毛建萍唐曉麗浦冠勤顧海洋賁瑞生石根祥

（1.蘇州大學蠶桑研究所；2.蘇州大學金螳螂建筑學院 215123；3.大豐市蠶桑技術(shù)指導站；4.大豐市蠶種場）

桑枝枯病病原菌培養(yǎng)性狀測定

毛建萍1，2唐曉麗2浦冠勤1，2顧海洋3，4賁瑞生4石根祥4

（1.蘇州大學蠶桑研究所；2.蘇州大學金螳螂建筑學院 215123；3.大豐市蠶桑技術(shù)指導站；4.大豐市蠶種場）

江蘇大豐蠶種場桑園發(fā)現(xiàn)一種新的桑樹病害，主要為害桑樹葉片和枝條，造成葉片脫落，嫩梢褐變腐爛，停止向上生長，嚴重影響桑樹生長和桑葉產(chǎn)量。通過組織分離培養(yǎng)獲得一株病原真菌，報告其病原菌的生物學特性和培養(yǎng)性狀測定情況。

桑樹 病蟲害 桑枝枯病

2014年7月，江蘇大豐蠶種場桑園發(fā)現(xiàn)一種新的桑樹病害，主要為害桑樹葉片和枝條，造成葉片脫落，嫩梢褐變腐爛，停止向上生長，嚴重影響桑樹生長和桑葉產(chǎn)量。通過組織分離培養(yǎng)獲得一株病原真菌，采用Koch's法則確認其為致病病原［1］，根據(jù)發(fā)病部位和發(fā)病癥狀，暫稱為桑枝枯病?，F(xiàn)將其病原菌的生物學特性和培養(yǎng)性狀測定情況報告如下。

1 材料與方法

1.1 供試材料

桑枝枯病病原分離材料采集于大豐蠶種場發(fā)病桑園。

1.2 供試培養(yǎng)基［2］

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200g，葡萄糖15g，瓊脂17g，蒸餾水1000mL；

黃豆芽培養(yǎng)基：黃豆芽200g，葡萄糖15g，瓊脂17g，蒸餾水1000mL；

桑汁培養(yǎng)基：桑葉200g，葡萄糖15g，瓊脂17g，蒸餾水1000mL；

上述3種培養(yǎng)基配制后，121℃高壓滅菌30min，冷卻后備用。

1.3 病原菌分離培養(yǎng)［2］

在無菌操作條件下用刀片切取病健交界處的病組織少許，將病組織塊先在70%酒精中浸泡消毒1min，然后迅速移入0.1%升汞溶液中表面消毒1.5min，最后用無菌水漂洗3次；用剪刀將消毒后的病組織剪成小塊，分別置于平板培養(yǎng)基表面，放入25℃恒溫箱中培養(yǎng)。待病組織上長出菌絲后，再挑取菌絲在平板培養(yǎng)基上純化獲得單菌落。

1.4 回接確定病原

根據(jù)Koch's法則，用無菌水將分離得到的病原菌制作成菌懸液，選取健康桑樹為接種對象。用經(jīng)過消毒的接種針在桑樹的嫩莖部針刺傷口，然后用無菌脫脂棉蘸取菌懸液包在莖部傷口處，葉片采用摩擦接種，接種的枝條用塑料袋包裹保濕，設(shè)三組重復，另用清水接種作對照。接種于傍晚進行，次日清晨取下保濕的塑料袋，然后逐日觀察接種后的發(fā)病情況。

1.5 病原菌形態(tài)特性觀察

將病原菌接種于PDA平板培養(yǎng)基上，置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，逐日觀察記錄其菌絲、菌落以及分生孢子的生長情況和形態(tài)特征。

1.6 不同培養(yǎng)基對菌絲生長的影響

選用PDA培養(yǎng)基、黃豆芽培養(yǎng)基和桑葉汁培養(yǎng)基制成平板培養(yǎng)基，將分離純化得到的病原菌用無菌水制成菌懸液，用直徑5mm的無菌濾紙碟浸入菌懸液中蘸取分生孢子，將濾紙碟稍微晾干后放入各平板培養(yǎng)基表面中央處，每處理重復3次，置于25℃恒溫箱中培養(yǎng)7d，每24h用十字交叉法測量記錄菌落直徑并計算出三組重復的平均值，比較不同培養(yǎng)基對菌絲生長的影響。

