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FXR在肝細胞癌組織和癌旁正常組織中的差異表達

孟祥寬1,劉念1，馮虎1,陳玉丙1,王欣2*

(吉林大學第二醫(yī)院 1.放療科;2.檢驗科，吉林 長春130041)

肝細胞癌(HCC)占原發(fā)性肝癌的90%。每年大約有67萬新發(fā)病例，在全世界惡性腫瘤中，發(fā)病率占第五位，而死亡率則排第三，嚴重危害人民的健康[1]。HCC的發(fā)生和發(fā)展是一個涉及多因素、多基因和多步驟的復(fù)雜過程[2]，其具體機制仍在不斷探索之中。近年來，越來越多的證據(jù)顯示長期高水平膽汁的刺激、脂肪肝等機體代謝失調(diào)與HCC的發(fā)生有關(guān)[3，4]。法尼酯X受體(FXR)是核受體超家族的一員，人的FXR基因定位于12號染色體(12q23.1)，主要在肝、小腸、腎及腎上腺組織中表達，調(diào)節(jié)膽汁酸代謝、膽固醇代謝、脂代謝，有維持機體代謝穩(wěn)態(tài)的作用[5]?？梢奆XR的正常表達對抑制HCC的發(fā)生有很大意義。在動物實驗中，Yang F[6]首次發(fā)現(xiàn)FXR基因敲除的小鼠將會自發(fā)形成HCC，隨后Kim[7]的研究也證實了這一結(jié)論。但是，人HCC的形成與FXR表達的關(guān)系尚不清楚。本研究擬通過分析50例臨床HCC患者癌組織及癌旁正常組織FXR表達的差異，探討人HCC的形成與FXR表達的變化關(guān)系。為HCC的臨床治療實踐制定新策略及藥開發(fā)新靶點提供理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1　材料

1.1.1病例來源選取2012年08月至2013年12月吉林大學第二醫(yī)院肝膽外科住院接受肝切除術(shù)治療的50例HCC患者的肝癌組織及癌旁正常組織。患者病歷資料完整，均于術(shù)后經(jīng)吉大二院病理科病理檢查證實為肝細胞癌，所有病例術(shù)前均未行放化療及免疫治療。組織標本于術(shù)后立即切取，取癌旁組織(距癌組織5 cm以上)作為對照組。甲醛固定，石蠟包埋。

1.1.2試劑鼠抗人FXR單克隆抗體(Abbiotec，購自深圳市豪地華拓生物科技有限公司)免疫組化染色試劑盒(即用型免疫組化 kit-9710，購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司)。

1.2　方法

1.2.1免疫組織化學法對癌組織和癌周正常組織FXR進行免疫組化染色。所有標本均經(jīng)過甲醛固定，石蠟包埋，4um連續(xù)切片，常規(guī)HE染色，鏡檢。將載玻片用二甲苯脫石蠟，隨后用乙醇和PBS洗滌。組織切片用EDTA緩沖液高壓修復(fù)10 min，修復(fù)后的切片在緩沖液中冷卻后，滴加過氧化物酶阻斷溶液；用50-100 ml血清封閉，滴加一抗，4℃冰箱孵育過夜；滴加生物素標記的第二抗體，室溫10 min；滴加鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶溶液，室溫10 min；DAB顯色，蘇木素復(fù)染2 min，鹽酸酒精分化，氨水返藍，過酒精(80% 2 min，90% 2 min，95% 2 min，100% 5 min，100% 5 min)，過二甲苯 3 min，過二甲苯 3 min；樹脂封片，鏡檢。

1.2.2結(jié)果判定 觀察肝癌和癌旁組織中陽性細胞所占比例和細胞核FXR陽性染色的強弱，并使用IMAGE PRO軟件處理圖像得到灰度值。

1.3統(tǒng)計學處理Excel表格收集數(shù)據(jù)，除6例患者癌旁組織資料缺失外，對其余44例患者的肝癌組織與癌旁正常組織FXR表達差值進行正態(tài)分布檢驗，如符合正態(tài)分布，采用配對t檢驗分析肝癌和癌旁組織中FXR表達的差異，如不符合正態(tài)分布，校正后進行配對T檢驗，全部統(tǒng)計過程通過SPSS21.0實現(xiàn)。

2結(jié)果

2.1臨床特征分析收集的50例HCC患者的94個臨床組織標本(肝癌組織50例，癌旁組織44例)的臨床特征詳細列于表1。可見肝癌高發(fā)年齡段為40-60歲，男性明顯多于女性，可能與男性飲酒、肥胖有關(guān)。

2.2FXR在肝癌和癌旁組織中的表達所有選定的肝癌患者均經(jīng)過HE染色組織病理學確診為肝細胞癌(見圖1 A，A′，B，B′)。通過免疫組織化學染色法檢測，我們發(fā)現(xiàn)FXR在肝細胞癌組織中核FXR陽性染色較淺，呈黃色，且陽性細胞所占比例小(見圖1 E，E′，F(xiàn)，F(xiàn)′)。而癌旁正常組織中核FXR陽性染色較深，呈黃褐色；且陽性細胞所占比例大(見圖1C，C′，D，D′)。

