梁宏偉，曹 磊，李 忠，鄒桂偉

(1 中國水產科學研究院 長江水產研究所，湖北 武漢 430223；2 淡水水產健康養(yǎng)殖湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北 武漢 430070；3 華中農業(yè)大學 水產學院，湖北 武漢 430070)

黃顙魚生長抑素基因的克隆及表達譜分析

梁宏偉1,2，曹 磊1,3，李 忠1,3，鄒桂偉1,3

(1 中國水產科學研究院 長江水產研究所，湖北 武漢 430223；2 淡水水產健康養(yǎng)殖湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北 武漢 430070；3 華中農業(yè)大學 水產學院，湖北 武漢 430070)

【目的】 克隆黃顙魚生長抑素(Somatostatin，SS)基因cDNA全長序列，分析其在黃顙魚胚胎發(fā)育、胚后發(fā)育階段及成魚各個組織中的表達規(guī)律?！痉椒ā?以黃顙魚腦組織為材料，根據(jù)瓦氏黃顙魚和斑點叉尾鮰SS基因保守區(qū)設計1對引物用于擴增SS基因中間保守區(qū)序列，再根據(jù)中間保守區(qū)序列設計2對引物，分別用于擴增5′端和3′端序列，將擴增得到的中間保守區(qū)序列、5′端和3′端序列拼接后得到黃顙魚SS基因的cDNA全長序列，并對其進行生物信息學分析。用NCBI的Protein Blast對黃顙魚與其他物種SS基因編碼的氨基酸序列同源性進行比較，并構建系統(tǒng)發(fā)育樹。用實時熒光定量RT-PCR檢測SS基因在胚胎發(fā)育時期和胚后發(fā)育階段(1～20 d)的表達特征。采用半定量RT-PCR檢測SS基因在黃顙魚腦、心臟、肌肉、胃、肝臟、腎臟、鰓、脾臟、性腺等組織中的表達特征。【結果】 黃顙魚SS基因cDNA全長694 bp，其中5′端非翻譯區(qū)139 bp，3′端非翻譯區(qū)211 bp，開放閱讀框為345 bp，編碼114個氨基酸。黃顙魚與瓦氏黃顙魚SS基因編碼氨基酸同源性最高，為98%。系統(tǒng)發(fā)育樹結果顯示，黃顙魚與同屬于鲇形目的瓦氏黃顙魚和斑點叉尾鮰聚為一支。SS基因在黃顙魚受精卵時期就有表達，并持續(xù)至胚胎孵化出膜，且在心跳期和出膜期的表達量顯著高于受精卵時期(P<0.05)；在出膜后的1～20 d，SS基因在黃顙魚中穩(wěn)定表達；在成魚的各個組織中，SS基因只在腦組織中特異性表達。【結論】 初步探明了SS基因在黃顙魚胚胎發(fā)育、胚后發(fā)育階段及成魚各組織中的表達規(guī)律，推測其可能在黃顙魚胚胎發(fā)育中發(fā)揮著重要的生理功能。

黃顙魚；生長抑素；基因克??；表達特征

生長抑素(Somatostatin，SS)是一種由下丘腦分泌的抑制動物腦垂體分泌生長激素的神經(jīng)調節(jié)肽，其具有激素和神經(jīng)遞質雙重作用，廣泛分布于中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)及胃腸、胰腺等各種組織中，是脊椎動物生長發(fā)育的主要負調控因子[1-3]。SS首先是從羊的下丘腦提取液中分離得到的，是含有14個氨基酸的多肽，氨基酸序列依次為Ala-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys[4]。最初分離得到的含14個氨基酸的多肽只是SS家族中的一類，SS家族含有不同氨基酸鏈長度和氨基酸組成多肽，在脊椎動物中主要存在SS-14和SS-28(SS-14的N端延長了14個氨基酸)2種生物活性多肽[5]。自20世紀80年代以來，國內外先后克隆得到了大西洋鱈魚[6]、狗鯊[7]、虹鱒[8]、金魚[9]、中華鱘[10]、鱖[11]、團頭魴[12]、齊口裂腹魚[13]、牙鲆[14]、斜帶石斑魚[15]等多種魚的SS基因。研究表明，SS具有抑制生長激素釋放、參與調節(jié)滲透壓和調控生長發(fā)育等方面的作用[16-18]。

黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco)是我國重要的淡水經(jīng)濟魚類之一，屬于鲇形目(Siluriformes)、鲿科(Bagridae)、黃顙魚屬(Pelteobagrus)。近年來，黃顙魚人工育苗技術和養(yǎng)殖業(yè)得到了飛速發(fā)展，通過生理學方法調控提高黃顙魚苗種的成活率和生長速度，對于黃顙魚養(yǎng)殖業(yè)的健康高效發(fā)展具有重要意義。本研究克隆獲得了與黃顙魚生長密切相關的SS基因，并分析其在胚胎發(fā)育階段、早期發(fā)育階段不同時期和成魚不同組織中的表達規(guī)律，以期為今后黃顙魚SS調控機制的研究積累資料。

1 材料與方法

1.1 材 料

試驗所用材料取自中國水產科學研究院長江水產研究所窯灣試驗場。在胚胎發(fā)育階段，連續(xù)取受精卵樣品，各發(fā)育時期均取30粒；在胚后發(fā)育階段，對出生1～20 d仔魚連續(xù)取樣；選取健康、無損傷的成體黃顙魚，取其腦、心臟、肌肉、胃、肝臟、腎臟、鰓、脾臟、性腺等組織，樣品采集后迅速凍于液氮罐，帶回實驗室于-80 ℃保存。

1.2 SS基因的克隆

1.2.1 引物的設計與合成 根據(jù)GenBank已公布的鲇形目魚類(瓦氏黃顙魚，登錄號HQ830200；斑點叉尾鮰，登錄號NM_001200330)的SS基因cDNA序列，在其保守區(qū)內采用Primer 5.0設計引物S1，用于擴增黃顙魚SS基因中間保守區(qū)序列。根據(jù)獲得的黃顙魚SS基因中間保守區(qū)序列，設計 5′ RACE 和3′ RACE特異性引物S2和S3，其中S2用于擴增SS基因的5′端序列，S3用于擴增SS基因的3′端序列。將擴增的保守區(qū)序列、5′端和3′端序列進行拼接得到黃顙魚SS基因的cDNA序列全長。根據(jù)克隆的cDNA全長設計引物S4，作為檢測SS基因定量表達的特異性引物。同時根據(jù)黃顙魚β-actin基因(GenBank登錄號：EU161066)，利用Primer 5.0軟件設計內參基因β-actin的定量表達引物S5。所有引物由武漢擎科生物技術有限公司合成，相關信息見表1。

1.2.2 總RNA的提取和第一鏈cDNA的合成 將收集的成體黃顙魚各個組織約100 mg、胚胎各發(fā)育期的30粒受精卵和胚后發(fā)育的仔魚，分別利用Trizol Reagent(Invitrogen)按照使用說明提取總RNA。用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，用紫外分光光度計測定RNA濃度，之后于 -80 ℃保存?zhèn)溆?。以總RNA為模板，根據(jù)RNA PCR Kit(AMV)Ver 3.0(TaKaRa)反轉錄試劑盒說明合成cDNA第一鏈。

1.2.3SS基因全長的擴增 以黃顙魚腦組織的cDNA第一鏈為模板，用S1引物進行PCR擴增，PCR反應體系為25 μL，其中10×Buffer 2.5 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，dNTPs(10 mmol/L)0.5 μL，Taq酶1.5 U，模板為1 μg，以ddH2O補足體積。PCR擴增程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，36個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。擴增產物用20 g/L瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，用DNA回收試劑盒進行目的片段的回收和純化，將回收產物連接到pMD-18T Vector，轉化到DH5α感受態(tài)細胞，進行藍白斑篩選，挑取陽性克隆進行菌落PCR，并將PCR呈陽性的克隆送武漢擎科生物技術有限公司測序。分別采用引物S2和S3，通過SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit(Clontech，美國) 試劑盒進行 5′ RACE、3′ RACE，用于擴增SS基因5′ 和3′ 端序列，具體步驟參照試劑盒說明書。

