魏維杰，王麗芳

(浙江省杭州市余杭區(qū)食品藥品監(jiān)測中心，浙江杭州 311112)

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液相色譜法測定辣椒中克百威農(nóng)藥殘留量的不確定度評定

魏維杰，王麗芳

(浙江省杭州市余杭區(qū)食品藥品監(jiān)測中心，浙江杭州 311112)

[目的]了解測定蔬菜中氨基甲酸酯類農(nóng)藥多殘留量不確定度的主要來源，通過一些方法對不確定度貢獻(xiàn)度大的進(jìn)行改善修正，從而進(jìn)一步提升檢測結(jié)果的可靠性。[方法]對辣椒中克百威農(nóng)藥殘留的不確定度進(jìn)行評定和分析，找出影響不確定度的因素，對各個不確定度分量進(jìn)行評估并比較各分量對總不確定度的貢獻(xiàn)，從而給出測定結(jié)果的置信區(qū)間。[結(jié)果]分析得出影響結(jié)果的主要不確定度分量是色譜儀峰面積的測定和總重復(fù)性。[結(jié)論]在檢測過程中，需在檢測前做好儀器平衡和調(diào)試，確保儀器處于良好的工作狀態(tài)，并在重復(fù)檢測時盡可能排除其他干擾。

液相色譜法；克百威；不確定度

近年來，食品安全問題日益凸顯，蔬菜農(nóng)藥殘留已經(jīng)成為人們最關(guān)心話題之一，因此農(nóng)藥殘留檢測數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性至關(guān)重要。為了提供更公正、更準(zhǔn)確的檢測數(shù)據(jù)，測量不確定度作為判定測量結(jié)果準(zhǔn)確度的一個重要依據(jù)，是實驗室質(zhì)量體系建立的重要部分，實驗室認(rèn)證時也對其有明確要求，因此受到了各檢測實驗室的重視，各實驗室對其進(jìn)行了廣泛的研究與討論[1-6]?？税偻俑叨練⑾x劑，被農(nóng)業(yè)部禁止在蔬菜上使用，但偷用、濫用現(xiàn)象屢有發(fā)生，辣椒在南方需求量非常大，但病蟲害多，農(nóng)藥檢出率較高，為此，筆者選擇對辣椒中克百威農(nóng)藥殘留量進(jìn)行了測量不確定度評定，旨在為農(nóng)藥殘留檢測提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1樣品。鮮辣椒為市售。

1.1.2試劑。乙腈，甲醇，二氯甲烷，氯化鈉，超純水(哇哈哈純凈水經(jīng)純水器過濾所得)。

1.1.3主要儀器。島津LC-20A液相色譜儀(氨基甲酸酯分析系統(tǒng))；檢測器為熒光檢測器(λex 330 nm，λem 465 nm)；柱子為C8(4.0 mm×250.0 mm)，5 μm。

1.2 分析條件柱溫及衍生溫度：50 ℃；柱后衍生：0.05 mol/L氫氧化鈉溶液，流速0.3 ml/min；OPA試劑，流速0.3 ml/min；反應(yīng)器溫度：100 ℃。保留時間定性，外標(biāo)單標(biāo)法峰面積定量。檢測時，室溫(25±3)℃。

1.3 方法依據(jù)NY/T761-2008《蔬菜和水果中有機(jī)磷、有機(jī)氯、擬除蟲菊酯和氨基甲酸酯類農(nóng)藥多殘留的測定第3部分：蔬菜和水果中氨基甲酸酯類農(nóng)藥多殘留的測定》改動的非標(biāo)方法測定。將鮮辣椒用打樣機(jī)打碎混勻，稱取10.00 g樣品放入50 ml離心管中，加入5.00 g氯化鈉，再加入25.00 ml乙腈，充分混勻，用低速離心機(jī)4 500 r/min離心4 min，使乙腈相和水相充分分層，室溫下靜置5 min。從離心管中吸取5.00 ml乙腈溶液，放入10 ml試管1中，將試管放在氮吹儀上氮吹，設(shè)置水浴溫度70 ℃，緩緩?fù)ㄈ氲獨?，將乙腈氮吹蒸發(fā)至近干，加入2.00 ml甲醇+二氯甲烷(1+99)溶解殘渣，待凈化。將氨基柱用4.0 ml甲醇+二氯甲烷(1+99)預(yù)洗條件化，當(dāng)溶液液面到達(dá)柱吸附層表面時，立即加入上述待凈化溶液，用10 ml試管2收集洗脫液，用2 ml甲醇+二氯甲烷(1+99)洗試管1后過柱，并重復(fù)1次。將試管2置于氮吹儀上，水浴溫度50 ℃，氮吹蒸發(fā)至近干，用2.00 ml 10%甲醇溶解殘渣。樣品在混勻器上混勻后，經(jīng)0.2 μm有機(jī)針式過濾器過濾，吸取10.0 μl凈化后的樣品溶液注入液相色譜儀中待分析。

1.4 計算公式

ω=C標(biāo)×A樣×V1×V3×1 000/(A標(biāo)×m×V2×R×1 000)

