姜艷麗,劉　磊,王雪野*,劉龑航

(1.吉林省人民醫(yī)院 腫瘤科;2.吉林省人民醫(yī)院 腫瘤生物治療中心，吉林 長(zhǎng)春130021)

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外周血CD4+CD25+CD127low調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在惡性腫瘤患者免疫功能評(píng)估中的作用

姜艷麗1,劉磊2,王雪野1*,劉龑航1

(1.吉林省人民醫(yī)院 腫瘤科;2.吉林省人民醫(yī)院 腫瘤生物治療中心，吉林 長(zhǎng)春130021)

摘要：目的觀察惡性腫瘤患者外周血CD4+CD25+CD127low調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(CD4+CD25+CD127lowTreg)的數(shù)量變化，探討外周血CD4+CD25+CD127lowTreg檢測(cè)在惡性腫瘤患者免疫功能評(píng)估中的作用。方法以35例正常人作為對(duì)照組，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)74例腫瘤患者外周血CD4+CD25+CD127lowTreg在CD4+T細(xì)胞的比例，分析不同TNM分期惡性腫瘤患者外周血中CD4+CD25+CD127lowTreg占CD4+T細(xì)胞的百分比，采用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR技術(shù)檢測(cè)PBMC轉(zhuǎn)錄因子Foxp3表達(dá)水平。結(jié)果腫瘤患者外周血中CD4+CD25+CD127lowTreg占CD4+T細(xì)胞百分比為(6.19±1.82)%，明顯高于對(duì)照組(3.12±1.16)%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。其中Ⅲ、Ⅳ期患者外周血CD4+CD25+CD127lowTreg百分比分別為(6.08±2.14)%、(6.88±2.65)%，明顯高于Ⅰ-Ⅱ期患者(5.65±1.86)%，P<0.05；病理分型為低分化者CD4+CD25+CD127lowTreg百分比為(6.72±2.60)%，明顯高于高分化者(5.94±2.11)%，P<0.05；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者CD4+CD25+CD127lowTreg百分比為(6.95±3.12)%，明顯高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者(5.02±2.09)%，P<0.05。結(jié)論惡性腫瘤患者外周血CD4+CD25+CD127lowTreg占CD4+T細(xì)胞的比例明顯升高，監(jiān)測(cè)CD4+CD25+CD127lowTreg有利于評(píng)估腫瘤患者的免疫功能和輔助判斷腫瘤患者的病情進(jìn)展及預(yù)后。

(ChinJLabDiagn,2015,19:1117)

免疫功能的評(píng)估對(duì)于掌握腫瘤患者的最佳治療時(shí)機(jī)和制定合理的診療方案，評(píng)價(jià)治療的效果均具有重要意義。T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫功能是機(jī)體抗腫瘤免疫的主要方式，外周血中CD4和CD8兩類(lèi)T細(xì)胞亞群的相互制約維系著機(jī)體免疫系統(tǒng)的平衡。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤患者常表現(xiàn)為T(mén)細(xì)胞亞群比例失調(diào)，免疫抑制因子的升高和或免疫促進(jìn)分子表達(dá)水平的降低[1,2]。我們觀察發(fā)現(xiàn)，CD4+CD25+Treg細(xì)胞在腫瘤患者中比例顯著增加，CD4+CD25+Treg細(xì)胞比例的下調(diào)有助于提供機(jī)體的抗腫瘤效應(yīng)和利于腫瘤的治療效果[3]。Foxp3被認(rèn)為CD4+CD25+Treg細(xì)胞的重要標(biāo)記物，因其在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，因而需要對(duì)細(xì)胞固定和穿孔后才能堅(jiān)定，降低其的臨床實(shí)用性。CD127的表達(dá)與Foxp3成負(fù)相關(guān)，被證實(shí)可以替代Foxp3成為T(mén)reg細(xì)胞的特異性標(biāo)志物。本研究采用流式細(xì)胞儀分析惡性腫瘤患者CD4+CD25+CD127lowTreg表達(dá)情況，探討其在腫瘤臨床診療和免疫評(píng)估的重要意義。

1材料和方法

1.1臨床資料實(shí)驗(yàn)組為本院2012年3月-2014年4月門(mén)診或住院的74例惡性腫瘤患者，男43例， 女31例，年齡20 -81歲，中位年齡52歲，所有病例均經(jīng)病理診斷證實(shí)，臨床分期根據(jù)國(guó)際抗癌協(xié)會(huì)標(biāo)準(zhǔn)，其中肺癌15例，原發(fā)性肝癌19例,胃癌16例，結(jié)直腸腫瘤12例,乳腺癌7例，卵巢癌5例。其中Ⅰ-Ⅱ期42例、Ⅲ期17例、Ⅳ期15例；所有患者未經(jīng)過(guò)抗腫瘤化療及免疫治療。對(duì)照組35例，為本院體檢的健康成人，其中男19例，女16例，年齡26-70歲，中位年齡45歲。