1.7 不同溫度對菌絲生長的影響

將預先配制的PDA培養(yǎng)基制成平板，待其冷卻凝固后備用。用滅菌的直徑5mm濾紙碟蘸取預先配制的菌懸液，放于平板培養(yǎng)基中央，每皿一片，培養(yǎng)皿用泊拉膜密封后分別放入5℃、8℃、11℃、14℃、17℃、20℃、23℃、26℃、29℃、32℃、35℃、38℃的恒溫箱中培養(yǎng)，每區(qū)設(shè)3個重復，培養(yǎng)8d，每24h用十字交叉法測量記錄菌落直徑，取三組重復的平均值比較不同溫度對菌絲生長的影響。

1.8 不同pH值對菌絲生長的影響

首先配制PDA培養(yǎng)基，用土豆熬煮并過濾出1000mL濾液，加入15g葡萄糖后攪拌均勻后分別量取100mL依次倒入8個燒杯中，利用pH計和磁力攪拌器，用0.1%NaOH和0.1%HCl調(diào)節(jié)其pH值，分別調(diào)整pH值至4、5、6、7、8、9、10、11，然后分別裝入加有1.5g瓊脂粉的三角瓶中高壓滅菌。滅菌后的培養(yǎng)基在無菌操作下制成平板，按照前述方法接種致病真菌，每種pH處理3次重復，放入25℃恒溫箱中培養(yǎng)7d，每24h用十字交叉法測量記錄菌落直徑，取三組重復平均值比較不同pH值對菌絲生長的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 桑枝枯病病害癥狀特點

初時在桑樹葉片上出現(xiàn)黃褐色和黑褐色病斑，多在葉脈間，后病斑相互連接形成大病斑，并逐漸發(fā)黑焦枯，葉柄萎蔫，最終脫落；發(fā)病初期枝條基本正常，中后期呈水浸狀，芽基部逐漸變色，呈黃褐色至黑褐色，枝條皮層褐變腐爛，頂端生長點發(fā)黑腐爛，停止向上生長［3］，見圖1。

圖1 桑枝枯病發(fā)病癥狀

2.2 病原菌分離培養(yǎng)及形態(tài)特征

桑枝枯病病原菌在PDA培養(yǎng)基上生長速度較快，菌絲體初為白色，后逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)榛疑?、灰黑色至黑色；菌落圓形，平坦不透明，大而疏松，呈絨氈狀，邊緣可見絲狀菌絲；當菌絲體培養(yǎng)一段時間后，在菌落上能形成略突出表面的黑色小點狀子實體［4］（圖2），在顯微鏡下可見橢圓形灰色分生孢子，分生孢子單胞（圖3）。

2.3 病原菌的回接結(jié)果

將從新鮮病組織中分離得到的桑枝枯病菌回接到健康桑枝上，3d后接種部位開始發(fā)病，并有蔓延之勢，其發(fā)病癥狀特點與田間自然發(fā)病的病枝相同，清水對照處理區(qū)則不發(fā)病。將回接得到的病組織以相同方法進行病原菌的分離培養(yǎng)，獲得的病原菌與從田間自然發(fā)病組織分離得到的病原菌形態(tài)一致，從而可以確定該真菌即為桑枝枯病的致病病原菌。

圖2 桑枝枯病菌菌絲體和子實體

圖3 桑枝枯病病原分生孢子

2.4 不同培養(yǎng)基對菌絲生長的影響

測定結(jié)果表明，病原菌在PDA、黃豆芽培養(yǎng)基及桑葉汁培養(yǎng)基上均能良好生長，但菌絲在PDA培養(yǎng)基上生長速度最快，培養(yǎng)7d后菌落直徑為74.33mm，平均生長量為11.39mm／d，桑葉汁培養(yǎng)基次之，7d后菌落直徑和平均生長量分別為70.50mm和10.92mm／d，黃豆芽培養(yǎng)基培養(yǎng)效果與桑葉汁培養(yǎng)基大致相同，分別為70.00mm和10.72mm／d。可見，PDA培養(yǎng)基作為真菌常用培養(yǎng)基，其物質(zhì)成分確實能夠滿足絕大多數(shù)真菌的生長需要。

