張　琬，郭　慶，高璟英，丁亞琴，王　惠，鐘向琴，劉云峰，章　毅

環(huán)磷酸腺苷對(duì)大鼠胰島素分泌作用及機(jī)制的研究

張琬1，郭慶1，高璟英1，丁亞琴1，王惠1，鐘向琴1，劉云峰2，章毅1

摘要：目的 研究環(huán)磷酸腺苷(cAMP)在大鼠胰島素分泌中發(fā)揮的作用及機(jī)制，為研究促胰島素分泌藥物提供理論依據(jù)。方法 雄性SD大鼠的胰腺經(jīng)過(guò)膠原酶P消化，使用Histopaque 1077梯度離心后，分離純化取得胰島。用胰島素分泌實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證胰島活性與功能，并且通過(guò)cAMP檢測(cè)實(shí)驗(yàn)、膜片鉗技術(shù)記錄電壓依賴(lài)性鉀通道(KV)電流，研究cAMP促進(jìn)大鼠胰島素分泌的作用機(jī)制。結(jié)果經(jīng)過(guò)分離純化得到的胰島在2.8 mmol/L、8.3 mmol/L、16.7 mmol/L葡萄糖情況下胰島素分泌的標(biāo)化值分別為(1.00±0.38)μIU/mL、(2.33 ± 0.52)μIU/mL、(5.55 ± 0.12)μIU/mL。在8.3 mmol/L葡萄糖作用的基礎(chǔ)上，F(xiàn)orskolin進(jìn)一步促進(jìn)了cAMP的生成，胰島素的分泌，抑制了KV電流，在同樣條件下，SQ22536對(duì)cAMP的生成、胰島素分泌、KV電流均沒(méi)有影響，但是相同條件下，應(yīng)用Forskolin+ SQ22536，則可以減少Forskolin促進(jìn)cAMP生成的作用、削弱了Forskolin對(duì)KV電流的抑制作用。結(jié)論采用膠原酶P消化法及Histopaque 1077分離液離心分得的胰島活性、功能良好。在胰島β細(xì)胞內(nèi)，cAMP合成增加可促進(jìn)胰島素分泌，其機(jī)制與抑制KV電流相關(guān)。

關(guān)鍵詞：環(huán)磷酸腺苷；胰島素分泌；電壓依賴(lài)性鉀通道

糖尿病是嚴(yán)重危害公眾健康并能致傷、致殘、致死的慢性非感染性疾病[1]，人們對(duì)其進(jìn)行了廣泛而深入的研究。胰島素抵抗、β細(xì)胞分泌胰島素的功能障礙都已被證明是重要發(fā)病機(jī)制[2]。在調(diào)節(jié)胰島β細(xì)胞的生長(zhǎng)、存活以及葡萄糖誘導(dǎo)的胰島素分泌中有很多影響因子，環(huán)磷酸腺苷(cAMP)作為一個(gè)廣泛存在于細(xì)胞內(nèi)的第二信使便是其中之一[3]。cAMP由三磷酸腺苷(ATP)在腺苷酸環(huán)化酶(AC)催化下生成，參與調(diào)節(jié)各種細(xì)胞功能如生長(zhǎng)分化、轉(zhuǎn)錄調(diào)控和細(xì)胞凋亡[4]。本實(shí)驗(yàn)使用AC激動(dòng)劑Forskolin和抑制劑SQ22536就cAMP在胰島素分泌中所起的作用進(jìn)行研究。

1材料與方法

1.1動(dòng)物SD大鼠，雄性，由山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，體重200 g～270 g。

1.2試劑膠原酶P、BSA (瑞士Roche)；IBMX；R0-201724；HEPES、葡萄糖、D-多聚賴(lài)氨酸(美國(guó)Sigma)；SQ22536、Forskolin(美國(guó)Cayman Chemical公司)；1640培養(yǎng)基(武漢博士德公司)；澳洲胎牛血清；青鏈霉素(北京索萊寶公司)；DispaseⅡ(美國(guó)Amresco)；胰島素檢測(cè)試劑盒(北京北方生物技術(shù)研究所)[5]；cAMP放免試劑盒(北京北方生物技術(shù)研究所)。

