田新華 , 盧慧穎 , 曹焱 , 殷東生

(黑龍江省林業(yè)科學(xué)研究所，哈爾濱150081)

雜交沙棘新品種深-雜的組織培養(yǎng)研究

田新華 , 盧慧穎 , 曹焱 , 殷東生

(黑龍江省林業(yè)科學(xué)研究所，哈爾濱150081)

以雜交沙棘新品種深-雜為供試材料，探索篩選適合苗木繁殖的培養(yǎng)基配方及條件。試驗(yàn)表明：增殖培養(yǎng)配方為：1/2MS(大量元素、鈣鹽減半)+6-BA0.5mg/L+IAA0.2mg/L為雜交沙棘的分化增殖培養(yǎng)基，分化芽苗數(shù)較多，達(dá)到3.89倍，苗木高度適中。生根培養(yǎng)基：1/4MS(大量元素、鈣鹽為正常值的1/4)+6-BA0.3 mg/L+IBA0.5 mg/L，生根率達(dá)87.5%，莖基部生根，根粗壯側(cè)根多。

雜交新品種；組織培養(yǎng)；苗木繁育

沙棘是胡頹子科(Elcrecrgrlcreecre)沙棘屬(HippophcreL.)植物。我國(guó)有6種8亞種是沙棘面積和沙棘資源蘊(yùn)藏量最大的國(guó)家[1-3]。

沙棘含有豐富的營(yíng)養(yǎng)成分，其中沙棘油被譽(yù)為“生命之油”，在提高人體免疫功能，預(yù)防并抑制腫瘤發(fā)生方面應(yīng)用前景廣闊[4-7]；果實(shí)加工成果汁、果醋、果醬等各種飲料和食品，保健價(jià)值很高[8-9]，沙棘汁含有超氧化物歧化酶，具有清除細(xì)胞膜上自由基和抗氧化作用及抗癌作用。

沙棘繁殖技術(shù)中研究最多、應(yīng)用最廣的是扦插育苗，但受材料數(shù)量限制，難以快速大量生產(chǎn)。本研究針對(duì)雜交沙棘新品種(系)深-雜展開組培快繁技術(shù)研究，篩選不同培養(yǎng)階段的適宜培養(yǎng)基配方，并分析不同培養(yǎng)條件對(duì)沙棘組織培養(yǎng)的影響，探索雜交沙棘新品種(系)組織培養(yǎng)中存在的主要問(wèn)題及克服方法，旨在建立一套完整的良種繁殖配套體系，使良種與良法結(jié)合，為今后優(yōu)良品種大規(guī)模工廠化育苗提供技術(shù)支持。

1 試驗(yàn)材料與處理

黑龍江省林科院內(nèi)種植沙棘雜交新品種(系)深-雜的枝條。

將室外剪取的深-雜的枝條采回后用加洗衣粉的自來(lái)水浸泡30 min，再用牙刷刷洗掉表層塵垢，流水沖洗15 min，最后用加洗潔凈的自來(lái)水浸泡刷洗后，流水沖洗干凈，根據(jù)需要截成10～15 mm長(zhǎng)的莖段準(zhǔn)備消毒接種。

將莖段置于超凈工作臺(tái)上進(jìn)行滅菌處理：(1)75%酒精浸泡30s，0.1%HgCl2浸泡2 min，然后用無(wú)菌水沖洗3次；(2) 75%酒精浸泡30s，0.1% HgCl2浸泡3 min，用無(wú)菌水沖洗3次；(3)0.1% HgCl2浸泡2.5 min，然后用無(wú)菌水浸泡40 min；(4) 0.1% HgCl2浸泡3.5 min，然后用無(wú)菌水浸泡40min；以上材料滅菌后取出，用無(wú)菌濾紙吸干材料表面多余水分。每組處理30個(gè)莖段，4d后觀察效果。

2 試驗(yàn)方法

2.1 誘導(dǎo)側(cè)芽生長(zhǎng)

