王文蘭，付彩文，付文浩，柳樹芳，王姝蓮，程三芳

冬凌草甲素對胰腺癌SW1990細胞的抑制作用及機制

王文蘭1a，付彩文2，付文浩1a，柳樹芳1a，王姝蓮1a，程三芳1b

目的 探討冬凌草甲素對人胰腺癌SW1990細胞增殖的抑制作用及其作用機制。方法 以10、20、40 μmol/L不同濃度冬凌草甲素(Ori)作用于胰腺癌SW1990細胞，采用CCK-8檢測胰腺癌SW1990細胞增殖情況；流式細胞儀檢測細胞周期及凋亡情況；RT-PCR法檢測Survivin、p21基因mRNA表達水平。結(jié)果 不同濃度的Ori作用于胰腺癌SW1990細胞1、2、3 d后，胰腺癌SW1990細胞增殖抑制程度不等，藥物濃度越高，抑制程度越高，兩者間具有明顯劑量與時間依賴性。0、10、20、40 μmol/L的冬凌草甲素作用于胰腺癌SW1990細胞24 h后，凋亡率分別為0.87%±0.65%、1.85%±1.02%、5.38%±0.15%和16.60%±0.50%，出現(xiàn)明顯的G2/M期周期阻滯。與對照組相比，10、20、40 μmol/L的Ori作用于SW1990細胞24 h后，p21 mRNA表達增加，而Survivin mRNA表達下降。結(jié)論 冬凌草甲素通過誘導(dǎo)凋亡和G2/M期周期阻滯來實現(xiàn)對胰腺癌SW1990細胞增殖的抑制作用，其機制可能與Survivin和p21調(diào)節(jié)信號有關(guān)。

冬凌草甲素；胰腺癌；SW1990細胞；增殖抑制

0 引言

胰腺癌作為一種預(yù)后較差的惡性腫瘤，近年來的發(fā)病率呈逐年上升趨勢，具有極低的5年生存率和治愈率[1]。細胞凋亡的急劇減少在胰腺癌發(fā)生、發(fā)展以及對放化療的耐受情況起重要作用。冬凌草甲素(Oridoni，Ori)作為一種從唇形科植物香菜屬植物提取的重要活性二萜成分，具有抗炎、抑菌以及抗腫瘤等的藥理作用，可以誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡并抑制腫瘤細胞的增殖[2]。人胰腺癌SW1990細胞是分子生物學(xué)意義上的胰腺癌標志性細胞，在胰腺癌臨床診斷中具有重要意義[3]。本研究針對Ori對人胰腺癌SW1990細胞增殖的抑制作用及其作用機制進行探討，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 藥物和細胞株 Ori購自湖北巨勝科技有限公司(純度在98%以上)；胰腺癌SW1990細胞株來源于中國科學(xué)院上海細胞庫。根據(jù)Ori的濃度不同分為0(對照組)、10、20、40 μmol/L濃度組。

1.2 方法

1.2.1 CCK-8檢測胰腺癌SW1990細胞增殖情況 將處于對數(shù)生長期的人胰腺癌SW1990細胞種植到96孔板中，每孔細胞數(shù)量為5×103，細胞貼壁后將不同濃度的Ori(0、10、20、40 μmol/L)分別加入到孔板中，每個濃度設(shè)置6個復(fù)孔，并將加入0.1%的DMEM培養(yǎng)基液的細胞作為對照組，分別培養(yǎng)1、2、3 d。在藥物作用結(jié)束前1 h，在每個孔中加入0.01 mL的CCK-8后繼續(xù)培養(yǎng)1 h，使用酶標儀進行檢測。細胞抑制率=(1-實驗組/對照組)×100%。

1.2.2 流式細胞儀檢測細胞周期及凋亡情況 采用Annexin Ⅴ-FITC/PI雙染流式細胞儀檢測細胞周期及凋亡情況。將處于對數(shù)生長期的人胰腺癌SW1990細胞種植到6孔板中，每孔的細胞數(shù)量為4×105，細胞生長至90%融合時，每孔中加入40 μmol/L的Ori，1 d后收集細胞，使用胰蛋白酶進行消化后，以1 000 r/min的速度離心5 min。冷PBS洗2次，并用0.5 mL的PBS重懸細胞加入到RNA酶中，使?jié)舛茸優(yōu)?00 μg/L，置37 ℃水浴中0.5 h，加入5 μL PI進行混勻后15 min上機檢測，激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長530 nm，結(jié)果采用Cellquest軟件進行分析。

1.2.3 RT-PCR法檢測Survivin、p21基因mRNA表達水平 將處于對數(shù)生長期的人胰腺癌SW1990細胞采用不同濃度的Ori(0、10、20、40 μmol/L)進行處理后加入TRIzol 1 mL抽提細胞RNA，并按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒上的操作說明合成cDNA，采用GeneAmp9600型PCR擴增儀進行擴增。Survivin以及p21基因mRNA的反應(yīng)條件：預(yù)變性94 ℃ 4 min，變性94 ℃ 30 s，退火54 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 1 min，最后延伸10 min，一共進行30個循環(huán)。將PCR產(chǎn)物置于1.5%的瓊脂凝膠電泳中進行檢測。

1.3 評價指標 CCK-8檢測胰腺癌SW1990細胞增殖情況；流式細胞儀檢測細胞周期及凋亡情況；RT-PCR法檢測Survivin、p21基因mRNA表達水平。

