馬向陽，畢振云，何雪娟，王永新，劉秀麗，王穎利

芪參還五膠囊對腦梗死大鼠學(xué)習(xí)記憶能力及缺血側(cè)海馬區(qū)微血管密度的影響

馬向陽1，畢振云2，何雪娟1，王永新1，劉秀麗1，王穎利1

摘要：目的研究芪參還五膠囊對局灶性腦梗死大鼠學(xué)習(xí)記憶能力及缺血側(cè)海馬區(qū)微血管密度的影響。方法采用開顱電凝法制作SD大鼠右側(cè)大腦中動脈缺血(MCAO)模型，術(shù)后24 h隨機(jī)分為芪參還五膠囊治療組與阿司匹林對照組，于用藥后7 d、14 d進(jìn)行Morris水迷宮測試大鼠學(xué)習(xí)記憶能力；以免疫組織化學(xué)法測定海馬區(qū)微血管密度。結(jié)果大鼠大腦中動脈栓塞后，在學(xué)習(xí)記憶能力上，芪參還五膠囊治療組成績明顯優(yōu)于阿司匹林對照組(P<0.01)，缺血側(cè)海馬區(qū)微血管密度顯示芪參還五膠囊治療組在術(shù)后7 d、14 d明顯高于阿司匹林對照組(P<0.05)。結(jié)論芪參還五膠囊可促進(jìn)腦梗死大鼠微血管新生，利于學(xué)習(xí)記憶功能恢復(fù)。

關(guān)鍵詞：腦梗死；芪參還五膠囊；學(xué)習(xí)記憶能力；微血管密度

腦血管疾病是目前發(fā)病率最高，對人類健康威脅最為嚴(yán)重的疾病之一，有較高的致殘率，使用高效低毒的治療藥物具有重大的社會和經(jīng)濟(jì)效益[1]。有研究證實(shí)缺血后大鼠腦皮質(zhì)神經(jīng)元突觸結(jié)構(gòu)遭破壞，芪參還五膠囊對缺血后大鼠腦有保護(hù)作用[2]。為了進(jìn)一步研究芪參還五膠囊的作用機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)采用開顱電凝法制作局灶性腦缺血模型，經(jīng)芪參還五膠囊干預(yù)，觀察對大鼠學(xué)習(xí)記憶能力與海馬區(qū)微血管密度的影響，從血管新生的角度探討該方抗腦缺血損傷的作用機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物清潔級雄性SD大鼠120只，3月～4月齡，體質(zhì)量230 g～260 g，購自河南醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物學(xué)部；芪參還五膠囊由河北省滄州中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院

作者單位：1.滄州醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校(河北滄州 061001)，E-mail：mxyzymxyzy@126.com；2.河北省滄州中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院制劑室監(jiān)制生產(chǎn)(冀藥制字 Z20050798)，由多種中藥制成干浸膏末或藥粉。阿司匹林腸溶片由濟(jì)南永寧制藥股份有限公司生產(chǎn)，配成2.1 mg/mL混懸液，置4 ℃冰箱備用。

1.2動物模型制備參照賈子善等[3]的方法制作大腦中動脈缺血(MCAO)模型。大鼠用10%水合氯醛(0.35 mL/100 g體質(zhì)量)腹腔注射麻醉大鼠，左側(cè)臥位固定，常規(guī)消毒后，在右眼與右耳之間切開皮膚，分離顳肌，暴露顳骨翼板，術(shù)中避免損傷面神經(jīng)、面部主要動脈、靜脈、眼外肌及淚腺和顴弓。在手術(shù)顯微鏡下，用牙鉆經(jīng)顳骨翼板鉆至硬腦膜，暴露大腦中動脈后，用小咬骨鉗向下咬去部分顱骨，用電凝器閉塞嗅束近端至大腦下靜脈之間的一段大腦中動脈，依次縫合顳肌及皮膚。腹腔內(nèi)注射2 000 U青霉素以預(yù)防感染。共用大鼠120只，有80只符合入選條件(蘇醒后右眼出現(xiàn)Horner征及左側(cè)肢體偏癱)并存活到規(guī)定時(shí)間。術(shù)后24 h將大鼠隨機(jī)分為芪參還五膠囊治療組(治療組)、阿司匹林對照組(對照組)各40只。

1.3藥物干預(yù)治療組大鼠于缺血24 h后以芪參還五膠囊1.0 g/(kg·d)(以生理鹽水稀釋為1.0 g/5 mL)灌胃，每日2次；對照組大鼠于缺血24 h后每日清晨腹腔注射阿司匹林(溶解于1.5 mL的10%L-賴氨酸等滲鹽水溶液中)80 mg/kg，期間所有大鼠均自由飲水與攝食，持續(xù)2周。

