黃從兵, 唐再軍, 謝遠杰, 胡愛民,

劉芳1, 劉珊珊1, 龍治峰2

(1. 湖南黑金時代長沙礦業(yè)有限公司職工醫(yī)院, 湖南 長沙, 410600;

2. 南華大學(xué)醫(yī)學(xué)院 組織學(xué)與胚胎學(xué)教研, 湖南 衡陽, 421001)

大蒜素對膀胱癌細胞增殖和B細胞淋巴瘤-2表達的影響

黃從兵1, 唐再軍1, 謝遠杰2, 胡愛民1,

劉芳1, 劉珊珊1, 龍治峰2

(1. 湖南黑金時代長沙礦業(yè)有限公司職工醫(yī)院, 湖南 長沙, 410600;

2. 南華大學(xué)醫(yī)學(xué)院 組織學(xué)與胚胎學(xué)教研, 湖南 衡陽, 421001)

摘要:目的探討大蒜素對膀胱癌BIU-87細胞的增殖及B細胞淋巴瘤-2(Bcl-2)表達的影響。方法用不同濃度的大蒜素處理膀胱癌BIU-87細胞36 h, 以噻唑藍(MTT)比色法分析細胞生長抑制率，逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)(RT-PCR)檢測Bcl-2 mRNA的表達，蛋白免疫印跡技術(shù)檢測Bcl-2蛋白表達的變化。結(jié)果與對照組比較，經(jīng)大蒜素處理的BIU-87細胞的生長抑制率增加(P<0.05), 且效應(yīng)呈濃度和時間依賴性(P<0.05)；大蒜素處理細胞后，BIU-87細胞中Bcl-2 mRNA及蛋白質(zhì)的表達水平下調(diào)(P<0.01)。結(jié)論大蒜素能抑制BIU-87細胞的增殖，且呈劑量和濃度依賴性，其機制可能與大蒜素下調(diào)Bcl-2 mRNA和蛋白的表達有關(guān)。

關(guān)鍵詞:大蒜素; 膀胱癌; B細胞淋巴瘤/白血病基因-2

Influence of allicin on proliferation of bladder

膀胱癌是泌尿生殖系統(tǒng)中最常見的惡性腫瘤，其中絕大多數(shù)為移行細胞癌。膀胱癌屬于化療敏感性腫瘤，但容易對化療藥物產(chǎn)生耐藥性而復(fù)發(fā)。大蒜素是多種含硫化合物的復(fù)合體，是從大蒜鱗莖中分離的一種有機化合物，由存在的蒜氨酸在蒜酶作用下轉(zhuǎn)化產(chǎn)生，具有多種生物學(xué)作用，如抗菌、降血壓、降血脂和抗腫瘤等[1-2]。大蒜素(allicin)中所含有的有機硫化合物的抗腫瘤作用已被得到證實，這些有機硫化物可以通過許多途徑抑制腫瘤的發(fā)展，包括加速致癌物的解毒、細胞周期的停滯、誘導(dǎo)細胞凋亡和抑制血管生成等。B細胞淋巴瘤/白血病基因-2(Bcl-2)是一種原癌基因，研究[3]表明Bcl-2能夠抑制細胞的凋亡而促進細胞的生長, Bcl-2能夠抑制多種因素誘導(dǎo)的多種細胞凋亡，其高表達是腫瘤細胞對化療耐藥的原因之一。

本文以膀胱癌細胞株BIU-87細胞為研究對象，觀察大蒜素對細胞增殖的影響及細胞中Bcl-2表達的變化，探討大蒜素對膀胱癌細胞生長的影響及可能機制，為臨床膀胱癌的治療提供實驗依據(jù)。

1材料與方法

1.1主要試劑

大蒜素注射液(山西普德藥業(yè)股份有限公司)，逆轉(zhuǎn)錄及PCR試劑盒購自康為試劑有限公司，引物序列由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司提供；抗體購自武漢博士德公司。噻唑藍(MTT)比色法試劑盒購自武漢博士德，ECL發(fā)光試劑盒產(chǎn)自碧云天生物技術(shù)研究所。

