曹焱，孟慶峰，刁秋實，張文達，劉剛

(1.黑龍江省林業(yè)科學(xué)研究所，哈爾濱150081；2.黑龍江省林業(yè)科學(xué)院；3.黑龍江省林副特產(chǎn)研究所)

植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)對成熟紅松合子胚愈傷組織誘導(dǎo)的影響

曹焱1，孟慶峰2，刁秋實1，張文達1，劉剛3*

(1.黑龍江省林業(yè)科學(xué)研究所，哈爾濱150081；2.黑龍江省林業(yè)科學(xué)院；3.黑龍江省林副特產(chǎn)研究所)

誘導(dǎo)成熟紅松合子胚愈傷組織的關(guān)鍵，是選擇正確的誘導(dǎo)培養(yǎng)基以及適宜濃度及配比的生長調(diào)節(jié)物質(zhì)。結(jié)合松柏類針葉樹種體胚發(fā)生文獻，從7種基本培養(yǎng)基中篩選出LM培養(yǎng)基為最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基；在植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的篩選中，2,4-D優(yōu)于NAA；LM+2 mg/L 2.4-D+(0～0.5)mg/L 6-BA可以誘導(dǎo)出更多的Ⅱ型有效愈傷組織；LM+2mg/L 2,4-D+0.5 mg/L 6-BA的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中加入0.5mg/L KT或0.5mg/L TDZ，可顯著提高有效愈傷組織的誘導(dǎo)率(75.7%)。

紅松合子胚；生長調(diào)節(jié)物質(zhì)；有效愈傷組織

紅松是溫帶地帶性頂級群落——闊葉紅松林的建群樹種，同時是我國乃至東亞地區(qū)極其重要的優(yōu)質(zhì)珍貴用材樹種和堅果經(jīng)濟林樹種，其生態(tài)學(xué)上、經(jīng)濟學(xué)上和社會學(xué)上的重要地位無可替代。紅松愈傷組織培養(yǎng)到現(xiàn)在為止，國內(nèi)外相關(guān)研究實例報道較少，但少數(shù)實例證明此種培養(yǎng)方式可行。本實驗探討了基本培養(yǎng)基的篩選，植物生長調(diào)節(jié)劑的應(yīng)用，以及組合對成熟紅松合子胚有效愈傷組織的誘導(dǎo)的影響，以便對后續(xù)發(fā)生提供技術(shù)支持基礎(chǔ)。

1 實驗材料和測定內(nèi)容

本實驗均以完整成熟合子胚為外植體，培養(yǎng)基中均附加酸水解酪蛋白(CH)500mg/L，谷氨酰胺450 mg/L，蔗糖3%，瓊脂0.6%，pH值5.8。暗培養(yǎng)。

1.1 基本培養(yǎng)基的選擇

經(jīng)研究者前期試驗觀察并結(jié)合文獻總結(jié)，選出7種初始誘導(dǎo)培養(yǎng)基LM、1/2 LM、LP、DCR、MSG、S、BM作為基本培養(yǎng)基，不加激素的基本培養(yǎng)基分別作為對照。表1為誘導(dǎo)培養(yǎng)基及激素組合。

表1 紅松合子胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基及激素組合 mg·L-1

1.2 植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)對紅松愈傷組織誘導(dǎo)的影響

1.2.1 分別添加0.5、1、1.5、2 mg/L NAA和2,4-D于同一種基本培養(yǎng)基中，比較兩種生長素對愈傷組織誘導(dǎo)的影響。

1.2.2 培養(yǎng)基中加入0、0.5、1、1.5、2 mg/L 2,4-D與0、0.5、1、2 mg/L 6-BA的不同組合，觀察不同組合的生長素和細胞分裂素對紅松愈傷組織誘導(dǎo)的影響。

1.2.3 在固定基本培養(yǎng)基和激素中分別加入0.1、0.5、1 mg/L KT、0.01、0.1、0.3、0.5 mg/L TDZ、0.1、0.3、0.5 mg/L ZT。比較其對紅松愈傷組織誘導(dǎo)的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 基本培養(yǎng)基的篩選

成熟胚置于LM、1/2 LM、LP、DCR、MSG、S、BM培養(yǎng)基中，每種培養(yǎng)基設(shè)兩種2,4-D濃度，誘導(dǎo)出愈傷組織率結(jié)果如圖1。7種不同基本培養(yǎng)基相同激素濃度愈傷誘導(dǎo)率差異不顯著(P<0.05)，但產(chǎn)生的愈傷組織形態(tài)及愈傷組織發(fā)育狀況各異。