1.4Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)[4]分別于術(shù)后7 d、14 d進(jìn)行Morris水迷宮測試，兩組各隨機(jī)取鼠15只。Morris水迷宮為一直徑150 cm、高50 cm的圓形水池，外接動態(tài)軌跡攝像和計(jì)算機(jī)分析系統(tǒng)。水深30 cm，水溫保持在24 ℃±2 ℃，水中加全脂淡奶粉160 g使水渾濁。在水池邊緣確定東、西、南、北4個(gè)點(diǎn)，在水池中間設(shè)立一個(gè)直徑9 cm、高29 cm的透明有機(jī)玻璃平臺，沒于水下1 cm。測試時(shí)室內(nèi)安靜，物品陳設(shè)、照明度一致。

1.4.1定位航行實(shí)驗(yàn)共5 d，每天上、下午各1輪，每輪4次，2次訓(xùn)練間隔30 s，每次分別從4個(gè)象限1/2弧度處頭朝池壁入水，在60 s內(nèi)觸到平臺的時(shí)間為逃避潛伏期。若大鼠在60 s內(nèi)找到平臺，則以60 s計(jì)。以最后一天4次所用時(shí)間的總平均值作為觀察指標(biāo)，逃避潛伏期短說明實(shí)驗(yàn)成績好。

1.4.2空間探索試驗(yàn)第5天下午撤除平臺，大鼠于原平臺對側(cè)象限入水，觀察其60 s內(nèi)穿越原平臺所在位置的次數(shù)(穿臺次數(shù))，測4次取其平均值，穿臺次數(shù)多說明實(shí)驗(yàn)成績好。

1.5微血管密度(microvesseldensity，MVD)測定

1.5.1標(biāo)本的制備兩組分別于術(shù)后1 d、3 d、5 d、7 d、14 d各隨機(jī)取5只大鼠，用10%水合氯醛腹腔內(nèi)注射麻醉后固定于手術(shù)臺，剪開胸腔，暴露心臟，用9號針頭插入左心室，灌注生理鹽水，待右心耳膨起，剪開右心耳讓血液流出，至右心耳流出液為無色透明時(shí)，開始用4%多聚甲醛灌注固定，每只大鼠約需200 mL，總量在20 min～30 min內(nèi)灌完，立即在視交叉處切開后取出大腦，浸于4%多聚甲醛中再固定4 h。經(jīng)常規(guī)梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，做7 μm厚連續(xù)切片，每隔100 μm連續(xù)取3張，用于微血管密度免疫組化測定。

1.5.2MVD測定MVD計(jì)數(shù)參照文獻(xiàn)方法[5]，凡CD34免疫組織化學(xué)染色成棕黃色的單個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞簇作為一個(gè)血管計(jì)數(shù)，每張切片在同一缺血側(cè)海馬區(qū)選擇4個(gè)高倍(×400)視野進(jìn)行微血管計(jì)數(shù)，計(jì)算每平方毫米面積內(nèi)微血管的數(shù)量，即MVD，然后求其均值，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)每組有15張切片結(jié)果。

2結(jié)果

2.1芪參還五膠囊治療對局灶性腦梗死大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響游泳軌跡，芪參還五膠囊治療組以目標(biāo)明確的趨向式為主，阿司匹林對照組以隨機(jī)式為主。各組4 d起潛伏期漸趨平穩(wěn)，6 d時(shí)，芪參還五膠囊治療組與阿司匹林對照組相比，潛伏期縮短，穿臺次數(shù)多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見表1。

表1　兩組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力比較(±s)

2.2微血管密度比較CD34免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，微血管形態(tài)不規(guī)則，管腔由染成棕黃色的內(nèi)皮細(xì)胞圍成。阿司匹林對照組、芪參還五膠囊治療組大鼠缺血側(cè)海馬區(qū)7 d和14 d時(shí)可見較多散在的單個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞，芪參還五膠囊治療組7 d和14 d時(shí)微血管密度明顯多于阿司匹林對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見表2。

表2　兩組大鼠缺血側(cè)海馬區(qū)微血管密度比較(±s) 　 /mm2

3討論

腦血管閉塞以后，神經(jīng)細(xì)胞轉(zhuǎn)歸受多種因素的影響，其中血供的恢復(fù)是重要因素。芪參還五膠囊能否通過促進(jìn)局灶性腦缺血后大鼠缺血側(cè)海馬區(qū)微血管新生，改善腦損傷后微循環(huán)，繼而促進(jìn)腦缺血后學(xué)習(xí)記憶功能的恢復(fù)，是本實(shí)驗(yàn)研究的主要目的。