1.2.4 生物信息學分析 將Sanger法測序的黃顙魚SS基因中間保守區(qū)序列、5′端和3′端序列利用DNASTAR軟件進行序列拼接，獲得SS基因cDNA全長序列。再通過NCBI在線軟件進行黃顙魚cDNA序列同源性、開放閱讀框和編碼區(qū)分析；用在線軟件Expasy(http://www.expasy.org/)預測SS基因編碼蛋白質的分子質量和等電點；用軟件ProtScale(http://www.expasy.org/tools/protscale.html)進行氨基酸序列疏水性分析；用NCBI的Protein Blast對黃顙魚SS基因進行編碼氨基酸的同源性比對，并采用MAGA 5.0軟件構建包括黃顙魚在內的20個不同物種(瓦氏黃顙魚(登錄號：ADX32485)、斑點叉尾鮰(登錄號：NP001187259)、草魚(登錄號：ACB69423)、金魚(登錄號：AAD09359)、厚頜魴(登錄號：AAO92644.1)、斑馬魚(登錄號：AAH76254)、大西洋鮭(登錄號：NP001134573)、鎧甲弓背魚(登錄號：AAK97070)、高首鱘(登錄號：AAL13248)、中華鱘(登錄號：ACN88148)、大西洋鱈(登錄號：AAZ85702)、紅鰭東方鲀(登錄號：XP-003968367)、鱖AE(登錄號：J89925)、斜帶石斑魚(登錄號：AAU93565)、青鱂(登錄號：XP_004084505)、金頭鯛(登錄號：AFO52507)、雞(登錄號：CAA42747)、牛(登錄號：DAA33340)和人(登錄號：NP-001039))SS基因編碼氨基酸的系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3 SS基因在胚胎發(fā)育和胚后發(fā)育時期表達的實時熒光定量RT-PCR檢測

利用引物S4和內參基因β-actin的引物S5，來檢測SS基因在黃顙魚胚胎發(fā)育及胚后發(fā)育階段的表達情況。實時熒光定量PCR的反應體系為20 μL，其中2×SYBR Real-time PCR Premixture 10 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，cDNA模板1 μL，加ddH2O至20 μL。PCR反應條件：95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 20 s，40個循環(huán)。

1.4 SS基因在成魚不同組織中表達的半定量RT-PCR檢測

利用引物S4和內參基因β-actin的引物S5，來檢測SS基因在黃顙魚成魚不同組織中的表達情況，半定量RT-PCR反應體系為15 μL，其中10×Buffer 1.5 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL，dNTPs(10 mmol/L)0.3 μL，Taq酶1.0 U，模板1 μg，以ddH2O補足體積。PCR反應程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃ 延伸45 s，36個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。將PCR擴增產物用20 g/L 瓊脂糖凝膠進行檢測并拍照保存。

2 結果與分析

2.1 黃顙魚SS cDNA的克隆

以引物S1擴增時，擴增到長度約為250 bp的特異性條帶(圖1)，對該條帶克隆測序后經(jīng)Blast分析，該條帶序列與瓦氏黃顙魚和斑點叉尾鮰等物種SS基因的一致性很高，故推測獲得的序列是黃顙魚SS基因的一部分;根據(jù)所獲得cDNA部分片段設計引物S2和S3分別擴增SS基因5′端序列和3′端序列，擴增得到的片段長度約為189和366 bp，均與預期片段長度一致(圖1)。將得到的3段核苷酸序列進行拼接，獲得黃顙魚SS基因的cDNA全長(GenBank登錄號：JX441994)。

2.2 黃顙魚SS基因的生物信息學

黃顙魚SS基因cDNA全長共694 bp，其中 5′端非翻譯區(qū)139 bp(1～139)，3′端非翻譯區(qū)211 bp(483～694)，開放閱讀框為345 bp，編碼114個氨基酸。蛋白質預測結果顯示，SS蛋白分子質量為 12 412.2 u，分子式為C538H874N154O166S8；理論等電點(pI)為6.26；該蛋白在水溶液中280 nm處的摩爾消光系數(shù)為7 240 mol/(L·cm)，不穩(wěn)定系數(shù)為 43.69，說明該基因表達的蛋白為不穩(wěn)定蛋白；若其成熟肽N端為丙氨酸時，在酵母和大腸桿菌中表達的半衰期分別大于20和10 h。疏/親水性預測表明，該蛋白存在一個高分值峰(得分>1.5)，在第16個氨基酸處其疏水性最大值為3.078；存在8個低分值峰(得分<-1)，在第101個氨基酸處其親水性最小值為-2.211，SS蛋白是一個親水蛋白(得分<0)。

2.3 黃顙魚SS基因編碼的氨基酸序列比對及系統(tǒng)發(fā)育樹的構建

用NCBI的Protein Blast對黃顙魚SS基因所推導的多肽氨基酸序列進行同源性比對，黃顙魚與同為鲇形目黃顙魚屬的瓦氏黃顙魚(Pelteobagrusvachellii，登錄號ADX32485)SS基因編碼的氨基酸序列同源性最高，為98%，與鲇形目的斑點叉尾鮰(Ictaluruspunctatus，登錄號NP001187259)同源性為89%，與草魚(登錄號ACB69423)、金魚(登錄號AAD09359)、厚頜魴(登錄號AAO92644.1)、斑馬魚(登錄號AAH76254)、大西洋鮭(登錄號NP001134573)和鎧甲弓背魚(登錄號AAK97070)的同源性分別為72%，73%，72%，73%，68%和75%，與雞、牛和人的同源性也較高。表明該蛋白在不同物種中均有較高的保守性(圖2)。