2.5 不同溫度條件對菌絲生長的影響

研究結(jié)果表明：該菌在5～35℃的11個梯度溫度中均能生長，但各溫度梯度之間的生長情況有明顯差異（見圖4）。在生長溫度范圍內(nèi)，隨著溫度的升高菌絲生長速度逐漸加快，在26～29℃之間達到頂峰后長速回落。長速最快的溫度條件為26、29℃，培養(yǎng)第6天就長滿了整個平板培養(yǎng)基（直徑90mm），日平均生長量分別為16mm／d和17mm／d；在26℃之前隨著溫度的升高，菌絲生長速度逐漸加快，而在29℃之后，則隨溫度升高而菌絲生長速度趨慢，38℃條件下則菌絲不能生長（持續(xù)觀察15d）?？梢?，該菌的可生長溫度范圍有明顯的適宜生長曲線，最適生長溫度范圍為26～29℃。

圖4 不同溫度下桑枝枯病菌日平均生長速度

2.6 不同pH值條件對菌絲生長的影響

測定結(jié)果表明：該菌對pH值的適應范圍較廣，在pH值為4～11的范圍內(nèi)均能很好生長，最適生長pH值為6～7之間，培養(yǎng)一周后菌落直徑為79.67mm左右，日平均生長量為11.53～11.61mm／d；pH為11時生長相對較慢，菌落直徑為60.33mm，日平均生長量為8.44mm／d。如圖5所示，在pH4～11的范圍內(nèi)，隨著pH值的升高，菌絲生長速度緩慢增加，在pH接近7時長速達到最大值后又緩慢減弱，pH值大于10后日平均生長速度明顯變慢，低于10.17mm／d。通過對菌落形態(tài)的觀察發(fā)現(xiàn)，pH值為4的條件下菌落相對較薄，其他pH值間無明顯差別。

圖5 不同pH值下桑枝枯病菌菌絲日平均生長速度

3 小結(jié)與討論

通過對桑枝枯病新鮮病組織的分離培養(yǎng)，結(jié)合Koch's法則的應用，確認分離獲得的真菌為該病害的致病性病原。根據(jù)該病害的發(fā)病癥狀與為害特點，初步認為這是一種新的桑樹病害，暫稱為桑枝枯病。由于該病害在田間的發(fā)病速度快，對桑樹生長和桑葉產(chǎn)量的影響很大，應該引起有關(guān)部門的足夠重視。

病原菌培養(yǎng)性狀的測定結(jié)果表明，該菌適于在PDA培養(yǎng)基上生長，并能在培養(yǎng)基上形成子實體和產(chǎn)生分生孢子。該菌的生長溫度范圍為5～35℃，最適生長溫度范圍在26～29℃之間，菌絲的這一生長特點符合其在夏季高溫下發(fā)病危害的實際情況。該菌在pH值4～11范圍內(nèi)均能良好生長，且培養(yǎng)前期（2d內(nèi)）菌絲生長量沒有明顯差異，說明該菌對生長pH值條件的適應性較強，其最適生長pH值在6～7之間。

本次試驗僅對病原菌的形態(tài)特征以及生物學特性進行了初步研究，但對于該病原菌分類地位的歸屬和病害的發(fā)生規(guī)律以及綜合防治方法等還有待進一步研究。

［1］ 方中達.植病研究法（第三版）［M］.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2007.

［2］ 浦冠勤毛建萍，桑枝枯菌核病病原菌生物學特性研究［J］.蠶業(yè)科學，202，28（2）：87－90.

［3］ 陸家云.植物病原真菌學［M］.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2001.

［4］ 魏景超.真菌鑒定手冊［M］.上海：上?？茖W技術(shù)出版社，1979

S888.71＋3

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2015－08－11－001