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胃癌患者多種高通量譜表達(dá)數(shù)據(jù)聯(lián)合分析對(duì)相關(guān)基因篩選的臨床價(jià)值

李如凱1,郭龍華2

(1.深圳市寶安區(qū)石巖人民醫(yī)院 檢驗(yàn)科,廣東 深圳518108;2.深圳市龍華新區(qū)人民醫(yī)院 檢驗(yàn)科,廣東 深圳518109)

胃癌為臨床上一種常見的惡性腫瘤，占據(jù)所有的惡性腫瘤中較高的比例，為當(dāng)前危害人類生命健康的主要疾病之一?，F(xiàn)在，在臨床上仍然沒(méi)有明確的胃癌發(fā)病機(jī)制，很多學(xué)者認(rèn)為，胃癌的產(chǎn)生為多基因參與并且是不斷積累的過(guò)程，其中涉及到癌基因、生物因子的受體、微衛(wèi)星的不穩(wěn)定以及細(xì)胞周期的調(diào)控等諸多改變[1]。對(duì)胃癌發(fā)病機(jī)制的深入認(rèn)識(shí)有助于提高胃癌的臨床診斷率，為疾病的進(jìn)一步治療提供重要依據(jù)。本文主要以我院2010年1月至2013年12月50例胃癌患者的胃鏡活檢標(biāo)本為研究對(duì)象，分析了采取多種高通量譜表達(dá)數(shù)據(jù)聯(lián)合分析并篩選胃癌相關(guān)基因的臨床應(yīng)用價(jià)值。具體操作如下。

1資料與方法

1.1　一般資料

回顧性分析選取我院2010年1月至2013年12月50例胃癌粘膜組織胃鏡活檢標(biāo)本。正常胃粘膜組織50例。取樣后迅速置于液氮中備用。

1.2　數(shù)據(jù)分析與RT-PCR方法

采用vNorthern篩查10個(gè)已知胃癌基因。在這其中應(yīng)用了腫瘤基因的解剖工程(CGAP)它的數(shù)據(jù)庫(kù)中根據(jù)EST數(shù)據(jù)的SAGE-Digital Gene Expression Displayer(SAGE DGED)以及cDNA-Digital Gene Expression Displayer (cDNA DGED)來(lái)進(jìn)行篩查有胃癌的組織和正常的胃組織中的差異表達(dá)基因，將上述篩選出的基因進(jìn)行SAGE vNorthern和EST vNorthern比對(duì)，選取在SAGE vNorthern和EST vNorthern數(shù)據(jù)庫(kù)中在胃癌組織和正常胃組織中表達(dá)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的基因，與SMD數(shù)據(jù)庫(kù)中胃癌微陣列表達(dá)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)比分析，最后選取4個(gè)候選胃癌差異基因，采用RT-PCR法進(jìn)一步在胃癌組織和正常胃組織共100例中進(jìn)行驗(yàn)證。

1.3　統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2結(jié)果

2.1　對(duì)于利用vNorthern篩查胃癌相關(guān)基因的可行性分析

采用vNorthern篩查包括PGC、bcl-2、c-met、c-myc、PCNA、GDDR、P53、TFF2、Ha-ras、E-cadherin10個(gè)已知胃癌基因。其中：PGC、PCNA、P53、c-met、c-myc、Ha-ras在胃癌組織中表達(dá)高于正常組織，E-cadherin在正常組織中表達(dá)高于癌組織。GDDR、TFF2幾乎僅在正常胃組織中表達(dá)。我們發(fā)現(xiàn)，在vNorthern分析數(shù)據(jù)中，個(gè)別基因在部分組織中表達(dá)情況和數(shù)據(jù)不符，可能與該數(shù)據(jù)庫(kù)收錄數(shù)據(jù)情況有關(guān)。

2.2　數(shù)據(jù)庫(kù)cDNADGED和SAGEDGED胃癌差異表達(dá)基因篩查

2.2.1cDNADGED胃癌差異表達(dá)基因篩查

cDNADGED中進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)胃癌和正常胃組織表達(dá)相差≥2倍的基因(前10個(gè))，見表1。從cDNADGED中抽取100個(gè)以上的序列文庫(kù)，共對(duì)比了142個(gè)cDNA的文庫(kù)，在這其中有胃癌組98個(gè),包括111042個(gè)序列，而正常組有44個(gè)，共有27889個(gè)序列。運(yùn)用cDNADGED工具進(jìn)行分析，結(jié)果具有大于2倍差異水平統(tǒng)計(jì)學(xué)的意義(P<0.05)的基因247個(gè)，其中胃癌組織中高表達(dá)的基因92個(gè)，低表達(dá)的基因155個(gè)。

