌感受態(tài)細胞，構建重組轉座子Bacmid-P12A3C，將其轉染Sf9細胞，獲得表達O型FMDV衣殼蛋白的重組桿狀病毒rBac-P12A3C。增殖重組桿狀病毒然后用其感染Sf9細胞，最后通過間接免疫熒光檢測外源蛋白的表達。結果表明，表達產物能夠被O型FMDV VP1多克隆抗體識別，并具有良好的反應原性，表明表達O型FMDV衣殼蛋白的重組桿狀病毒rBac-P12A3C構建成功。該研究為進一步研究O型FMDV空衣殼的體外組裝提供前期實驗材料，并為后期研制出口蹄疫的基因工程亞單位疫苗奠定基礎。

O型口蹄疫病毒；衣殼蛋白；重組桿狀病毒

口蹄疫(Foot-and-mouth disease，FMD)是口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus，FMDV)引發(fā)牛、羊、豬等偶蹄動物易感染的一種動物疫病，其傳播速度快、感染率高[1-2]，被世界動物衛(wèi)生組織(Office International Des Epizooties，OIE)列為必須上報的傳染病，被我國列為一類動物傳染病[3-4]。FMDV屬于小RNA病毒科口蹄疫病毒屬，是單股的正鏈RNA病毒，基因組全長約8.5 kb，包含編碼1個多聚蛋白的開放閱讀框(ORF)。其中，在非結構蛋白3C蛋白酶作用下，P1結構蛋白被解離成單體蛋白VP0、VP3、VP1，然后VP0進一步解離成單體蛋白VP4 和VP2，FMDV基因組 RNA 能與解離后的單體蛋白組裝成為成熟的146S病毒粒子[1]。接種疫苗是FMD防控最為有效的措施，在控制FMD暴發(fā)的過程中，口蹄疫滅活疫苗起到了極為重要的防控作用，但是由于其在生產的過程中需要大量增殖FMD強毒，存在散毒的風險。據報道，FMDV空衣殼蛋白75S具有與完整FMDV 146S粒子非常相似的抗原特性，可以引起與完整FMDV病毒粒子極其相似的免疫反應，由于病毒空衣殼不含核酸成分，安全性好，不存在散毒風險[5]。因此，研制FMDV空衣殼疫苗顯得極為重要。

目前，桿狀病毒表達系統(tǒng)Bac-to-Bac是桿狀病毒表達系統(tǒng)中最常用的一種，具有高效、快速的特性，其表達的外源目的蛋白，可以在細胞內完成翻譯后的修飾和加工，因此生物功能和天然的目的蛋白更為接近。筆者采用桿狀病毒表達系統(tǒng)Bac-to-Bac，成功構建并表達了O型FMDV衣殼蛋白的重組桿狀病毒，然后鑒定了所表達衣殼蛋白的抗原性，以期為研究基因工程亞單位疫苗奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 病毒和細胞質粒pMD19-P12A3C為家畜疫病病原生物學國家重點實驗室構建并保存；Sf9昆蟲細胞為家畜疫病病原生物學國家重點實驗室保存。

1.2 質粒、抗體及試劑pFastBacDual載體、DH10BacTM感受態(tài)細胞、轉染試劑CellfectinII Reagent、細胞培養(yǎng)基Sf900-II SFM、PureLinkTMHipure Plasmid Miniprep Kit、購自Invitrogen公司；JM109感受態(tài)細胞、GXL高保真DNA聚合酶及DNA Marker等均購自大連寶生物公司；T4 DNA連接酶、限制性核酸內切酶Hind III、SpeI購自美國NEB公司；切膠回收試劑盒、PCR清潔試劑盒、質粒提取試劑盒，均購自杭州愛思進生物技術有限公司；FITC標記羊抗兔IgG，購自中杉金橋公司。

1.3 引物設計與合成根據家畜疫病病原生物學國家重點實驗室保存質粒pMD19-P12A3C中基因序列設計1對擴增P12A3C基因的特異性引物，上游引物P12A3CF：5′-CGCAAGCTTGCCACCATGGGCGCCGGGCAATCCA-3′和下游引物P12A3CR：5′-CGCACTAGTTCACTCGTGGTGTGGTTC-3′，下劃線分別為Hind III和SpeⅠ限制性內切酶酶切位點。M13通用引物為Invitrogen公司推薦的通用引物，引物由蘇州金唯智生物技術有限公司合成。

1.4 重組轉移載體pFastBacDual-P12A3C的構建以質粒pMD19-P12A3C為模板，利用特異性引物P12A3CF和P12A3CR在GXL高保真DNA聚合酶作用下進行PCR擴增P12A3C基因，用限制性內切酶SpeI和Hind III分別將PCR產物P12A3C和供體質粒pFastBacDual雙酶切后回收，然后用T4連接酶將P12A3C切膠回收產物與線性化的載體pFastBacDual連接，以使P12A3C定向插入到供體質粒pFastBacDual。然后，轉化JM109感受態(tài)細胞，利用α-互補篩選、酶切鑒定與PCR鑒定得到疑似陽性克隆，命名為pFastBacDual-P12A3C，由蘇州金唯智生物技術有限公司對疑似陽性克隆進行測序。