1.2主要試劑及儀器鼠抗人單克隆抗體CD4-FITC、CD25-PC5、CD127-PE，同型對(duì)照IgG1、IgG2、紅細(xì)胞裂解液、流式細(xì)胞儀(EPICS XL)購(gòu)自美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司；PCR擴(kuò)增引物由北京鼎國(guó)公司合成， SYBR Green試劑購(gòu)于廣州達(dá)安基因公司，ABI Prism 7500熒光定量PCR儀器。

1.3外周血CD4+CD25+CD127lowTreg比例檢測(cè)所有被觀察對(duì)象均于清晨空腹采集靜脈血2 ml，經(jīng)EDTA-2K抗凝，使用直接免疫熒光標(biāo)記法標(biāo)記細(xì)胞并進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析。操作步驟：取單克隆抗體CD4-FITC、CD25-PC5、CD127-PE及同型對(duì)照各20 μl，加入100 μl EDTA-2K抗凝的外周血，室溫下避光孵育15 min，再加入紅細(xì)胞裂解液500 μl，避光孵育10 min；加入PBS洗2次，離心1500轉(zhuǎn)，5 min，棄上清后加入適量的PBS，上機(jī)檢測(cè)。

1.4Foxp3 mRNA的熒光定量PCR檢測(cè)上游引物為5’-GTGGCATCATCCGACAAGG-3’；下游引物為5’-TGTGGAGGAACTCTGGGAAT-3’。 TRIZOL Reagent提取PBMC總RNA。參照AMV Reverse transcriptase說(shuō)明方法將總RNA合成cDNA。應(yīng)用SYBR Green嵌合熒光法進(jìn)行Real-Time PCR檢測(cè)，以GADPH作為內(nèi)參對(duì)照，同一cDNA模板均在同一反應(yīng)條件下行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果采用2-ΔΔCT的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)方法。

2結(jié)果

2.1　外周血CD4+CD25+CD127lowTreg比例

流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析顯示(圖1，表1),腫瘤患者治療前外周血CD4+CD25+CD127lowTreg占CD4+T細(xì)胞的比率為(6.19±1.82)%，顯著高于健康對(duì)照組(3.12±1.16)%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。進(jìn)一步對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析顯示，Ⅲ、Ⅳ期腫瘤患者外周血CD4+CD25+CD127lowTreg百分比分別為(6.08±2.14)%、(6.88±2.65)%，明顯高于Ⅰ-Ⅱ期腫瘤患者(5.65±1.86)%，P<0.05。病理分型為低分化者外周血CD4+CD25+CD127lowTreg比例為(6.72±2.60)%，明顯高于高分化者(5.94±2.11)%，P<0.05；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者外周血CD4+CD25+CD127lowTreg比例為(6.95±3.12)%，明顯高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者(5.02±2.09)%，P<0.05。

圖1　外周血CD4+CD25+CD127lowTreg流式分析圖

組別nCD4+CD2+CD127low/CD4+T(%)P值正常對(duì)照組353.12±1.16P<0.05腫瘤患者746.19±1.82腫瘤分期 Ⅰ-Ⅱ期425.65±1.86P<0.05 Ⅲ期176.08±2.14 Ⅳ期156.88±2.65分化程度 中、高度分化315.94±2.11P<0.05 低分化436.72±2.60淋巴轉(zhuǎn)移 無(wú)轉(zhuǎn)移575.02±2.09P<0.05 有轉(zhuǎn)移176.95±3.12

2.2　外周血PBMC中轉(zhuǎn)錄因子Foxp3表達(dá)變化

腫瘤患者外周血PBMC中轉(zhuǎn)錄因子Foxp3表達(dá)與正常組相比均顯著增高(P<0.05)，其中Ⅳ期腫瘤癌患者組Foxp3增高最明顯(P<0.01)，見(jiàn)圖2。

圖2　PMBC中Foxp3 mRNA的相對(duì)表達(dá)量

3討論

研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤患者常處于免疫功能低下?tīng)顟B(tài)，腫瘤發(fā)生時(shí)常伴有外周血中CD4+CD25+Tergs誘導(dǎo)性增高。CD4+CD25+Tregs可抑制機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)，減弱或抑制疫苗誘導(dǎo)的抗腫瘤免疫作用，參與腫瘤免疫逃逸[4]。我們前期對(duì)61例的腫瘤患者評(píng)估研究中證實(shí)[5]，CD4+CD25+Treg的變化與腫瘤的分期密切相關(guān)，是導(dǎo)致腫瘤進(jìn)展重要的因素。