2.2.2SAGEDGED胃癌差異表達(dá)基因篩查

SAGEDGED中進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)胃癌和正常胃組織表達(dá)相差≥2倍的基因(前10個(gè))，見表2。分析過(guò)7個(gè)胃組織的短序列標(biāo)簽的SAGE文庫(kù)，其中有300741個(gè)短序列的標(biāo)簽，胃癌組有4個(gè)SAGE文庫(kù)其中包括短序列的標(biāo)簽有249310個(gè)，而正常組中3個(gè)SAGE文庫(kù)就有短序列標(biāo)簽共51431個(gè)。通過(guò)DEGD工具的分析，結(jié)果顯示共有196個(gè)標(biāo)簽大于2倍差異水平并且具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，在這196個(gè)標(biāo)簽中有69個(gè)基因有胃癌組的高表達(dá),還有127個(gè)低表達(dá)基因。

表1　　cDNADGED中進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)胃癌和正常胃組織

2.3　利用vNorthern來(lái)對(duì)SAGE DGED以及cDNA DGED進(jìn)行篩查出胃癌的差異還有表達(dá)基因的進(jìn)一步比對(duì)分析

表2　SAGE DGED中進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)胃癌和正常胃組織

通過(guò)SAGE vNorthern和EST vNorthern對(duì)DNA DGED和SAGE DGED篩選的差異基因進(jìn)行比對(duì)，共篩選出的基因在ESTvNorthern及SAGE vNorthern數(shù)據(jù)中有38個(gè)都有統(tǒng)計(jì)學(xué)的意義，P<0.05，部分見表3。

表3　vNorthern分析和胃癌組織和正常胃組織部分差異基因

2.4　利用SMD數(shù)據(jù)庫(kù)中胃組織微陣列數(shù)據(jù)結(jié)合vNorthern篩查基因進(jìn)一步比對(duì)

將vNorthern篩選得到的38個(gè)基因和在SMD數(shù)據(jù)庫(kù)中的微陣列的胃組織進(jìn)行數(shù)據(jù)對(duì)比，共研究的胃癌患者有88例以及正常胃組織的23例,經(jīng)過(guò)對(duì)比分析總共篩選出有一致的差異基因共有9個(gè)，正常胃組織見表4。

2.5　ANXA10、PSCA、AGR2和ANXN1基因在胃癌組織和正常胃組織中的表達(dá)分析

ANXA10、PSCA、AGR2和ANXN1基因在胃癌組織和正常胃組織中的表達(dá)分析，見表5。在胃癌組織中，ANXA1的表達(dá)顯著高于正常胃組織，而PSCA、AGR2和ANXN1表達(dá)顯著低于正常胃組織，P<0.01。

表4　v Northern分析和virtural micrroarray分析共同

表5　ANXA10、PSCA、AGR2和ANXN1基因在胃癌組織和

3討論

至今，在臨床上胃癌還沒(méi)有一個(gè)明確的發(fā)病機(jī)制，大多數(shù)的學(xué)者認(rèn)為，多基因的參與并且逐漸積累就會(huì)形成胃癌，其中涉及到細(xì)胞周期調(diào)控、癌基因、生長(zhǎng)因子的受體、微衛(wèi)星的不穩(wěn)定等諸多改變[2]。對(duì)胃癌發(fā)病機(jī)制的深入認(rèn)識(shí)有助于提高胃癌的臨床診出率，為疾病的進(jìn)一步治療提供重要依據(jù)。近年來(lái)，在臨床上對(duì)胃癌的發(fā)病機(jī)制加大了研究的力度，并且還得到了一定的進(jìn)展。

cDNA文庫(kù)以芯片技術(shù)為基礎(chǔ)，是當(dāng)前運(yùn)用較普遍的一種數(shù)據(jù)庫(kù)，當(dāng)前主要芯片數(shù)據(jù)庫(kù)包括ArrayExpress數(shù)據(jù)庫(kù)、基因表達(dá)匯編以及斯坦福微陣列數(shù)據(jù)庫(kù)[3]。但是由于芯片技術(shù)發(fā)展時(shí)間較短，所傳遞的信息量有限[4]。在實(shí)際運(yùn)用中，具有較高的假陽(yáng)性率，在腫瘤基因的檢測(cè)中具有一定的局限性[5]。SAGE文庫(kù)是一種以SAGE技術(shù)為基礎(chǔ)的表達(dá)譜數(shù)據(jù)庫(kù)。在實(shí)際運(yùn)用過(guò)程中，SAGE文庫(kù)要求的測(cè)序次數(shù)較少，在低豐度的轉(zhuǎn)錄本信息的檢測(cè)中，具有較高的靈敏度[6]。相關(guān)研究表明[7,8]，SAGE數(shù)據(jù)庫(kù)在胃癌腫瘤差異表達(dá)基因的篩選中具有較高的應(yīng)用價(jià)值?？傊?，高通量譜表達(dá)數(shù)據(jù)技術(shù)的原理不同，其在腫瘤基因篩選中的敏感性也各不相同，因此，對(duì)于胃癌患者胃癌相關(guān)基因的篩選可以聯(lián)合應(yīng)用不同種類的高通量譜表達(dá)數(shù)據(jù)技術(shù)，以提高數(shù)據(jù)庫(kù)信息挖掘的準(zhǔn)確性，極大程度上降低篩選假陽(yáng)性率，提高胃癌的診斷準(zhǔn)確性[9]。