1.5 重組轉座子Bacmid-P12A3C的構建將重組轉移pFastBacDual-P12A3C轉化入DH10BacTM感受態(tài)細胞，然后利用四環(huán)霉素、慶大霉素、卡那霉素以及α-互補篩選出重組的轉座子Bacmid-P12A3C。同時，將無外源基因插入的供體質粒pFastBacDual轉化DH10BacTM感受態(tài)細胞篩選出重組轉座子Bacmid-NC為陰性對照。用PureLinkTMHipure Plasmid Miniprep Kit對重組轉座子進行質粒提取，采用通用引物M13F和M13R PCR鑒定外源基因的插入情況。

1.6 重組桿狀病毒rBac-P12A3C的構建在轉染試劑CellfectinII Reagent的介導下，將重組轉座子Bacmid-P12A3C和Bacmid-NC轉染Sf9昆蟲細胞，并作僅含CellfectinII Reagent的陰性對照，將細胞放置于28 ℃下培養(yǎng)并觀察。當轉染的Sf9昆蟲細胞出現病變時，收取病變的細胞培養(yǎng)上清，將收取的上清作為第1代的重組桿狀病毒rBac-P12A3C和rBac-NC。

1.7 間接免疫熒光(IFA)實驗檢測目的蛋白表達將重組的桿狀病毒rBac-P12A3C及rBac-NC接種Sf9昆蟲細胞，細胞病變后，利用4%多聚甲醛固定，一抗為O型口蹄疫VP1多克隆抗體(1∶300)，用FITC標記的山羊抗兔IgG(1∶300)作為熒光二抗，進行IFA試驗檢測，置于熒光顯微鏡下觀察熒光產生情況。

2 結果與分析

2.1 P12A3C基因的克隆及鑒定以質粒pMD19-P12A3C為模板，利用特異性引物P12A3CF和P12A3CR在GXL高保真DNA聚合酶作用下進行PCR擴增P12A3C基因得到大小約3 000 bp的條帶，與預期結果相符(圖1)。

注：M.DNA分子質量標準；p.P12A3C基因的PCR產物。圖1 P12A3C片段的PCR擴增

2.2 重組轉移載體pFastBacDual-P12A3C的構建及鑒定以重組轉移載體pFastBacDual-P12A3C為模板，利用特異性引物P12A3CF和P12A3CR在GXL高保真DNA聚合酶作用下進行PCR擴增P12A3C基因得到大小約3 000 bp的條帶，與預期結果相符(圖2)；重組轉移載體pFastBacDual-P12A3C由限制性內切酶SpeI和Hind III雙酶切得到大小分別約5 238 bp 和約3 000 bp 的條帶，與預計條帶大小相符(圖3)，說明目的基因正確克隆入供體質粒上。將疑似陽性克隆質粒，寄送至南京金斯瑞生物技術有限公司測序。結果表明，重組轉移載體pFastBacDual-P12A3C 攜帶正確的O型FMDV毒株空衣殼的蛋白編碼基因P12A3C，進一步證明了包含完整的編碼口蹄病毒疫空衣殼蛋白表達基因P12A3C的重組轉移載體pFastBacDual-P12A3C構建成功。

注：M.DNA 分子質量標準；p.重組質粒的Hind III+Spe Ⅰ雙酶切產物。圖2 重組質粒pFastBacDual-P12A3C的雙酶切鑒定

注：M.DNA 分子質量標準；p.P12A3C基因的PCR產物。圖3 重組質粒pFastBacDual-P12A3C的PCR鑒定

2.3 重組桿狀病毒轉座子Bacmid-P12A3C的構建與鑒定以重組轉座子Bacmid-P12A3C和Bacmid-NC為模板，采用通用引物M13F和M13R 進行PCR擴增得到分別約5 560 bp和2 560 bp大小的條帶(圖4～5)，說明重組轉座子構建成功。

注：M.DNA 分子質量標準；p.PCR產物。圖4 重組轉座子Bacmid-P12A3C的PCR鑒定

注：M.DNA分子質量標準；p.PCR產物。圖5 重組轉座子Bacmid-NC的PCR鑒定

2.4 重組桿狀病毒rBac-P12A3C的構建轉染后的Sf9昆蟲細胞在28 ℃培養(yǎng)5 d后，出現細胞變大、脫落等明顯的細胞病變效應(圖6)，而陰性對照細胞未出現相應的病變。收取病變的Sf9昆蟲細胞培養(yǎng)上清為第1代的重組病毒rBac-P12A3C和rBac-NC。

2.5 IFA檢測外源基因的表達重組桿狀病毒rBac-P12A3C和rBac-NC感染Sf9昆蟲細胞3 d后，用O型FMDV VP1多克隆抗體進行IFA檢測。結果表明，感染rBac-P12A3C的Sf9昆蟲細胞，檢測到明顯的黃綠色熒光，而感染rBac-NC的Sf9昆蟲細胞未檢測到特異性黃綠色熒光(圖7)。這表明重組桿狀病rBac-P12A3C中P123CA基因在Sf9昆蟲細胞中表達成功。