圖1 7種培養(yǎng)基在不同2,4-D濃度下紅松合子胚愈傷組織誘導(dǎo)率

根據(jù)Arm strong標準，30 d左右定期觀察，LM培養(yǎng)基產(chǎn)生的愈傷組織多類似于Ⅱ型有效愈傷組織，具有透明鮮活絲狀和小顆粒狀的形態(tài)，因此將LM培養(yǎng)基作為初始誘導(dǎo)基本培養(yǎng)基。

2.2 NAA與2,4-D 組合對愈傷組織誘導(dǎo)效果

以LM為基本培養(yǎng)基，均添加0.5mg/L 6-BA，其他條件不變，分別加入不同濃度的NAA和2,4-D。圖2表明，使用NAA的誘導(dǎo)率明顯低于使用2,4-D的。較為適宜的誘導(dǎo)生長素為2,4-D，適宜濃度2 mg/L。

圖2 LM培養(yǎng)基中分別加入NAA和2,4-D對誘導(dǎo)紅松合子胚愈傷組織的差異

2.3 2,4-D與6-BA不同組合對愈傷組織誘導(dǎo)的影響

接種21 d后觀察，生長素2,4-D含量越高，愈傷組織量越大。但隨著2,4-D濃度的升高，褐化率也逐漸升高。2,4-D和6-BA的濃度配比影響著愈傷組織的形態(tài)，生長素2,4-D濃度大于細胞分裂素6-BA的濃度，且濃度差較大，誘導(dǎo)出多為透明、疏松、鮮活的有效愈傷組織；生長素濃度等于或小于細胞分裂素濃度時，促進胚的器官發(fā)生，多產(chǎn)生不定芽，不適宜愈傷組織的誘導(dǎo)；另外，生長素的初始濃度過低則不能誘導(dǎo)出有效愈傷組織。

因此初始誘導(dǎo)階段，應(yīng)將生長素2,4-D的濃度置于2 mg/L，并附加0～0.5 mg/L 的6-BA。

2.4 添加其他激素對愈傷組織誘導(dǎo)效果

LM+2 mg/L 2,4-D+0.5 mg/L 6-BA為對照，分別加入不同濃度的KT、TDZ、ZT，接種60 d后記錄其有效愈傷組織分化狀況(期間接種30 d后按原有激素水平繼代一次)。從表2中可見，加入0.5 mg/L KT的誘導(dǎo)培養(yǎng)基有效愈傷組織誘導(dǎo)率高達75.7%，與其他培養(yǎng)基的差異顯著(P<0.05)。誘導(dǎo)出的愈傷組織多具備Ⅱ型有效愈傷組織的特征，在后面的繼代中，該種愈傷組織也表現(xiàn)出很強的分化增生能力，且不容易褐化死亡。ZT所產(chǎn)生的有效愈傷組織易干燥變硬，表明選用的ZT含量不適合有效愈傷的誘導(dǎo)；TDZ在0.5mg/L時誘導(dǎo)率很高，其誘導(dǎo)出的有效愈傷組織具有特殊的薄脆質(zhì)感，在解剖鏡下觀察表面有胚柄伸出，以及小細胞團突起，疑似早期原胚團。這表明，TDZ對誘導(dǎo)胚性愈傷組織有一定促進作用，在添加適量TDZ的情況下有可能產(chǎn)生胚性愈傷組織并有希望獲得體細胞胚。試驗中產(chǎn)生的淡黃色疏松有效愈傷組織，分化旺盛，很可能是胚性愈傷組織，但處于分化過盛的徒長狀態(tài)，進一步培養(yǎng)不容易向體胚方向轉(zhuǎn)化。

綜上，誘導(dǎo)紅松的有效愈傷組織，應(yīng)在加入適量生長素和細胞分裂素的同時，再加入一定濃度的KT或TDZ，這將會促進胚性愈傷組織的形成。

表2 2,4-D與6-BA不同濃度配比對紅松合子胚愈傷組織誘導(dǎo)情況

注：愈傷組織狀態(tài)為產(chǎn)生量較大記為+++,產(chǎn)生量一般記為++,只胚根處不明顯愈傷記為+；部分褐化記為+++,貼近培養(yǎng)基部分褐化記為++,胚根處褐化記為+。