以1/2MS(大量元素、鈣鹽減半)為基本培養(yǎng)基，在無(wú)菌條件下將單芽莖段接種于1/2MS+6-BA0.5mg/L+IAA0.5 mg/L+20g/L蔗糖+瓊脂粉6g/L培養(yǎng)基上誘導(dǎo)腋芽苗生長(zhǎng)。

2.2 試管苗分化增殖培養(yǎng)

表1 因素水平表

待莖段腋芽伸長(zhǎng)后，分別轉(zhuǎn)接于以1/2MS為基本培養(yǎng)基，添加6-BA、ZT激素不同濃度的培養(yǎng)基進(jìn)行增殖培養(yǎng)，篩選優(yōu)化雜交沙棘試管苗的增殖培養(yǎng)基配方。以6-芐基腺嘌呤(6-BA)，生長(zhǎng)素(IAA)為2個(gè)因素，每因素設(shè)置3個(gè)水平。采用L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表進(jìn)行芽增殖培養(yǎng)基篩選。每個(gè)處理2次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)接種10瓶，培養(yǎng)25d調(diào)查苗高、分化增殖情況。

2.3 試管苗生根培養(yǎng)

將經(jīng)過(guò)分化增殖培養(yǎng)、同一簇生長(zhǎng)的試管苗，以2棵為1組轉(zhuǎn)入下列4種不同的生根培養(yǎng)基進(jìn)行生根培養(yǎng)。

Ⅰ 1/4MS(大量元素、鈣鹽為正常值的1/4)+NAA0.4 mg/L +KT0.3 mg/L；

Ⅱ 1/4MS(大量元素、鈣鹽為正常值的1/4)+6-BA0.3 mg/L +IBA0.5 mg/L；

Ⅲ 1/2MS(大量元素、鈣鹽為正常值的1/2)+IBA0.5 mg/L；

Ⅳ 1/2MS(大量元素、鈣鹽為正常值的1/2)+NAA0.2 mg/L；

每個(gè)處理2次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)接種10瓶，培養(yǎng)35d調(diào)查苗木生根情況。培養(yǎng)基中添加蔗糖20g/L，日產(chǎn)瓊脂粉6g/L，pH值調(diào)至5.8，培養(yǎng)溫度白天25±1℃，夜間20±1℃，光照強(qiáng)度2000 lx，光照時(shí)間12h/d。培養(yǎng)溫度白天25±1℃，夜間20±1℃，光照強(qiáng)度2000 lx，光照時(shí)間12h/d。

2.4 雜交沙棘移栽試驗(yàn)

挑選生根質(zhì)量好的試管瓶苗置于遮蔭的陽(yáng)臺(tái)上煉苗，預(yù)培養(yǎng)5d。然后對(duì)試管苗進(jìn)行移栽試驗(yàn)研究，篩選適合的移栽基質(zhì)及培養(yǎng)條件。

2.5 統(tǒng)計(jì)分析方法

采用Microsoft Excel 2003的統(tǒng)計(jì)工具進(jìn)行計(jì)算并作圖，dps7.05數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和差異顯著性測(cè)驗(yàn)(SSR法)[10]。

3 結(jié)果與分析

3.1 不同滅菌方法的滅菌效果

表2 不同滅菌時(shí)間的滅菌效果

獲取初始材料的一個(gè)重要制約因素就是初代培養(yǎng)的高污染率，所以選用適宜的滅菌方法至關(guān)重要。由表2可以看出，處理1滅菌不充分，污染率較高43.3%；處理2污染率和褐化率均高，不適合沙棘外植體消毒處理；處理4滅菌過(guò)度，盡管沒有污染，但苗木已經(jīng)大量褐化，嚴(yán)重影響外植體的生長(zhǎng)；處理3即用0.1%升汞浸泡2.5 min的滅菌方法，污染率為10%，褐化率6.7%，其余外植體表現(xiàn)正常，是較適宜的滅菌方法。

3.2 誘導(dǎo)側(cè)芽生長(zhǎng)

經(jīng)1/2MS(大量元素、鈣鹽減半)+6-BA0.5mg/L+IAA0.5 mg/L+20g/L蔗糖+瓊脂粉6g/L培養(yǎng)的沙棘腋芽培養(yǎng)1周左右開始萌動(dòng)，節(jié)間伸長(zhǎng)、葉片展開，顏色新綠。