注：A.感染重組桿狀病毒的Sf9細胞；B.陰性對照。圖6 重組桿狀病毒對Sf9細胞的致病變作用

注：A.感染桿狀病毒rBac-P12A3C的Sf9昆蟲細胞；B.感染桿狀病毒rBac-NC的Sf9昆蟲細胞。圖7 間接免疫熒光檢測Sf9細胞中的目的蛋白

3 討論

FMD是全球范圍重點防控的動物傳染病之一，該病的預防和控制主要以疫苗接種為主，同時結合撲殺病畜、隔離疑似病畜、定期消毒等綜合防控措施，但其對畜牧業(yè)的危害仍然不容忽視。研究FMDV衣殼蛋白的表達，然后以所表達的以殼蛋白研制疫苗，是許多科學家關注的焦點。很多表達系統(tǒng)已經被用于表達FMDV 空衣殼蛋白，但大都存在免疫原性不好、組裝效率不高以及成本高等缺點，生產的FMDV 空衣殼蛋白不足以用作FMDV亞單位疫苗的研制[6-7]。

Bac-to-Bac桿狀病毒表達系統(tǒng)是通過轉座子原理構建重組轉座子。該系統(tǒng)的轉座過程全部在大腸桿菌內完成，重組轉座子可直接用于轉染，此系統(tǒng)還利用α-互補原理篩選重組轉座子，不會造成非重組型病毒和野生型病毒交叉污染。Bac-to-Bac桿狀病毒表達系統(tǒng)作為真核表達系統(tǒng)，表達的外源目的蛋白在昆蟲細胞中可以進行翻譯后修飾以及加工，所得目的蛋白的生物學功能與天然的目的蛋白更接近[8]?；钶d體疫苗的研究也是FMD基因工程疫苗研究的熱點，此前有學者嘗試過用痘病毒[6]、大腸桿菌[9]、轉基因植物[10]、腺病毒載體[11]和畢赤酵母[12]等表達FMDV衣殼蛋白，但經比較發(fā)現桿狀病毒表達系統(tǒng)是大規(guī)模生產表達FMDV空衣殼蛋白的最優(yōu)體系之一。曹軼梅等在Bac-to-Bac桿狀病毒表達系統(tǒng)中構建并表達了Asia 1型FMDV 的P12A基因和3C蛋白酶基因，然后成功組裝了其空衣殼，并用以免疫豚鼠，產生了良好的免疫效果[13]。

該研究將O型FMDV的P12A3C基因克隆至桿狀病毒轉移載體pFastBacDual中，并在大腸桿菌中進行轉座重組，轉染Sf9昆蟲細胞后構建了重組桿狀病毒rBac-P12A3C。經IFA試驗檢測發(fā)現，O 型FMDV P12A3C 基因在Sf9昆蟲細胞中表達成功，且具有良好的反應原性。該研究為O型FMDV空衣殼蛋白的體外組裝及其基因工程亞單位疫苗的研究奠定了基礎。

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Expression and Identification of Capsid Protein of Foot-and-mouth Disease Virus Type O in Insect Cells

XIE Yin-li, MA Qi, LI Zhi-yong*

(State Key Laboratory of Veterinary Etiological Biology, Lanzhou Veterinary Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Lanzhou, Gansu 730046)

The capsid protein precursor P12A and protease 3C coding P12A3C gene of FMDV type O were amplified from the plasmid pMD19-P1A3C, then the gene P12A3C were inserted into the baculovirus transfer vector pFastBacDual to construct recombinant transfer vector pFastBacDual-P12A3C, in which the P12A3C gene were under the control of PH promoter.The recombinant baculovirus plasmids were transformed into Escherichia coli DH10BacTMto construct the recombinant baculovirus bacmid Bacmid-P12A3C, then transfected into Sf9 cells, the recombinant baculovirus was harvested when obvious cytopathic effect was observed.After amplied, the baculovirus were infected into the Sf9 cells.At last the expressed proteins were analyzed by the immunouorescent assay.The result indicated that the expressed protein were expressed in Sf9 cells, and displayed specificity to FMDV type O VP1 polyclonal antibody.From this study, the recombinant baculovirus including the virus capsid P1 gene and 3C protease gene coding regions of FMDV type O were successfully obtained, this provides a basis for the research of FMDV type O empty capsid assembly in vitro and empty capsid vaccine reaserch.

Type O Foot-and-mouth disease virus; Capsid protein; Recombinant baculovirus

解銀麗(1988- )，女，河南許昌人，碩士研究生，研究方向：分子疫苗與動物免疫學。*通訊作者，副研究員，博士，碩士生導師，從事分子疫苗與動物免疫學研究。

2015-02-02

S 855

A

0517-6611(2015)08-095-03