表3 KT、TDZ、ZT對紅松合子胚愈傷組織的誘導(dǎo)情況

注：有效愈傷組織旺盛分化記為+++,分化量一般記為++,少量分化并褐化記為+。

3 結(jié)論

3.1 不同的培養(yǎng)基對有效愈傷組織的誘導(dǎo)效果不同，初始誘導(dǎo)應(yīng)選用鹽濃度較高的LM培養(yǎng)基使外植體完全脫分化，反復(fù)繼代后可以產(chǎn)生有效愈傷組織；供試的其他培養(yǎng)基繼代后極少產(chǎn)生有效愈傷組織。

3.2 不同的激素組合和濃度配比對有效愈傷組織的誘導(dǎo)率影響不同，在紅松愈傷組織的誘導(dǎo)中，2,4-D是愈傷組織啟動的不可或缺的植物生長調(diào)節(jié)劑，其作用遠遠大于NAA；另外在LM + 2 mg/L 2,4-D + 0.5 mg/L 6-BA的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中加入0.5 mg/L KT或0.5 mg/L TDZ，可顯著提高有效愈傷組織的誘導(dǎo)率(75.7%)。

[1]XY Li FH Huang EE Gbur,Jr. Effect of Basal Medium, Growth Regulators and Phytagel Concentration on Initiation of Embryo Genic Cultures from Immature Zygotic Embryos of Loblolly Pine (P. taeda) [J]. Plant Cell Reports. 1998, 17: 298-301.

[2]冷肖荀. 培養(yǎng)基類型對針葉樹離體培養(yǎng)的影響[J]. 河北林業(yè)科技, 2005 (6): 7-8.

[3]Von Aderkas and Peterson BV.Chirosiabetuleti(Ringdahl) (DipteraAnthomyiidae) A Gall-Former on the Ostrich FernMatteucciastruthiopteris, With Notes on Other Insect Fern Associates [J]. Proceedings of the Washington Entomological Society, 1987, 89: 532-547.

[4]趙曉敏. 興安落葉松胚性愈傷組織的誘導(dǎo)研究 [D].哈爾濱：東北林業(yè)大學(xué), 2006: 19-26.

[5]韓碧文, 李穎章. 植物組織培養(yǎng)中器官建成的生理生化基礎(chǔ)[J]. 植物學(xué)通報, 1993, 10(2): 1-6.

[6]Bates S, Preece JE, Navarrete NE. TDZ Stimulates Shoot Organogenesis and Somatic Embryogenesis in White Ash (FraxinusamericanaL.) [J]. Plant CellTissue Organ Culture, 1992, 31: 21-29.

[7]王有菊，孫永存，初艷.紅松結(jié)實性狀優(yōu)良無性系的選擇[J].林業(yè)科技，2014(1)：1-3.

Plant Growth Regulators Effect on Callus Induction from Mature Zygotic Embryos ofPinuskoraiensis

Cao Yan1,Meng Qingfeng2,Diao Qiushi1,Zhang Wenda1,Liu Gang3*

(1.Forestry Research Institute of Heilongjiang Province,150081;2.Heilongjiang Academy of Forestry;3.Forest By-product and Speciality Institute in Heilongjiang Province)

The induction key of callus from mature zygotic embryos ofPinuskoraiensisis to choose the right medium and the concentration ratio of growth regulators. Under the literature on conifers of conifer somatic embryos.Screened LM medium from 7 basic medium arguing that it was the best;in screening of plant growth-regulator substances, the author argues that 2,4-D is better than NAA. And the substances of LM+2mg/L 2,4-D+(0-0.5)mg/L 6-BA can induce more effective callus of type II. Add 0.5mg/L KT or 0.5mg/L TDZ to LM+2mg/L 2,4-D+0.5mg/L 6-BA induction medium, can significantly increase the effective induction frequency of callus.

Zygotic embryos ofPinuskoraiensis; Growth regulators; Effective callus

2015-03-16

省屬科研院所基本科研業(yè)務(wù)費專項

曹焱(1982-)，女，森林培育學(xué)碩士，助理研究員，主要從事森林培育相關(guān)技術(shù)及林木育種方面的研究工作；*

S791.247

A

DOI.:10.13268/j.cnki.fbsic.2015.03.004