1.2細胞培養(yǎng)及分組

BIU-87細胞株(膀胱移行細胞癌株)購自武漢細胞保藏中心。細胞貼壁生長于含10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基(Gibo BRL公司)中，置于含5%CO2、37 ℃恒溫飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3 d傳代以0.25%胰酶和0.02%乙二胺四乙酸(EDTA) 1∶1(V/V)混合的消化液進行傳代，取對數(shù)生長期細胞用于實驗。

大蒜素注射液(規(guī)格: 2 mL∶30 mg)配成1 g/L的貯存液, 4 ℃保存，實驗時分別加于培養(yǎng)基中處理細胞(使終濃度分別達到實驗分組中各組的要求的濃度)。實驗分為對照組(不加大蒜素)和不同濃度大蒜素組(濃度分別為25、50、75、100 mg/L)。

1.3噻唑藍(MTT)比色法測細胞活力

1.4逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)(RT-PCR)檢測Bcl-2基因的表達

按TRIzol試劑盒說明提取細胞總RNA，按相關(guān)試劑盒中操作說明進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。Bcl-2引物序列為: 5′- GTGGAGGAGCTCTTCAGGGA -3′, 5′- AGGCACCCAGGGTGATGCA A-3′, 擴增片斷304bp。以GAPDH為內(nèi)參照，其引物序列為: 5′-AGCGGGAAATCGTGC GTGAC-3′, 5′-ACTCCTGCTTGCTGATCCACATC-3′, 擴增片段471 bp。RT-PCR產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳分離檢測，溴化乙淀染色，UVP型凝膠成像系統(tǒng)拍照后進行圖像分析，以與內(nèi)參的灰度比值代表Bcl-2表達的變化。

1.5Western免疫印跡檢測Bcl-2蛋白的表達

按常規(guī)方法提取培養(yǎng)細胞的總蛋白，以BCA法測蛋白濃度。參考《分子克隆實驗指南》第二版本的方法配制分離膠和集成膠，上樣后進行垂直電泳m, 轉(zhuǎn)PVDF膜后，以10%脫脂奶粉封閉(常溫下?lián)u育2 h)，再依次孵育Bcl-2及內(nèi)參β-actin的一抗及辣根過氧化物酶標記的二抗，最后以Western免疫熒光檢測試劑激發(fā)熒光，于暗室中顯影于X光片。結(jié)果用凝膠圖像分析系統(tǒng)對膠片掃描進行半定量分析。

1.6實驗結(jié)果分析

2結(jié)果

2.1大蒜素對膀胱癌細胞生長抑制率的影響

以MTT法檢測培養(yǎng)的BIU-87細胞的生長抑制率，結(jié)果顯示，不同濃度(25、50、75、100 mg/L)大蒜素處理細胞36 h后，或100mg/L大蒜素處理細胞不同時間(12、24、36、48 h)后，其細胞代謝MTT的能力明顯降低，各組間細胞生長的抑制率明顯上升，說明大蒜素可以抑制膀胱癌細胞的生長，并且這種效應(yīng)隨著大蒜素濃度的增加或時間的延長而逐漸增強(P<0.05)，見圖1。

A. 不同濃度的大蒜素對膀胱癌細胞生長抑制率的影響; B. 100 mg/L大蒜素作用于細胞不同時間后膀胱癌

細胞生長抑制率的變化(*與對照組比較，P<0.05, #兩組間比較，P<0.05)

圖1MTT法分析大蒜素對膀胱癌細胞生長抑制率的影響2.2大蒜素對膀胱癌細胞Bcl-2基因表達的影響

不同濃度的大蒜素(0、25、50、75、100 mg/L)作用于膀胱癌BIU-87細胞36 h后，與對照組比較, BIU-87細胞中Bcl-2 mRNA的表達明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01), 且隨大蒜素濃度的增加, Bcl-2 mRNA表達下調(diào)的趨勢越明顯，見圖2。