作者單位：1.山西醫(yī)科大學(xué)(太原 030001)；2.山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院

1.3主要儀器體式顯微鏡(上海中恒儀器有限公司)；電子天平(上海精密儀器有限公司)；水浴鍋(江蘇金壇市恒豐儀器制造有限公司)；超凈工作臺(tái)(北京世安科技林凈化技術(shù)有限公司)；倒置顯微鏡(日本OLYMPUS)；細(xì)胞培養(yǎng)箱(北京博奧恒信生物科技有限公司)[5]；臺(tái)式離心機(jī)(長(zhǎng)沙湘儀儀器有限公司)；Narishige MODEL PP-830電極拉制儀、MIRO FORGE MF-830拋光儀(日本Narishige)；EPC 10全自動(dòng)膜片鉗(德國(guó)HEKA)。

1.4方法

1.4.1大鼠胰島、細(xì)胞的分離與培養(yǎng)將雄性SD大鼠斷頭處死后，用75%酒精對(duì)其腹部消毒，打開(kāi)胸腹腔，將膠原酶P溶液(1 mg/mL，1640培養(yǎng)基溶解)緩慢注入胰腺中，加入Histopaque 1077離心液分離胰島于含10%胎牛血清，100 U/mL青霉素，100 μg/mL鏈霉素的1640培養(yǎng)基中，在37 ℃，5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)[5]。在分細(xì)胞時(shí)，將胰島脫鈣，加入DispaseⅡ酶液100 μL(5 mg/mL)消化，將細(xì)胞懸浮液接種在含多聚賴(lài)氨酸的蓋玻片上，加培養(yǎng)液于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)[6-7]。

1.4.2胰島素分泌實(shí)驗(yàn)配制葡萄糖濃度分別是2.8 mmol/L、8.3 mmol/L、16.7 mmol/L的KRBH孵育液。每組6個(gè)管，每管放入5個(gè)胰島，先用含2.8 mmol/L葡萄糖的KRBH孵育液于孵箱中孵育30 min，棄上清，然后加入2.8 mmol/L、8.3 mmol/L、16.7 mmol/L葡萄糖的孵育液孵育30 min，將上清收集，用放免法測(cè)胰島素含量，加入酸乙醇(酒精∶乙醇∶鹽酸=150∶47∶3)超聲粉碎胰島，檢測(cè)胰島素的總含量[5，7]。

1.4.3cAMP檢測(cè)實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備好葡萄糖濃度分別是2.8 mmol/L、8.3 mmol/L的KRBH孵育液。每組6個(gè)管，每管放入10個(gè)胰島，先用含2.8 mmol/L葡萄糖的KRBH孵育液37 ℃孵育30 min，棄上清，后加入2.8 mmol/L、8.3 mmol/L葡萄糖的孵育液孵育30 min，收集上清，加入KRBH孵育液將胰島超聲粉碎，放免法檢測(cè)cAMP的總含量。

1.4.4膜片鉗技術(shù)記錄KV電流實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：分離的細(xì)胞培養(yǎng)2 d后便于進(jìn)行膜片鉗實(shí)驗(yàn)。使用的細(xì)胞外液：氯化鈉141.90 mmol/L，氯化鉀5.60 mmol/L，氯化鎂1.20 mmol/L，HEPES 5.00 mmol/L，葡萄糖11.00 mmol/L，pH=7.4。細(xì)胞內(nèi)液：氯化鉀140.00 mmol/L，氯化鎂1.00 mmol/L，EGTA 0.05 mmol/L，氯化鈉10.00 mmol/L和HEPES10.00 mmol/L，pH=7.3[7]。使用的電極電阻大于5 MΩ，當(dāng)封接電阻應(yīng)大于1 GΩ，破膜時(shí)串聯(lián)電阻小于20 MΩ時(shí)說(shuō)明細(xì)胞破膜完全。細(xì)胞電容大于4pF的細(xì)胞認(rèn)為是β細(xì)胞，將細(xì)胞鉗制在-70 mV，并給予-70 mV～80 mV的電壓刺激，記錄400 ms內(nèi)每遞增10 mV的KV電流[8]。