運用MEGA 5.0軟件構建了20個不同物種SS基因編碼氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)育樹，結果(圖3)顯示，黃顙魚與同屬于鲇形目的瓦氏黃顙魚、斑點叉尾鮰首先聚為一支，然后與草魚、金魚、厚頜魴、斑馬魚、大西洋鮭和鎧甲弓背魚聚為一支。

2.4 SS基因在黃顙魚胚胎發(fā)育階段的表達

采用實時熒光定量RT-PCR(Real-time RT-PCR)檢測黃顙魚SS基因在胚胎發(fā)育階段的表達情況，結果見圖4。從圖4可以看出，與受精卵時期相比，SS基因在黃顙魚的2細胞期至囊胚期的表達水平略有下降，但差異不顯著(P>0.05)；自原腸早期至出膜期SS基因表達量有增高的趨勢，其中在心跳期、出膜期其表達量顯著高于受精卵時期(P<0.05)。

2.5 SS基因在黃顙魚胚后發(fā)育階段的表達

圖5顯示，黃顙魚在出膜后的1～20 d，SS基因都有表達，只是3～4 d表達量有所下降，在其他時間SS表達水平變化不大。

2.6 SS基因在黃顙魚各組織中的表達

采用半定量RT-PCR檢測黃顙魚SS基因在心臟、肌肉、腦、胃、肝臟、腎臟、鰓、脾臟、性腺9個組織中的表達情況，結果表明，SS只在腦組織中特異性表達，在其他組織中都沒有表達(圖6)。

3 討 論

SS是一種廣泛分布于中樞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)中的多功能肽，在魚類中調節(jié)機體的生長、發(fā)育和代謝等多個生理過程[1-4]。本研究成功獲得了黃顙魚SS基因的cDNA全長序列(GenBank登錄號為JX441994)，對包括黃顙魚在內的20個不同物種SS基因編碼氨基酸序列的同源性分析表明，SS基因在脊椎動物進化史中具有高度的保守性。從系統(tǒng)發(fā)育樹來看，同為鲇形目的黃顙魚、瓦氏黃顙魚和斑點叉尾鮰首先聚為一支，然后與草魚、金魚、厚頜魴、斑馬魚、大西洋鮭和鎧甲弓背魚聚為一支，高首鱘、中華鱘與人、牛和雞聚為另一支，該結果與Lin等[5]和Quan等[7]的研究結果相似，表明SS是一個比較古老的基因。

本研究中，SS基因在黃顙魚胚胎發(fā)育階段及胚后發(fā)育過程中的表達表明，在黃顙魚整個胚胎發(fā)育時期，SS基因都有表達，從受精卵時期到囊胚期略有下降，但差異不顯著(P>0.05)，從原腸早期至出膜期其表達量有升高的趨勢，在心跳期和出膜期其表達量均較高，顯著高于受精卵時期的表達量(P<0.05)。Xu等[6]在研究大西洋鱈魚時發(fā)現(xiàn)，SS基因在大西洋鱈魚胚胎期均有表達，且表達呈上升趨勢。斜帶石斑魚的胚胎發(fā)育至幼體孵化過程中均可檢測到SS的表達，且SS表達量隨著胚胎發(fā)育時期的推進而升高，在出膜前表達量達到最高，出膜后表達量變化不大，維持在一個較高水平[15]。在虹鱒整個胚胎發(fā)育過程中也能檢測到SS基因的表達，且隨著胚胎發(fā)育時期的推進SS基因的表達量增加[19]。在斑馬魚胚胎發(fā)育過程中，SS基因在受精24 h后即可被檢測到，從受精24 h到出膜期SS一直有表達，且表達量逐漸增加[20]。本研究中，在黃顙魚胚后發(fā)育過程中，SS基因表達水平比較穩(wěn)定。不同魚類其SS基因在早期發(fā)育階段的表達水平有所差異，但都是在出膜前表達量達到最大，且胚后時期維持在一個較平穩(wěn)水平。黃顙魚SS基因在出膜期表達量最高，胚后發(fā)育過程中其維持在一個平穩(wěn)水平，從黃顙魚胚胎發(fā)育過程中SS基因的動態(tài)表達水平來看，SS基因對黃顙魚早期胚胎的發(fā)育無太大影響，其主要在原腸期開始發(fā)揮調控作用。

