黃 敏 張 旭 余 躍 高 萌 賈一夫 胡 聞

·基礎(chǔ)醫(yī)學·

胎兒正常胰腺組織Stathmin1的免疫組化和原位雜交研究

黃 敏 張 旭 余 躍 高 萌 賈一夫 胡 聞

目的 探討Stathmin1在胎兒正常胰腺組織中的表達情況。方法收集2012至2014年不同周齡胎兒解剖標本中正常胰腺組織10例，應(yīng)用免疫組織化學法和原位雜交檢測Stathmin1及其mRNA的表達。結(jié)果<24周胎兒正常胰腺組織中Stathmin1已有表達，陽性表達率顯著低于>24周胎兒胰腺的正常組織(54.72%vs82.41%,P<0.05)；且<24周胎兒正常胰腺組織中Stathmin1 mRNA也已有表達，陽性表達率顯著低于>24周胎兒胰腺的正常組織(48.33%vs73.64%,P<0.05)。結(jié)論胎兒正常胰腺組織Stathmin1已有表達，隨著胎兒的發(fā)育而發(fā)生變化，其可能參與了胎兒胰腺組織的生長發(fā)育。

胎兒；胰腺組織；Stathmin1; 原位雜交；免疫組化

Stathmin1蛋白是一種微管不穩(wěn)定磷蛋白，在細胞周期對微管系統(tǒng)動力平衡的調(diào)節(jié)發(fā)揮重要作用。研究則表明Stathmin1蛋白在許多類型的人類惡性腫瘤中呈高水平表達，如口腔癌、食道癌、胃癌等[1]。但其在胎兒胰腺組織表達，國內(nèi)外鮮見報道。本研究應(yīng)用免疫組化和原位雜交技術(shù)觀察胎兒正常胰腺組織Stathmin1的表達，為探討Stathmin1的生理功能提供形態(tài)學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 組織標本來源 本研究選取2012至2014年安徽省立醫(yī)院病理科標本庫中的10例11～37周胎兒解剖標本，其中4例<24周,6例>24周。胎兒解剖標本若有胰腺疾病或繼發(fā)性胰腺損傷破壞胰腺正常結(jié)構(gòu)完整的病例則剔除。

1.2 主要試劑與探針 鼠抗人Stathmin1 抗體[EP1573Y]ab52630(上海Abcam公司)，濃縮型DAB試劑盒(產(chǎn)品編號ZLI-9017/9018/9019，中杉金橋公司)。Stathmin1 mRNA原位雜交試劑盒(武漢博士德公司，產(chǎn)品編號 MK1814-h),Stathmin1基因寡核苷酸探針序列：5′-TCTT TCACC TGGAT ATCAG AAGAA GCCAT-3′。

1.3 原位雜交檢測 石蠟切片經(jīng)二甲苯常規(guī)脫蠟，梯度乙醇脫水。3%H2O2滅活內(nèi)源性過氧化物酶，室溫下處理30 min。蒸餾水沖洗3次，每次5 min。暴露mRNA的核酸片段，用新鮮配制的胃蛋白酶(1 mL 3%檸檬酸加2滴濃縮型胃蛋白酶混勻)，在37℃下消化10～30 min。用0.5 M PBS沖洗3次，每次5 min。再用蒸餾水沖洗1次，5 min。濕盒的準備：干的雜交盒底部加20%甘油20 mL以保持濕度。預(yù)雜交：滴加預(yù)雜交液 20 μL/片在42℃恒溫箱內(nèi)孵育4 h。雜交：甩去多余的液體，滴加雜交液 20 μL/片，將原位雜交專用蓋玻片的保護膜揭開后，蓋在切片上，在42℃恒溫箱內(nèi)孵育14 h。雜交后洗滌：揭開蓋玻片，在30～37℃水溫的2×SSC 沖洗5 min×2次，0.5×SSC 沖洗15 min×1次, 0.2×SSC 沖洗15 min×1次。滴加封閉液，20 μL/片置于37℃ 30 min，甩去多余液體，不洗。滴加生物素化鼠抗地高辛：37℃ 60 min。0.5 M PBS沖洗4次，每次5 min。滴加SABC：37℃ 20 min。0.5M PBS沖洗3次，每次5 min。滴加生物素化過氧化物酶：37℃ 20 min。0.5M PBS沖洗4次，每次5 min。DAB顯色、蘇木素復(fù)染、梯度乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。