與對照組比較,*P<0.01;兩組間比較,#P<0.01圖2 大蒜素對膀胱癌細胞Bcl-2mRNA表達的影響

2.3大蒜素對對膀胱癌細胞Bcl-2蛋白表達的影響

采用Western免疫印跡法檢測不同濃度的大蒜素(25、50、75、100 μmol/L)處理膀胱癌細胞株后，細胞Bcl-2蛋白表達的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著大蒜素濃度的增加，細胞Bcl-2蛋白的表達明顯下調(diào)(P<0.01), 見圖3。

與對照組比較,*P<0.01;兩組間比較,#P<0.01圖3 大蒜素對膀胱癌細胞Bcl-2蛋白表達的影響

3討論

膀胱癌在全球惡性腫瘤中已位居第9位[4], 也是中國人群中最常見的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤，也是泌尿系統(tǒng)病死率最高的腫瘤，其早期診斷及復(fù)發(fā)進展監(jiān)測仍以有創(chuàng)的膀胱鏡和尿脫落細胞學(xué)為重要方法，在基因水平上的研究主要集中于癌基因突變，抑癌基因失活等方面的研究[5-6]。Bcl-2是一種完整膜蛋白，定位于線粒體外膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和核膜，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)大多數(shù)人類癌和癌前病變組織中有Bcl-2的異常表達。Bcl-2能夠阻止多種刺激物和治療如化療藥物、放射、過氧化氫、生長因子撤除、神經(jīng)毒素等引起的凋亡[7-8]。作者在研究中也發(fā)現(xiàn)，膀胱癌細胞株BIU-87細胞中Bcl-2表達發(fā)生變化，與其細胞生長抑制率也受到明顯的影響。此外，還有研究結(jié)果表明，與Bcl-2陽性膀胱腫瘤比較，Bcl-2陰性者對順鉑敏感性高，復(fù)發(fā)率低(40%), 進展率低(5%); 前者的復(fù)發(fā)率和進展率分別為55.0%和36.0%[9-10]。探討凋亡抑制基因Bcl-2對膀胱腫瘤細胞凋亡的調(diào)控作用對認識膀胱腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及預(yù)防和治療等具有重要意義。

大蒜素又名大蒜新素，化學(xué)名為二烯丙基三硫化物(CH2=CH-CH-S-S-S-CH2-CH=CH2)，是從大蒜鱗莖中分離的一種有機化合物，可分為脂溶性和水溶性，其中脂溶性成分包括二烯丙基一硫(DAS)、二烯丙基二硫(DADS)和二烯丙基三硫(DATS)，水溶性成分包括S-丙烯丙基半胱氨酸(SAC)和S-丙烯丙基巰基半胱氨酸(SAMC)[11-12]。研究[13]發(fā)現(xiàn)，大蒜素可通過多水平、多個作用靶點誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡的，其主要作用機制表現(xiàn)為直接殺傷、抗氧化、特異性阻滯細胞周期、調(diào)節(jié)癌基因和抑癌基因的表達、調(diào)節(jié)機體免疫功能、對抗癌藥物的增敏和抗耐藥作用等。王保才等[14]研究發(fā)現(xiàn)，大蒜素對胰腺癌 PANC-1細胞有抑制作用且呈現(xiàn)劑量依賴性，大蒜素濃度越高，其抑制率也越高，另外其作用也與藥物作用時間有關(guān)系。大蒜素還可通過影響細胞周期和/或誘導(dǎo)細胞凋亡等途徑發(fā)揮抗結(jié)腸癌LoVo細胞、直腸癌細胞、膽管癌QBC939細胞的作用。大蒜素可誘導(dǎo)人宮頸腺癌Hela細胞和Caski細胞的凋亡，且其抑制作用也隨著時間和劑量的增加而有所增加。本研究中作者發(fā)現(xiàn)，不同濃度梯度的大蒜素處理細胞，或同一濃度大蒜素處理細胞不同時間，均可使膀胱癌BIU-87細胞的生長明顯受到抑制，且這種效應(yīng)呈濃度和時間依賴性，這表明大蒜素在體外可以抑制膀胱癌BIU-87細胞的增殖。國內(nèi)李永生等研究發(fā)現(xiàn)，大蒜素可增強長春新堿對膀胱癌BIU-87細胞增殖抑制作用，兩者具有協(xié)同抗腫瘤作用，并提示大蒜素誘導(dǎo)細胞凋亡的機制可能與下調(diào)CDK1和CyclinB1的表達有關(guān)[12]。本研究中，作者采用大蒜素處理膀胱癌BIU-87細胞后，結(jié)果發(fā)現(xiàn)細胞中Bcl-2基因和蛋白質(zhì)的表達逐漸降低，提示大蒜素可能通過抑制抑制細胞的Bcl-2的表達而抑制膀胱癌BIU-87細胞的生長。