本研究通過(guò)對(duì)100例胃癌患者的活檢標(biāo)本采取多種高通量譜表達(dá)數(shù)據(jù)聯(lián)合分析并篩選胃癌相關(guān)基因，結(jié)果顯示，v Northern數(shù)據(jù)分析能篩選出胃癌相關(guān)基因。在cDNA DGED中抽取了100個(gè)以上的序列文庫(kù)，總共對(duì)比的cDNA文庫(kù)有142個(gè)，其中胃癌組患者有98個(gè),這其中包括了111042個(gè)序列，而正常組有44個(gè)，總共有27889個(gè)序列。通過(guò)采用cDNA DGED工具的分析，結(jié)果顯示共有247個(gè)基因大于2倍差異水平并且具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這其中包括有92個(gè)高表達(dá)的胃癌組織，還有155個(gè)基因是低表達(dá)，表明cDNA文庫(kù)能有效地篩選胃癌相關(guān)基因。分析了SAGE文庫(kù)中的7個(gè)胃組織短序列的標(biāo)簽，其中共有短序列標(biāo)簽300741個(gè)，胃癌組中4個(gè)SAGE文庫(kù)總共包括249310個(gè)短序列標(biāo)簽，在正常組中3個(gè)SAGE文庫(kù)總共有51431個(gè)短序列標(biāo)簽,。通過(guò)運(yùn)用DEGD工具進(jìn)行分析，結(jié)果顯示共有196個(gè)標(biāo)簽大于2倍差異水平并且具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中胃癌組高表達(dá)的基因69個(gè),低表達(dá)的基因127個(gè)，表明SAGE文庫(kù)有效地篩選胃癌相關(guān)基因。此外，利用SAGE vNorthern和EST vNorthern對(duì)DNA DGED和SAGE DGED篩選的差異基因進(jìn)行比對(duì)，在ESTvNorthern以及SAGE vNorthern數(shù)據(jù)中都具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的基因共有38個(gè)，P<0.05。將通過(guò)vNorthern篩選得到的38個(gè)基因和SMD數(shù)據(jù)庫(kù)中的胃組織微陣列進(jìn)行數(shù)據(jù)對(duì)比，共研究的胃癌患者有88例以及正常胃組織的23例,經(jīng)過(guò)對(duì)比分析總共篩選出有一致的差異基因共有9個(gè)。在胃癌組織中，ANXA1的表達(dá)顯著高于正常胃組織，而PSCA、AGR2和ANXN1表達(dá)顯著低于正常胃組織，表明SAGE vNorthern和EST vNorthern有效地篩選胃癌相關(guān)基因，這個(gè)結(jié)果于相關(guān)文獻(xiàn)所報(bào)道的數(shù)據(jù)是相吻合的[10]。

參考文獻(xiàn)：

[1]Ting,Peng Hongzheng.Characterization and expression patterns of microRNAs involved in rice grain filling[J].PloS one,2013，8(1):442.

[2]劉振華.利用高通量基因芯片建立與分析單側(cè)隱睪癥睪丸基因表達(dá)譜 [J].中華男科學(xué)雜志,2013，19(2):56.

[3]Yepeng,Sun Fawei.Transcriptome exploration in Leymus chinensis under saline-alkaline treatment using 454 pyrosequencing[J].PloS one,2013，8(1):66.

[4]張明霞,陳心春 .高通量測(cè)序技術(shù)分析肺結(jié)核患者PBMC基因表達(dá)譜差異[J].中國(guó)免疫學(xué)雜志,2013，29(6):43.

[5]路新華,李韶菁.白介素-1β轉(zhuǎn)化酶抑制劑的高通量篩選[J].中國(guó)抗生素雜志,2011，36(5):1991.

[6]龔汶.原癌基因Pokemon在原發(fā)性肝癌患者外周血中的表達(dá)及意義[J].中西醫(yī)結(jié)合肝病雜志,2013，23(4):12-.

[7]丁士剛,王麗.應(yīng)重視胃癌發(fā)病機(jī)制的規(guī)范研究[J].中華醫(yī)學(xué)雜志,2013，93(16):113.

[8]張帆,袁耀宗.幽門螺桿菌相關(guān)胃癌與微小核糖核酸的研究進(jìn)展[J].中華消化雜志,2013，33(05):4.

[9]潘晟,羅浩,李力.胃癌變患者c-myc mRNA與幽門螺桿菌感染及細(xì)胞程序性死亡的關(guān)系[J].中華實(shí)驗(yàn)外科雜志,2013，30(11):89.

[10]盧建華,龐彥超,陳劍英.LAMA-3基因在胃癌組織中的表達(dá)及其臨床意義[J].中華實(shí)驗(yàn)外科雜志,2013，30(11):58.

(收稿日期：2014-05-27)

文章編號(hào)：1007-4287(2015)07-1166-03