式中，ω——樣品中農(nóng)藥的含量，mg/kg；C標(biāo)——標(biāo)準(zhǔn)溶液中克百威濃度，μg/ml；A標(biāo)——標(biāo)準(zhǔn)溶液中克百威峰面積，mV*s；A樣——樣品中克百威峰面積，mV*s；m——樣品的質(zhì)量，g；V1——提取溶液總體積，ml；V2——提取溶液分取的體積，ml；V3——樣品溶液定容體積，ml；R——樣品加標(biāo)回收率，%。

2 結(jié)果與分析

2.1 識別不確定度的來源液相色譜法檢測辣椒中克百威的標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(ω)主要來源：① 檢測方法總重復(fù)性導(dǎo)致的相對不確定度urel(rep)；② 標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(C標(biāo))；③ 樣品稱量引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(m)；④ 樣品前處理溶液體積引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(V)；⑤ 標(biāo)準(zhǔn)溶液峰面積測定引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(A標(biāo))；⑥ 樣品峰面積測定引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(A樣)；⑦ 樣品加標(biāo)回收率引入的不確定度urel(R)。

從測定方法看，各影響參數(shù)相對獨立，合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度可用相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度合成：

2.2 量化不確定度分量

2.2.1檢測方法總重復(fù)性導(dǎo)致的相對不確定度urel(rep)。按照該方法對樣品加標(biāo)中的克百威含量分別進(jìn)行測定，檢測結(jié)果為0.170、0.173、0.169、0.167、0.165、0.168、0.171、0.169、0.167和0.170 mg/kg。

實際測量時，一般對樣品測定2次作為測量結(jié)果，則：

其相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.2.2克百威標(biāo)準(zhǔn)溶液引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(C標(biāo))。

克百威標(biāo)準(zhǔn)溶液母液由農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測所(天津)制備，濃度為100 μg/ml，1 ml/瓶，其定值擴(kuò)展不確定度為±0.08 μg/ml，k=2。屬于B類評定，計算標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

2.2.2.2標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋配制過程中引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度評定。將1 ml安瓿瓶中的克百威標(biāo)準(zhǔn)母液移至10 ml容量瓶(A級)中，用1 ml甲醇沖洗安瓿瓶移至容量瓶中，重復(fù)5次，然后用甲醇定容，配成10 μg/ml克百威標(biāo)準(zhǔn)儲備液。用移液槍吸取10 μg/ml克百威標(biāo)準(zhǔn)儲備液500 μl移至25 ml容量瓶(A級)中，用甲醇定容，配成0.2 μg/ml克百威標(biāo)準(zhǔn)工作液。

因克百威標(biāo)準(zhǔn)母液未能完全轉(zhuǎn)移至容量瓶中而產(chǎn)生的不確定度由于5次清洗已經(jīng)可以忽略不計。

移液槍為Eppendorf(20～200 μl)，根據(jù)檢定證書提供的信息其200 μl時的測量重復(fù)性為1.0%，按矩形分布處理(屬于B類評定)：

urel(DE1)=0.005 77

移液槍為Eppendorf(100～1 000 μl)，根據(jù)檢定證書提供的信息其500 μl時的測量重復(fù)性為0.5%，按矩形分布處理(屬于B類評定)：

urel(DE2)=0.002 89

根據(jù)GB12806-1991《實驗室玻璃儀器單標(biāo)線容量瓶》規(guī)定：單標(biāo)線10 ml容量瓶的容量允許差為±0.02 ml。按三角分布處理(屬于B類評定)：

urel(DF1)=0.000 82

根據(jù)GB12806-1991《實驗室玻璃儀器單標(biāo)線容量瓶》規(guī)定：單標(biāo)線25 ml容量瓶的容量允許差為±0.03 ml。按三角分布處理(屬于B類評定)：

urel(DF2)=0.000 49

標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋過程引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

2.2.2.3克百威標(biāo)準(zhǔn)溶液引入的合成相對不確定度評定。

2.2.3樣品稱量引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(m)評定。樣品稱量所用天平最小分度值為0.01 g電子天平，準(zhǔn)確稱量樣品10.00 g，由于天平精度不是很高，數(shù)顯非常穩(wěn)定，故稱量重復(fù)性引入的不確定度忽略不計。該準(zhǔn)確級的天平在(0～50 g)稱量范圍的最大允許誤差為±0.01 g，由稱量誤差導(dǎo)致的不確定度按矩形分布計算(B類評定)：