芪參還五膠囊[6]是在補(bǔ)陽還五湯的基礎(chǔ)上加用冰片、白僵蠶、當(dāng)歸等化裁而成。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，冰片灌服5 min即可通過血腦屏障，并蓄積在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，亦能促使其他藥物通過血腦屏障[7]；僵蠶祛風(fēng)解痙，散結(jié)消腫；當(dāng)歸補(bǔ)血調(diào)血脂，能顯著促進(jìn)機(jī)體造血功能，升高紅細(xì)胞、白細(xì)胞和血紅蛋白含量，抑制血小板凝聚，抗血栓，調(diào)節(jié)血脂；黃芪能改善微循環(huán)和血液流變性，對紅細(xì)胞的變形能力有激活和恢復(fù)作用，并能抑制血栓形成及降低血小板黏附性；川芎活血行氣，祛風(fēng)止痛；諸藥合用，使氣旺血行，瘀祛絡(luò)通，諸癥自可漸愈。通過臨床觀察，芪參還五膠囊治療急性缺血性中風(fēng)療效顯著，明顯改善神經(jīng)功能缺損程度，提高臨床療效，還能使病人的脂代謝紊亂得到改善，從而有效預(yù)防腦梗死的復(fù)發(fā)[8]。

本實(shí)驗(yàn)從學(xué)習(xí)記憶能力的改善方面來評價(jià)芪參還五膠囊干預(yù)對MCAO后大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)的影響。Morris水迷宮是檢測大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的常用裝置，是研究與海馬功能直接相關(guān)的空間學(xué)習(xí)、記憶模型[9-11]。本研究結(jié)果顯示，治療組大鼠的逃避潛伏期較對照組明顯縮短，穿臺次數(shù)增多，提示學(xué)習(xí)記憶能力有明顯改善，表明芪參還五膠囊干預(yù)能改善和提高M(jìn)CAO后大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力。對大鼠MCAO后缺血側(cè)海馬區(qū)微血管密度的分析結(jié)果顯示，術(shù)后7 d和14 d時(shí)兩組大鼠缺血側(cè)海馬區(qū)均有微血管表達(dá)，而治療組明顯多于相應(yīng)時(shí)間的對照組，說明在大腦中動脈閉塞后缺血側(cè)海馬區(qū)微血管有代償性增生，而芪參還五膠囊對這種增生有促進(jìn)作用。

血管新生是決定缺血性神經(jīng)元存活的關(guān)鍵因素[12]，微血管新生的范圍與程度直接關(guān)系到海馬區(qū)血流的改善，影響該區(qū)神經(jīng)元生理功能的恢復(fù)，從而決定了病人的預(yù)后。大鼠局灶性腦梗死后缺血側(cè)海馬區(qū)微血管的增生對改善海馬區(qū)的微循環(huán)、促進(jìn)學(xué)習(xí)記憶能力的恢復(fù)、改善預(yù)后具有重要意義，而芪參還五膠囊對這一過程有明顯的促進(jìn)作用，這可能是芪參還五膠囊促進(jìn)腦缺血后功能恢復(fù)的一個(gè)重要機(jī)制。

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(本文編輯郭懷印)

Effects of Qishen Huanwu Capsule on the Learning-memory Ability and Microvascular Density in Hippocampus of Rats after Cerebral Infarction

Ma Xiangyang，Bi Zhenyun，He Xuejuan，Wang Yongxin，Liu Xiuli，Wang Yingli

Cangzhou Medical College，Cangzhou 061001，Hebei， China

Abstract：ObjectiveTo investigate the influence of Qishen Huanwu capsule(QHC) on the learning-memory ability and microvascular density in hippocampus of rats after cerebral infarction.MethodsAfter the models of right middle cerebral artery occlusion(MCAO) with electric coagulation，the models of Sprague-Dawley(SD) rats were randomly divided into QHC group and aspirin control group.After 7 d and 14 d，morris wate maze was used to evaluate the learning-memory ability and the expressions of microvascular density were measured in immunohistochemical method.ResultsThe learning-memory ability in QHC group was significantly better than that in aspirin control group (P<0.01).The expression of microvessel density in rats hippocampus after MCAO were mostly in the ischemic side in QHC group，which were more than in aspirin control group(P<0.05).ConclusionQHC can promote angiogenesis and learning-memory function recovery.

Key words：cerebral infarction；Qishen Huanwu capsule；learning-memory ability；microvascular density

(收稿日期：2015-05-09)

中圖分類號：R573R285.5

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

doi：10．3969/j．issn．1672-1349．2015．18．013

文章編號：1672-1349(2015)18-2070-03