在不同物種的成體組織中，SS基因的表達情況不盡相同。Li等[10]在中華鱘的腦垂體、下丘腦、端腦、延腦中均檢測到SS的表達；葉星[21]在斜帶石斑魚各個組織中得到了與中華鱘相似的結果，SS在端腦、脊髓、延腦、下丘腦、嗅球都有表達；代威等[11]在鱖腦組織中檢測到了SS基因的表達。本研究中，SS基因只在黃顙魚成魚的腦組織中表達，這與上述研究結果一致。但前人在一些魚類的外周組織中也檢測到了SS的表達，如Kittilson等[22]運用Northern blot檢測了SS在虹鱒體內各個組織的表達情況，發(fā)現(xiàn)腦、胃、腸組織都有SS的表達，其中以腦組織中SS表達量最高。黃顙魚SS基因在腦中的特異性表達說明，SS是一種專一的調節(jié)激素，只參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)對生長激素釋放的調控。

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Cloning and expression analysis ofsomatostatingene inPelteobagrusfulvidraco

LIANG Hong-wei1,2,CAO Lei1,3,LI Zhong1,3,ZOU Gui-wei1,3

(1YangtzeRiverFisheriesResearchInstitute,ChineseAcademyofFisheriesScience,Wuhan,Hubei430223,China;2FreshwaterAquacultureCollaborativeInnovationCenterofHubeiProvince,Wuhan,Hubei430070,China;3CollegeofFisheries,HuazhongAgriculturalUniversity,Wuhan,Hubei430070,China)

【Objective】 The objectives of this experiment were to clonesomatostatin(SS) gene sequence ofPelteobagrusfulvidracoand analyze the sequence and its expression characterization.【Method】 A pair of primers were designed based on conserved domain ofSSgene ofPelteobagrusvachelliiandIctaluruspunctatus.The conserved domain ofSSgene was cloned fromPelteobagrusfulvidracobrain total RNA by PCR method.Then two pairs of specific primers based on their middle conserved sequences were used to obtain 5′and 3′end sequences.The full sequence ofSScDNA ofPelteobagrusfulvidracowas obtained by combining the middle conserved fragment with 5′and 3′end sequences.The homologous analysis was performed based on encoding amino acid sequences ofPelteobagrusfulvidracoand other fishes using online Protein Blast,and Phylogenetic tree was constructed by MEGA 5.0.Real-time PCR was used to analyze the expression patterns during the embryonic development stage and postembryonic development stage ofSSgene (1-20 d).Distribution and expression levels ofSSgene in tissues including brain,heart,muscle,stomach,liver,kidney,gill,spleen and gonad were analyzed by semi-quantitative RT-PCR.【Result】 The full-length ofSScDNA inPelteobagrusfulvidracowas 694 bp,containing 139 bp 5′-untranslated region and 211 bp 3′-untranslated region.The length of open reading frame (ORF) was 345 bp encoding 114 amino acids and had high homology withPelteobagrusvachellii(98%).The phylogenetic analysis showed thatPelteobagrusfulvidraco,PelteobagrusvachelliiandIctaluruspunctatuswere from one group.The somatostatin gene was expressed in the whole embryonic development stage and postembryonic development of 20-day old juveniles.The expression levels in the heart beat stage and hatch out stage were significantly higher than in fertilized egg (P<0.05).SSmRNA was only detected in brain of adultPelteobagrusfulvidraco.【Conclusion】 The expression patterns of somatostatin gene were preliminarily proved and somatostatin gene may play an important role in postembryonic development ofPelteobagrusfulvidraco.

Pelteobagrusfulvidraco;somatostatin;gene clone;expression characterization

2013-11-01

國家“863”計劃項目(2011AA100401)；國家水產種質資源平臺項目

梁宏偉(1978-)，男，山西繁峙人，副研究員，主要從事水產動物遺傳育種研究。 E-mail：lianghw@yfi.ac.cn

鄒桂偉(1963-)，男，安徽廬江人，研究員，主要從事魚類遺傳育種研究。E-mail：zougw@yfi.ac.cn

時間:2015-01-19 09:19

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.03.030

S965.199；Q786

A

1671-9387(2015)03-0043-08

網(wǎng)絡出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20150119.0919.030.html