表1　94例組織樣本的臨床特征

2.3免疫組化圖像的相對灰度值分析使用IMAGE PRO軟件對肝細胞癌和癌旁組織的免疫組化結(jié)果分析得到相對灰度值。將癌旁組織資料缺失的6例患者去除，將剩余的44例患者的肝癌組織與癌旁組織組成配對資料。FXR表達量的差值行正態(tài)分布分析，均值=0.09，標準偏差=0.034，中值=0.08，眾數(shù)=0.07，采用Kolmogorov-Smirnov及Shapiro-wilk法檢驗，P值分別為0.094和0.397，符合正態(tài)分布(見圖2，3)。用配對t檢驗分析肝癌組織與癌旁組織FXR表達量的差異，結(jié)果顯示FXR在肝癌組織中的表達與癌旁組織相比顯著降低(t=14.765，P<0.00001)，見表2。

圖1　兩例HCC患者癌組織和癌旁組織FXR的表達差異

圖2　肝癌組織與癌旁組織FXR表達量差值的

圖3　肝癌組織與癌旁組織FXR表達量比較

3討論

近期研究[6,7]報道了FXR基因敲除的小鼠將會自發(fā)形成HCC，而人HCC的發(fā)生與FXR表達情況的關(guān)系目前還不太清楚。本研究選取了來自50例HCC患者的94個標本(包括肝癌組織50例及癌周正常組織44例)，通過免疫組化染色分析了FXR在癌組織及癌旁正常組織的表達情況，檢測結(jié)果提示肝癌組織與癌旁正常組織相比陽性細胞所占比例小，且核FXR陽性染色較淺。使用IMAGE PRO圖象分析儀得到的灰度值，通過配對t檢驗顯示FXR在肝癌組織中的表達與癌旁組織比較顯著降低(P<0)。不獨有偶， Lax S[8]等研究發(fā)現(xiàn)人結(jié)腸癌組織與癌周組織比較 FXR 表達下降，其下降程度與腫瘤的惡性程度呈正相關(guān)。這可能與FXR下調(diào)造成的長期高水平膽汁酸的潛在致癌性有關(guān)。

表2　肝癌組織與癌旁組織FXR表達量配對t檢驗的結(jié)果

研究表明[9]FXR被內(nèi)源性配體膽汁酸或人工合成配體激活后,與視黃醛X受體(retinoidX receptor,RXR)結(jié)合形成異二聚體,通過與靶基因中稱為FXR反應(yīng)元件的特定核苷酸序列結(jié)合而調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄。通過抑制膽汁酸合成途徑中的膽固醇7-α羥化酶而控制膽固醇轉(zhuǎn)變?yōu)槟懼?，促進肝膽汁酸的排泄并減少腸肝循環(huán)中膽汁酸的回吸收，從而保護膽汁的過度負荷對肝臟造成的損害。Zhang Y[10]發(fā)現(xiàn)FXR還可以通過小異二聚體伴侶(SHP)促進細胞凋亡和抑制細胞增殖，活化的FXR可能不僅對非腫瘤細胞的增殖重要，還可能阻斷腫瘤的生長。

FXR表達的減少可能出現(xiàn)在正常肝細胞逐步惡變到肝癌的過程中，由于我們沒有系統(tǒng)地分析肝細胞變性、肝炎、肝硬化到肝癌的整個過程，我們不能確定FXR表達缺失到底發(fā)生在癌變的哪一個環(huán)節(jié)。其中的變化機制值得我們進一步的研究。

FXR參與體內(nèi)代謝平衡、細胞的增殖和凋亡，甚至在HCC發(fā)展中的具有潛在作用，這一結(jié)論可能會打開HCC預(yù)防和治療的新途徑。由于正常肝組織逐漸惡變到肝癌與FXR表達降低甚至喪失有關(guān)，通過刺激FXR的信號通路來調(diào)節(jié)細胞增殖和分化可能成為一種新的治療癌癥的靶點或策略。

參考文獻：

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[6]Yang F,Huang X,Yi T,et al.Spontaneous development of liver tumors in the absence of the bile acid receptor farnesoid X receptor[J].Cancer Res，2007，67(3):863．

[7]Kim I,Morimura K,Shah Y,et al.Spontaneous hepatocarcinogenesis in farnesoid X receptor-null mice[J].Carcinogenesis，2007，28(5):940．

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[9]Zhang Y,Kast-Woelbern HR,Edwards PA.Natural structural variants of the nuclear receptor farnesoid X receptor affect transcriptional activation[J].J Biol Chem，2003，278(1):104.

[10]Zhang Y,Soto J,Park K,et al.Nuclear receptor SHP,a death receptor that targets mitochondria,induces apoptosis and inhibits tumor growth[J].Mol Cell Biol，2010，30:1341.

(收稿日期：2014-09-18)

文章編號：1007-4287(2015)07-1169-03

*通訊作者

基金項目：本論文研究受吉林省科技廳項目資助(項目編號為：201215072)