總之，作者采用大蒜素處理膀胱癌細胞株，發(fā)現(xiàn)細胞的生長明顯受到抑制，且這種效應(yīng)呈現(xiàn)明顯的濃度和時間效應(yīng)，這表明大蒜素在體外可以抑制膀胱癌BIU-87細胞的增殖。此外，在研究中還發(fā)現(xiàn)，大蒜素處理BIU-87細胞后，細胞中Bcl-2基因和蛋白質(zhì)的表達逐漸降低，提示大蒜素可抑制BIU-87細胞中Bcl-2的表達。本研究結(jié)果表明，大蒜素可抑制膀胱癌BIU-87細胞的生長，其機制可能與大蒜素抑制細胞的Bcl-2的表達有關(guān)。此外，有研究表明大蒜素還可通過多種途徑發(fā)揮抗乳腺癌、卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌作用[15], 本研究及國內(nèi)外相關(guān)研究都說明大蒜素可能成為一種潛在的抗腫瘤新藥。

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cancer cells and expression of B-cell lymphoma-2

HUANG Congbing1, TANG Zaijun1, XIE Yuanjie2, HU Aimin1,

LIU Fang1, LIU Shanshan1, LONG Zhifeng2

(1.Worker′sHospitalofHunanBlackGoldEraChangshaMiningLimitedCompany,Changsha,

Hunan, 410600; 2.DepartmentofHistologyandEmbryology,UniversityofSouthChina,

Hengyang,Hunan, 421001)

ABSTRACT:ObjectiveTo explore the influence of allicin on proliferation of BIU-87 cells of bladder cancer and expression of B-cell lymphoma-2 (Bcl-2). MethodsDifferent concentrations of allicin were used to process BIU-87 cells for 36 hours. Growth inhibitory rate of cell was evaluated by MTT assay, the mRNA expression of Bcl-2 was detected by RT-PCR, and protein expression of Bcl-2 was detected by Western blot. ResultsCompared with control group, the growth inhibition rate increased in BIU-87 cells processed by allicin (P<0.05), and the effect was dependent on concentration and time. The mRNA and protein expressions of Bcl-2 decreased significantly in BIU-87 cells processed by allicin (P<0.01). ConclusionAllicin can inhibit the growth of BIU-87 cells, the effect is dependent on concentration and time, and its mechanism may be correlated with down-regulation of Bcl-2 mRNA expression and protein by allicin.

KEYWORDS:allicin; bladder cancer; B-cell lymphoma-2

收稿日期:2014-12-09

中圖分類號:R 737.14

文獻標志碼:A

文章編號:1672-2353(2015)03-023-04

DOI:10.7619/jcmp.201503006