2結(jié)果

2.1大鼠胰島活性、功能良好胰島分別在葡萄糖濃度為2.80 mmol/L(2.8 G)、8.30 mmol/L(8.3 G)、16.70 mmol/L(16.7 G)的KRBH溶液中孵育30 min后，所測(cè)胰島素分泌量隨葡萄糖濃度增加而增加(P<0.05)。詳見(jiàn)表1。

表1　葡萄糖依賴(lài)的胰島素分泌值(±s) 　μIU/mL

2.2胰島素分泌實(shí)驗(yàn)在8.3 mmol/L葡萄糖基礎(chǔ)上加入SQ22536(10 μmol)、Forskolin(10 μmol)、SQ22536(10 μmol) +Forskolin(10 μmol)，孵育胰島30 min后，檢測(cè)上清液及胰島粉碎液內(nèi)的胰島素含量。結(jié)果顯示，8.3 G與2.8 G比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；8.3G +SQ22536與8.3G比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；8.3G +Forskolin、8.3G +SQ22536+Forskolin 與8.3 G比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；8.3G +Forskolin與 8.3G + SQ22536+Forskolin比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見(jiàn)表2。

表2　加藥后的胰島素分泌值(±s)　μIU/mL

2.3cAMP檢測(cè)實(shí)驗(yàn)8.3 mmol/L葡萄糖的KRBH孵育液中加入SQ22536(10 μmol)、Forskolin(10 μmol)，孵育胰島30 min后，測(cè)上清液及胰島粉碎液內(nèi)的cAMP含量，結(jié)果上顯示，cAMP值8.3 G與8.3G+SQ22536比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)； 8.3 G與8.3G+Forskolin 比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見(jiàn)表3。

表3　cAMP的檢測(cè)值(±s)　μIU/mL

2.4全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)檢測(cè)KV電流使用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)，檢測(cè)了在胰島β細(xì)胞上，SQ22536(10 μmol)、Forskolin(10 μmol)、SQ22536(10 μmol)+Forskolin(10 μmol)對(duì)KV電流的影響。當(dāng)細(xì)胞外液為11.10 mmol/L的葡萄糖時(shí)，可以阻斷了KATP通道的電流，排除了對(duì)KV電流的影響。結(jié)果顯示，在80 mV電流刺激時(shí)，F(xiàn)orskolin加藥組、SQ22536+ Forskolin加藥組與對(duì)照組相比明顯地抑制了KV電流；Forskolin加藥組與SQ22536+ Forskolin加藥組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。詳見(jiàn)表4。

表4　80 mV時(shí)的KV電流(±s)

3討論

胰島素分泌實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在2.8 mmol/L、8.3 mmol/L、16.7 mmol/L的葡萄糖作用下，胰島素分泌量是隨著葡萄糖的濃度遞增而增加的，具有葡萄糖濃度依賴(lài)性，說(shuō)明大鼠胰島的功能良好。