1.4 免疫組織化學染色 脫蠟、水化組織切片。標本置于3%H2O2的去離子水孵育5 min,以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶。PBS沖洗5 min,共3次。滴加Stathmin1抗體(1 ∶100)于切片上37℃孵育2 h，PBS沖洗2 min,共3次。滴加通用型IgG抗體-HRP多聚體，37℃孵育15 min, PBS沖洗2 min,共3次。將DAB底物工作液滴加于切片上，顯微鏡下控制顯色，自來水終止顯色反應(yīng)。蘇木素復(fù)染，常規(guī)酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。陰性對照：以PBS代替一抗，其余步驟與上述相同。

1.5 結(jié)果判定 Stathmin1及其mRNA陽性信號細胞胞漿著色呈棕黃色，高倍鏡下隨機選取5個視野(每個視野觀察細胞數(shù)不少于200個)，按陽性細胞所占百分比及著色深淺進行結(jié)果判定[2]。①按細胞著色深淺評分：0分，細胞無顯色；1分，淡黃色；2分，棕黃色；3分，棕褐色。②按陽性細胞數(shù)百分比：<5%為0分，5%～25%為1分，25%～50%為2分，50%～75%為3分，≥75%為4分。取①、②兩項評分的乘積作為總積分，0分為陰性(-)，1～4分為弱陽性(+)，5～8分為陽性(++)，9～12分為強陽性(+++)。

1.6 統(tǒng)計學方法 數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0進行統(tǒng)計分析，計數(shù)資料采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 胎兒正常胰腺組織Stathmin1的表達 Stathmin1陽性顯色為棕黃色顆粒，位于胞質(zhì)，見圖1。在>24周胎兒正常胰腺組織中呈較高表達，陽性表達率分別為82.41%；而<24周胎兒正常胰腺組織中已有表達，陽性表達率分別為54.72%；兩者差異有統(tǒng)計學意義(χ2=8.59,P=0.001)。

2.2 胎兒正常胰腺組織Stathmin1 mRNA的表達 Stathmin1 mRNA在>24周胎兒正常胰腺組織中表達較強，呈彌漫性著色，陽性顯色位于胞漿，呈棕黃色顆粒，見圖2。Stathmin1 mRNA在>24周胎兒正常胰腺組織中陽性表達率為73.64%，在<24周胎兒正常胰腺組織中已有表達，陽性表達率為48.33%，兩者差異有統(tǒng)計學意義(χ2=7.45,P=0.003)。

3 討論

Stathmin1是近來研究較多的微管不穩(wěn)定蛋白，在大量的組織和物種中均廣泛存在。它與細胞有絲分裂紡錘體的結(jié)構(gòu)和功能關(guān)系密切。目前已經(jīng)證實Stathmin1在包括消化系統(tǒng)惡性腫瘤等多種惡性腫瘤細胞中高水平表達[1]。但目前胎兒正常胰腺組織中Stathmin1 表達的相關(guān)研究鮮見報道。