3.3 試管苗增殖培養(yǎng)基的篩選

將經(jīng)初代培養(yǎng)的試管苗切成1.0 cm左右的莖段轉(zhuǎn)接入不同激素組合的增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)。通過(guò)觀察各處理培養(yǎng)25 d后的試管苗可知，因激素的種類、濃度的不同，不定芽的生長(zhǎng)狀況表現(xiàn)出明顯的不同。莖段或莖尖的離體增殖率受到培養(yǎng)基中細(xì)胞分裂素的調(diào)控，伸長(zhǎng)生長(zhǎng)除受細(xì)胞分裂素調(diào)控外，還受生長(zhǎng)素的調(diào)控。將試管苗各性狀測(cè)量結(jié)果進(jìn)行極差分析(見表3)，極差大的因素對(duì)相應(yīng)性狀影響較大。結(jié)果表明，就苗高這一性狀主要受6-BA控制，而分化增殖苗數(shù)決定于IAA。

表3 不同激素對(duì)植株上部各性狀極差的影響

表4 不同處理對(duì)雜交沙棘試管苗不同性狀方差分析

表5 不同處理植株上部性狀多重比較

注：要求芽苗高度≥0.3cm

經(jīng)方差分析(見表4)表明，無(wú)論對(duì)于控制試管苗分化增殖數(shù)，A、B兩因素不同水平間差異均極顯著(P<0.01)，而對(duì)于試管苗向高生長(zhǎng)則6-BA各水平間差異顯著(P<0.01)。按F值分析，F(xiàn)值大的因素對(duì)結(jié)果影響較大，結(jié)果也與上述分析一致。經(jīng)植株上部生長(zhǎng)情況的多重比較結(jié)果顯示(見表5)，以處理1培養(yǎng)的試管苗向高生長(zhǎng)最快，只與處理2間差異顯著；以處理1培養(yǎng)的試管苗分化增殖倍數(shù)最多，與其它處理間差異顯著(P<0.05)。綜合上述結(jié)果，選擇培養(yǎng)基(即處理1)1/2MS(大量元素、鈣鹽減半)+6-BA0.5mg/L+IAA0.2mg/L為雜交沙棘的分化增殖培養(yǎng)基，分化芽苗數(shù)較多，苗木高度適中。

3.4 雜交沙棘試管苗生根試驗(yàn)

將經(jīng)過(guò)分化增殖培養(yǎng)、同一簇生長(zhǎng)的試管苗，以2棵為1組轉(zhuǎn)入4種不同的生根培養(yǎng)基進(jìn)行生根培養(yǎng)，培養(yǎng)35d調(diào)查苗木生根情況(見表6)。

試驗(yàn)結(jié)果可知，不同培養(yǎng)基對(duì)沙棘雜交品種的生根作用是不同的，誘導(dǎo)產(chǎn)生的根的狀態(tài)也不近相同，以處理Ⅱ培養(yǎng)的試管苗生根效果較好，即生根培養(yǎng)基配方為1/4MS(大量元素、鈣鹽為正常值的1/4)+6-BA0.3mg/L+IBA0.5mg/L。

表6 不同培養(yǎng)基對(duì)雜交沙棘深-雜的生根誘導(dǎo)作用

3.5 沙棘的移栽試驗(yàn)

挑選生根質(zhì)量好的試管瓶苗置于遮蔭的陽(yáng)臺(tái)上煉苗，預(yù)培養(yǎng)5d(增加光照，提高自身抗性，進(jìn)行壯苗處理)。然后逐步去除封口膜，降低濕度，保持3～5天后準(zhǔn)備移栽。

將煉過(guò)的生根苗從瓶中取出，洗凈根系粘附的培養(yǎng)基，試管苗基部速蘸0.5%KMnO4消毒，然后浸蘸生根激素ABT 1000mg/L 30s，斜插入經(jīng)消過(guò)毒的不同基質(zhì)中，利用霧化器進(jìn)行霧化培養(yǎng)，濕度控制在80%，溫度控制在30～35℃。