缺乏理想的特異性標(biāo)記是限制研究CD4+CD25+Treg檢測(cè)及分析的最大障礙。CD4+CD25+Treg因?yàn)椴荒馨c活化T細(xì)胞重合的那一部分CD4+CD25+Treg，所以不能完全涵蓋人體內(nèi)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞[6]。叉頭/翼狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子Foxp3是CD4+CD25+Treg在胸腺內(nèi)發(fā)育和功能維持所必需，被認(rèn)為是CD4+CD25+Treg的理想標(biāo)記[7]。本研究利用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)腫瘤患者PBMC中Foxp3的mRNA發(fā)現(xiàn)，腫瘤患者PBMC中轉(zhuǎn)錄因子Foxp3表達(dá)與正常組相比均顯著增高(P<0.05)，其中Ⅳ期腫瘤癌患者組Foxp3增高最降明顯(P<0.05)，可以作為一種良好的標(biāo)記物輔助評(píng)估CD4+CD25+Treg的比例和腫瘤的免疫功能。但由于Foxp3表達(dá)于細(xì)胞內(nèi)，F(xiàn)oxP3標(biāo)記后的細(xì)胞已被破壞，不利于對(duì)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞做進(jìn)一步的培養(yǎng)和研究工作[8]。CD127分子被證實(shí)在Treg細(xì)胞表面呈現(xiàn)低表達(dá)并且與Foxp3的表達(dá)成負(fù)相關(guān)，在CD4+CD25+基礎(chǔ)上聯(lián)合CD127抗原可以更好地識(shí)別人CD4+CD25+Treg[9]。本研究在對(duì)74例惡性腫瘤患者的外周血CD4+CD25+CD127lowTreg含量的分析證實(shí)，CD4+CD25+CD127lowTreg可以較好的評(píng)估腫瘤患者的機(jī)體免疫功能，其在不同類(lèi)型的腫瘤患者均呈現(xiàn)出較健康人群較高的表達(dá)水平，與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果基本一致[10-12]。同時(shí)我們?cè)趯?duì)腫瘤的不同分期中的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，CD4+CD25+CD127lowTreg表現(xiàn)出差異性表達(dá)(P<0.05)，隨著腫瘤的進(jìn)展，機(jī)體免疫功能逐漸降低，與我們前期證實(shí)的利用CD4+CD25+Treg評(píng)估腫瘤的免疫功能呈現(xiàn)出良好的相關(guān)性[3]。

綜上，CD4+CD25+CD127lowTreg的數(shù)量可以作為評(píng)價(jià)腫瘤的發(fā)生發(fā)展的重要監(jiān)測(cè)指標(biāo)。通過(guò)分析CD4+CD25+CD127lowTreg可以更好的評(píng)估和分析其機(jī)體免疫調(diào)節(jié)中的作用。CD4+CD25+CD127lowTreg同時(shí)又可以作為臨床上一種靶點(diǎn)，為抗腫瘤免疫提供新的治療途徑。

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關(guān)鍵詞：腫瘤；CD4+CD25+CD127low調(diào)節(jié)性T細(xì)胞；流式細(xì)胞術(shù)

Expression levels of CD4+CD25+CD127lowregulatory T-cell characterize different populations in human peripheral blood with CancerJIANGYan-li1,LIULei2,WANGXue-ye1*.(1.OncologyDepartmentofJilinProvinceHospital；2.TumorbiotherapycenterofJilinProvinceHospital,Changchun130021，China)

Abstract:ObjectiveThis study is assigned to investigate the changes of CD4+CD25+CD127lowTreg in peripheral blood from cancer patients and explore its clinical significance.MethodsThe proportion of CD4+CD25+CD127lowTreg in CD4+T cells in peripheral blood were measured by flow cytometry in 74 tumor patients and 35 cases of normal people as control .Foxp3 expression were determined by quantitative real?time PCR.ResultsThe ratio of CD4+CD25+CD127lowTreg in CD4+T cell of tumor patients (6.19±1.82%) was obviously higher than that in the healthy control group (3.12±1.16%),the difference was statistically significant (P<0.05).Peripheral blood CD4+CD25+CD127lowTreg level is significantly higher ratio in patients with stage Ⅲ (6.08±2.14%) and stage IV(6.88±2.65%) than that in stage Ⅰ-Ⅱ(5.65±1.86%),P<0.05.With pathological classification，CD4+CD25+CD127lowTreg level in the poorly differentiated is higher than that in the high differentiated(6.72±2.60% vs 5.94±2.11,P<0.05).CD4+CD25+CD127lowTreg level in the patients who got lymph node metastasis is higher than that in the patients who didn’t get lymph node metastasis(6.95±3.12% vs 5.02±2.09%，P<0.05).ConclusionThe proportion of CD4+CD25+CD127lowTreg in peripheral blood of tumor patients increased significantly and was related to tumor progression.CD4+CD25+CD127lowTreg would help evaluate the immune function of cancer patients.

Key words:tumor；CD4+CD25+CD127lowTreg；FACS

(收稿日期：2014-08-20)

作者簡(jiǎn)介：姜艷麗(1978-)，女，醫(yī)學(xué)碩士，主治醫(yī)師，主要從事腫瘤免疫相關(guān)研究。

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

中圖分類(lèi)號(hào)：R730

文章編號(hào)：1007-4287(2015)07-1117-04

*通訊作者

基金項(xiàng)目：吉林省科技廳自然科學(xué)基金(編號(hào)：201115201)；吉林省衛(wèi)生廳項(xiàng)目(編號(hào)：2011Z074)