本研究發(fā)現(xiàn)，Stathmin1陽性顯色為棕黃色顆粒．位于胞質(zhì)。在>24周胎兒正常胰腺組織中呈較高表達，陽性表達率顯著高于<24周胎兒胰腺的正常組織(P<0.05)；且Stathmin1 mRNA在>24周胎兒正常胰腺組織中表達較強，呈彌漫性著色，陽性顯色位于胞漿，呈棕黃色顆粒。Stathmin1 mRNA在>24周胎兒正常胰腺組織中陽性表達率顯著高于<24周胎兒胰腺的正常組織(P<0.05)。胎兒正常胰腺組織Stathmin1 已有表達，隨著胎兒的發(fā)育而發(fā)生高表達，其可能在胎兒胰腺組織的生長發(fā)育中發(fā)揮了重要作用。

在正常人體組織中，Stathmin1表達水平在具有較高細胞代謝能力的組織中高，而在較低增殖能力的組織中表達較低。Hanash等[3]在HL60白血病細胞中發(fā)現(xiàn)Stathmin1表達明顯增高，當細胞被誘導發(fā)生分化和細胞增殖明顯減慢時，細胞中Stathmin1表達水平降低。在其他幾個白血病細胞系中也發(fā)現(xiàn)細胞增殖停滯并分化較好時，Stathmin1表達水平降低。Guo等[4]發(fā)現(xiàn)，大鼠骨骺干細胞內(nèi)Stathmin1表達水平高時，細胞增殖；Stathmin1表達被抑制時，細胞增殖減弱，并且發(fā)生細胞分化。還有研究發(fā)現(xiàn)在神經(jīng)元細胞、再生的肝細胞、反應(yīng)性增生的淋巴結(jié)細胞等增殖細胞中Stathmin1表達上調(diào)[5]，這些與本研究結(jié)果一致。

[1] Akhtar J,Wang Z,Jiang WP,et al.Stathmin overexpression identifies high risk for lymphaticmetastatic recurrence in pN0 esophageal squamous cell carcinoma patients[J]. J Gastroenterol Hepatol,2014,29(9):944-950

[2] Gfroerer S,Metzger R,Fiegel H, et al.Differential changes in intrinsic innervation and interstitial cells of Cajal in small bowel atresia in newborns[J].World J Gastroenterol,2010,16(45):5716-5721.

[3] Hanash SM,Strshler JR,Kuick R,et al.Identification of a polypeptide associated with the malignant phenotype in acute leukemia[J].J Biol Chem,1998,273(26):12813-12815.

[4] Guo F,Zhang Y,Chen AM.Effect of Stathmin decoyoligode oxynucIeotjdes on the proliferation and differentiation of precartilainous stem cells[J]. J Huazhong Univ Sci Technol,2007,27(5):557-560.

[5] Niethammer P,Bastiaens P,Karsenti E.Stathmin-tubulin interaction gradients in motile and mitotic cells[J].Science,2004,303(5665):1862-1866.

(2014-11-01 收稿 2014-12-17 修回)

Expression of stathmin 1 in normal fetal pancreatic tissues

HuangMin,ZhangXu,YuYue,etal

DepartmentofGastroenterology,AffiliatedProvincialHospitalofAnhuimedicalUniversity,Hefei230001,China

Objective To explore the expression of stathmin 1 in the normal fetal pancreatic tissues.MethodsFrom 2012 to 2014, 10 fetal specimens of normal pancreatic tissues from dead fetus at different weeks were collected, and the expression of stathmin 1 and its mRNA were detected and observed by immunohistochemistry and in situ hybridization.ResultsThe positive expression rate of stathmin 1 in fetal specimens of pancreatic tissues less than 24 weeks was lower than that of more than 24 weeks (54.72%vs82.41%,P<0.05), so was it with the positive expression rate of Stathmin 1 mRNA in fetal specimens less than 24 weeks (48.33%vs73.64%,P<0.05).ConclusionThe expression of stathmin 1 exists in normal fetal pancreatic tissues, and its expression increases along with developing fetus. It suggests that stathmin 1 may be involved in the development of fetal pancreatic tissues.

Fetus; Pancreatic tissues; Stathmin 1; In situ hybridization; Immunohistochemistry

10.3969/j.issn.1000-0399.2015.02.001