移栽基質(zhì)選擇非常重要，它決定著生根苗移栽后的成活率和生長(zhǎng)狀況，蛭石有良好的透氣性，質(zhì)地疏松柔軟，草炭保水性較好，含有一定營(yíng)養(yǎng)利于生根苗成活，將草炭、蛭石、細(xì)沙按不同比例配比好，用飽和KMnO4消毒滅菌30min后大量清水沖洗，然后用塑料薄膜覆蓋陽(yáng)光曝曬24h以上供移栽使用。

移栽時(shí)用筷子開穴，保證生根苗根系舒展，不出現(xiàn)折根、斷根即可，栽植深度約2cm，栽后澆透自來(lái)水，間隔10d澆10%的MS，相對(duì)濕度控制在80%左右。2～3周幼苗生長(zhǎng)正常時(shí)置于遮蔭的光照強(qiáng)的地方，加強(qiáng)幼苗光合作用，促進(jìn)自養(yǎng)。

將生根苗木移栽入細(xì)砂∶草炭∶蛭石為1∶1∶1的松軟基質(zhì)中，放置在塑料棚中保持相對(duì)濕度80%左右，溫度控制在25±2℃的條件下培養(yǎng)20d，移栽苗幾乎不生長(zhǎng)或僅有少量生長(zhǎng)且下部葉片稍有發(fā)黃，這可能與組培苗長(zhǎng)期在異養(yǎng)的環(huán)境中生長(zhǎng)，出瓶后根系吸收能力很弱甚至無(wú)吸收功能有關(guān)。此后移栽苗莖尖開始生長(zhǎng)，新葉嫩綠，與老葉形成明顯對(duì)比。因此，選用細(xì)砂∶草炭∶蛭石為1∶1∶1的移栽基質(zhì)有利于苗木成活。

表7 不同基質(zhì)對(duì)苗木成活率的影響

4 討論

4.1 沙棘品種很多，從各品種基因型及生物學(xué)特性等方面考慮，在相同條件下反應(yīng)會(huì)有所不同。

4.2 通常1個(gè)葉腋長(zhǎng)出1個(gè)腋芽，當(dāng)材料培養(yǎng)馴化到一定階段，處于對(duì)激素高度敏感狀態(tài)時(shí)，新長(zhǎng)出的腋芽每個(gè)葉腋又可長(zhǎng)出一個(gè)腋芽，從而誘導(dǎo)出二級(jí)、三級(jí)腋芽，出現(xiàn)芽上生芽的叢生狀態(tài)，標(biāo)志著腋芽增殖的成功。本試驗(yàn)的研究結(jié)果：1/2MS(大量元素、鈣鹽減半)+6-BA0.5mg/L+IAA0.2mg/L為雜交沙棘的分化增殖培養(yǎng)基，分化芽苗數(shù)較多，苗木高度適中。

4.3 褐化是木本植物組織培養(yǎng)中常見的問(wèn)題，沙棘體內(nèi)酚類物質(zhì)含量高，褐化問(wèn)題突出，抑制其褐化在組織培養(yǎng)過(guò)程中尤為重要。

4.4 影響試管苗人工移栽馴化的重要因素包括：生長(zhǎng)環(huán)境(溫度、濕度、光照)、基質(zhì)的通氣透水性、肥力等情況。本試驗(yàn)采用了富含腐殖質(zhì)的草炭和透氣性良好的沙子、蛭石配合在一起即可保證試管苗移栽后的養(yǎng)分供應(yīng)，又有一定的通氣透水性。

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2014-09-18

國(guó)家林業(yè)公益資助項(xiàng)目( 201004068 )；省財(cái)政自擬項(xiàng)目(寒地漿果無(wú)性繁殖技術(shù)研究；寒地漿果無(wú)性擴(kuò)繁及工廠化育苗技術(shù)研究)

田新華(1976-)，女，副研究員，遺傳育種專業(yè)，E-mail：hrbtxh@163.com。

S793.6

A

DOI.:10.13268/j.cnki.fbsic.2015.02.005