腺苷酸環(huán)化酶是一個(gè)廣泛存在于細(xì)胞的膜整合蛋白，在多種類(lèi)型的細(xì)胞中通過(guò)調(diào)節(jié)cAMP的合成來(lái)調(diào)控細(xì)胞諸多功能。AC/cAMP信號(hào)通路在胰島β細(xì)胞中非常重要，它可以調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)和分泌。在A(yíng)C/cAMP的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的研究中，用來(lái)調(diào)節(jié)AC活性的工具藥有很多，AC激動(dòng)劑Forskolin有不經(jīng)過(guò)鳥(niǎo)苷酸蛋白的調(diào)節(jié)就直接增強(qiáng)AC活性的作用，激活A(yù)C增加細(xì)胞內(nèi)在的cAMP的生物合成，進(jìn)而加強(qiáng)糖誘導(dǎo)的胰島素分泌[9]，而SQ22536作為一個(gè)被廣泛應(yīng)用的AC特定抑制劑，可抑制AC的活性[10]。本研究表明，在8.3 mmol/L葡萄糖的基礎(chǔ)上，F(xiàn)orskolin增加胰島素分泌，在相同條件下SQ22536對(duì)胰島素分泌沒(méi)有影響，而Forskolin+SQ22536可以部分阻斷Forskolin對(duì)胰島素分泌的促進(jìn)作用。在cAMP檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中，F(xiàn)orskolin增加了胰島β細(xì)胞內(nèi)生物合成的cAMP，在相同條件下SQ22536對(duì)β細(xì)胞內(nèi)cAMP的量沒(méi)有影響。全細(xì)胞膜片鉗檢測(cè)KV電流結(jié)果表明，F(xiàn)orskolin極大地抑制了KV通道開(kāi)放，減小KV電流，同樣的情況下SQ22536對(duì)KV電流沒(méi)有影響，而給予Forskolin+SQ22536，則可以部分阻斷Forskolin抑制KV通道開(kāi)放的作用。以上實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，在胰島β細(xì)胞上通過(guò)使用AC激動(dòng)劑Forskolin增加細(xì)胞內(nèi)在cAMP的生物合成，極大地抑制KV通道的開(kāi)放，增加大鼠胰島素的分泌；使用AC抑制劑SQ22536，其本身對(duì)胰島素分泌及KV電流沒(méi)有影響，但削弱了Forskolin對(duì)胰島素分泌及KV電流的作用，提示Forskolin促進(jìn)胰島素分泌作用與Kv通道有關(guān)。 當(dāng)處于高糖環(huán)境時(shí)，胰島β細(xì)胞內(nèi)的ATP/ADP比值升高，從而關(guān)閉β細(xì)胞KATP通道，引起細(xì)胞膜的去極化和Ca2+通道的開(kāi)放，細(xì)胞內(nèi)的鈣離子濃度升高。Ca2+在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮重要的作用，胰島β細(xì)胞內(nèi)的鈣離子濃度的升高最終會(huì)促進(jìn)胰島素的分泌[11]。MacDonald等的研究表明，KV通道在胰島素分泌中亦發(fā)揮重要作用：抑制KV通道可延長(zhǎng)胰島β細(xì)胞動(dòng)作電位時(shí)程，導(dǎo)致細(xì)胞膜上的鈣離子通道開(kāi)放時(shí)間延長(zhǎng)，增加細(xì)胞內(nèi)的鈣離子濃度，促進(jìn)胰島素的分泌[12]。

因此，結(jié)合本研究的結(jié)果提示胰島β細(xì)胞內(nèi)cAMP升高促進(jìn)胰島素分泌的機(jī)制與其抑制KV電流，進(jìn)而延長(zhǎng)動(dòng)作電位時(shí)程，最終升高細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度有關(guān)。cAMP作為廣泛存在于細(xì)胞內(nèi)的第二信使也是調(diào)節(jié)一些促胰島素分泌激素功能的關(guān)鍵因素，如胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)和葡萄糖依賴(lài)性促胰島素多肽(GIP)[13]。許多促進(jìn)胰島素分泌的藥物可以增加cAMP的合成，但是具體的機(jī)制還不清楚，本實(shí)驗(yàn)可以為研究促進(jìn)胰島素分泌的藥物提供理論依據(jù)。

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(本文編輯郭懷印)

(收稿日期：2015-05-08)

通訊作者：章毅，E-mail：13620619467@163.com

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金(No.NSFC 81070662，81273564，81373464)；山西省自然科學(xué)基金(No.2012011039-8，2013011047-3)；山西省高等學(xué)校優(yōu)秀青年學(xué)術(shù)帶頭人支持計(jì)劃(No.2011-24)；山西省留學(xué)人員科技活動(dòng)項(xiàng)目擇優(yōu)資助；山西省回國(guó)留學(xué)人員科研資助項(xiàng)目(No.2012-046，2013-111)；山西省衛(wèi)生廳科研課題(No.201201062)；中華醫(yī)學(xué)會(huì)臨床醫(yī)學(xué)科研專(zhuān)項(xiàng)資金項(xiàng)目(No.13040440429)；人力資源和社會(huì)保障部擇優(yōu)啟動(dòng)項(xiàng)目(No.2013-277)

中圖分類(lèi)號(hào)：R587.1R255.4

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

doi：10．3969/j．issn．1672-1349．2015．18．012

文章編號(hào)：1672-1349(2015)18-2067-03