2.2.4樣品前處理過程溶液體積引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(V)評定。

2.2.4.1提取溶液總體積引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(V1)。用A級25 ml單標(biāo)線胖肚移液管移取25.00 ml(V1)乙腈，根據(jù)GB12808-1991《實驗室玻璃儀器單標(biāo)線吸量管》規(guī)定：A級25 ml單標(biāo)線胖肚移液管的容量允許差為±0.03 ml。按三角分布處理(屬于B類評定)：

urel(V1)移液管=0.000 49

urel(V1)乙腈=0.002 37

樣品定容體積引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(V1)合成為：

2.2.4.2提取溶液分取體積引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(V2)。用A級5 ml單標(biāo)線胖肚移液管分取提5.00 ml(V2)取液，根據(jù)GB12808-1991《實驗室玻璃儀器單標(biāo)線吸量管》規(guī)定：A級5 ml單標(biāo)線胖肚移液管的容量允許差為±0.015 ml。按三角分布處理(屬于B類評定)：

urel(V2)移液管=0.001 22

urel(V2)乙腈=0.002 37

樣品定容體積引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(V2)合成為：

2.2.4.3樣品定容體積引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(V3)評定。測定液濃縮后最后用移液槍定容至2.0 ml，移液槍為Eppendorf(100～1 000 μl)，根據(jù)檢定證書提供的信息其1 000 μl時的測量重復(fù)性為0.5%，按矩形分布處理(屬于B類評定)：

urel(V3)移液槍=0.002 89

urel(V2)甲醇=0.001 91

樣品定容體積引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(V3)合成為：

2.2.4.4樣品前處理過程溶液體積引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度合成。

2.2.5色譜儀峰面積測定引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(A)評定[包含urel(A標(biāo))和urel(A樣)]。

2.2.5.1由標(biāo)準(zhǔn)品添加引入的相對不確定度urel(VA)。以峰面積外標(biāo)法定量，需用移液槍Eppendorf(20～200 μl)取10 μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)液200 μl，根據(jù)檢定證書提供的信息其200 μl時的測量重復(fù)性為1.0%，按矩形分布處理(屬于B類評定)：

urel(VA)=0.005 77

2.2.5.2儀器引入的相對不確定度urel(LC)。根據(jù)儀器檢定證書提供信息，定量重復(fù)性誤差(RSD6)為2.7%，屬于B類評定，儀器引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.2.5.3色譜儀峰面積相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度合成。

2.2.6樣品加標(biāo)回收率引入的不確定度urel(R)。按照該方法對6個樣品加標(biāo)中的克百威含量進(jìn)行測定，其回收率分別為84.5%、86.5%、84.0%、85.5%、82.5%和83.5%。

2.3 相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度的合成和相對擴(kuò)展不確定的計算

urel(ω)=

取包含因子k=2(95%置信度)，則測得辣椒中克百威測定的相對擴(kuò)展不確定度為：

U(ω)=urel(ω)×k=0.038 66

2.4 測定結(jié)果

由試驗數(shù)據(jù)平均值計算辣椒中克百威的最佳估計值：

ω=0.168 8(mg/kg)

其擴(kuò)展不確定度為：

U=U(ω)×ω=0.006 50

故該試驗采用液相色譜法測定辣椒中克百威含量為(0.168 8±0.006 5)mg/kg，k=2。

3 討論

總重復(fù)性(rep)、標(biāo)準(zhǔn)液(C標(biāo))、樣品量(m)、前處理體積(V)、峰面積(A)、回收率(R) 6項參數(shù)的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量值分別為0.009 56、0.006 53、0.000 58、0.006 08、0.012 44、0.006 91。

由各個相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量值可知，影響結(jié)果的主要不確定度分量是色譜儀峰面積的測定；其次是總重復(fù)性、回收率、標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度、前處理體積；樣品量可以忽略不計。因此，在標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)樣和樣品檢測過程中應(yīng)嚴(yán)格按照儀器操作規(guī)程進(jìn)行測定，在測定前做好儀器平衡和調(diào)試準(zhǔn)備工作，盡量排除儀器的不確定因素，同時在樣品檢測過程中應(yīng)嚴(yán)格控制樣品前處理的各個步驟，減少因定容、取液等引入的不確定度，從而減小測定結(jié)果的不確定度。

[1] 羅小玲，劉長勇，任雪燕.氣相色譜法測定蔬菜中氧化樂果農(nóng)藥殘留量的測量不確定度評定[J].中國測試技術(shù)，2006，32(3)：126-127，131.

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Evaluation of Measurement Uncertainty in Determination of Carbofuran Residue in Chilli by Liquid Chromatography

WEI Wei-jie, WANG Li-fang

(Yuhang District Supervising & Testing Center for Food and Drug of Hangzhou City, Hangzhou, Zhejiang 311112)

[Objective] To find out the main sources of measurement uncertainty in the data about determination carbamate pesticides in vegetables，through some methods to improve and correct the larger contribution of the uncertainty，thus further improve the reliability of detection results.[Method] Find out the influencing factors of uncertainty by evaluation of measurement uncertainty in determination of carbofuran residue in chilli，then evaluate each component of uncertainty and compare each of the components on contribution of the total uncertainty，thus obtain the determination results of the confidence interval.[Result] It was found that the results of the main components of the uncertainty is the chromatograph peak area determination and total repeatability.[Conclusion] It's necessary that balance and debug the instrument before the detection, ensure the instrument is ready, and as much as to exclude other interference in duplicate detection.

LC; Carbofuran; Uncertainty

浙江省杭州市科技局社會發(fā)展科研專項(20140533B61)。

魏維杰(1986- )，男，浙江杭州人，助理工程師，從事食品及農(nóng)產(chǎn)品檢測工作。

2015-01-30

S 481+.8

A

0517-6611(2015)08-089-03