2 結(jié)果

2.1 CCK-8檢測Ori對胰腺癌SW1990細胞增殖抑制作用 不同濃度的Ori作用于胰腺癌SW1990細胞1、2、3 d后，胰腺癌SW1990細胞增殖抑制程度不等，藥物濃度越高，抑制程度越高，兩者間具有明顯劑量與時間依賴性。見圖1。

圖1 不同濃度的Ori對胰腺癌SW1990增殖的抑制作用

2.2 流式細胞儀檢測胰腺癌SW1990細胞凋亡情況 0、10、20、40 μmol/L的Ori作用于胰腺癌SW1990細胞24 h后，凋亡率分別為0.87±0.65、1.85±1.02、5.38±0.15和16.60±0.50，出現(xiàn)明顯的G2/M期周期阻滯。見表1。

表1 不同濃度Ori作用于SW1990細胞24 h后細胞凋亡情況

注：與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01

2.3 不同濃度Ori作用于SW1990細胞24 h后，RT-PCR檢測結(jié)果 與對照組相比，10、20、40 μmol/L的Ori作用于SW1990細胞24 h后，p21 mRNA表達增加，而Survivin mRNA表達下降，具體見圖2、圖3。

3 討論

胰腺癌作為臨床惡性程度較高的腫瘤類型之一，其腫瘤在生長過程中無特異性表現(xiàn)，具有早期臨床癥狀隱匿的特點，極易出現(xiàn)轉(zhuǎn)移，大多數(shù)胰腺癌在確診時已屬晚期[4]。傳統(tǒng)的放射和手術(shù)治療對這種侵襲性的腫瘤進展療效甚微，只有對胰腺癌的分子生物學(xué)機制進行深入的研究才能尋找出一種有效的靶點進行早期診斷和治療。Survivin基因是目前為止抗凋亡活性最強的抗凋亡基因，幾乎在所有惡性腫瘤中都具有較高的表達水平，但在正常組織中則檢測不到[5]。

圖2 流式細胞儀分析的Ori處理24 h SW1990細胞的DNA直方圖

圖3 RT-PCR檢測在SW1990細胞中p21 mRNA、Survivin mRNA的表達情況

Ori作為一種從唇形科植物香菜屬植物提取的重要活性二萜成分，其主要的植物來源為香茶菜、毛葉香茶菜以及冬凌草等植物[6]。Ding等[7]研究顯示，Ori對多種腫瘤細胞均有明顯的抑制作用，通過誘導(dǎo)細胞進行程序性死亡以達到調(diào)節(jié)生物體細胞群數(shù)目相對穩(wěn)定的目的，而幾乎所有的抗腫瘤藥物都是通過誘導(dǎo)細胞凋亡來達到其抗腫瘤目的。本研究結(jié)果顯示，不同濃度的Ori作用于胰腺癌SW1990細胞1、2、3 d后，胰腺癌SW1990細胞增殖抑制程度不等，藥物濃度越高，抑制程度越高，兩者間具有明顯劑量與時間依賴性。證實Ori可以誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡，抑制腫瘤細胞的增殖。劉軍樓等[8]研究顯示，Survivin基因具有調(diào)節(jié)細胞有絲分裂以及抑制細胞凋亡的雙重功能，這是由于Survivin基因在G2/M時期呈特異性表達，是G2/M的調(diào)節(jié)因子，此時Survivin與紡錘體的微管進行特異性結(jié)合，從而維持細胞有絲分裂的正常進行。Bu等[9]研究顯示，G2/M期調(diào)控點是細胞內(nèi)外信號進行傳遞、整合與收集的重要調(diào)控點，通過將這些信號收集到細胞核從而對細胞的增殖進行調(diào)控。細胞增殖的G2/M期是RNA合成染色質(zhì)螺旋化的時期，此時細胞對外界環(huán)境的影響較為敏感，也是進行腫瘤放化療最敏感的時期[10]。另外，Ori通過抑制胰腺癌SW1990細胞的生長從而發(fā)生細胞凋亡，還可以提升三氧化二砷及伊馬替尼等化療藥物的促凋亡作用。本研究中，通過將10、20、40 μmol/L的Ori作用于胰腺癌SW1990細胞，出現(xiàn)明顯的G2/M期周期阻滯。證實細胞周期阻滯是Ori抑制胰腺癌細胞的主要機制，且Ori可以降低人胰腺癌SW1990細胞中Survivin mRNA的表達，從而解除對Caspase-3的抑制作用，以促進腫瘤細胞的凋亡[11]。p21作為一種廣譜的周期依賴性蛋白激酶，可以與細胞周期蛋白競爭性地與周期素依賴的蛋白結(jié)合，從而抑制該酶活性，降低對靶蛋白發(fā)揮磷酸化作用的能力。本研究結(jié)果顯示，與對照組相比，10、20、40 μmol/L的Ori作用于SW1990細胞24 h后，p21 mRNA表達增加，而Survivin mRNA表達下降。從而證實Ori通過使Survivin mRNA表達下降以及p21 mRNA表達增加等方式來誘導(dǎo)細胞發(fā)生凋亡以及周期阻滯，從而抑制人胰腺癌SW1990細胞的增殖，且呈時間劑量依賴。

綜上所述，Ori可以明顯抑制人胰腺癌SW1990細胞的增殖，并誘導(dǎo)凋亡和G2/M期周期阻滯來實現(xiàn)對胰腺癌SW1990細胞增殖的抑制作用，其機制與Survivin和p21調(diào)節(jié)信號有關(guān)。

[1]黎美琳,周春華,王少峰.硼替佐米對胰腺癌細胞BxPC3、SW1990生長抑制作用的體外研究[J].中華胰腺病雜志,2014,14(4):238-242.

[2]蘇秀紅,董誠明,史應(yīng)強,等.離體條件下培養(yǎng)物中冬凌草甲素積累與其組織結(jié)構(gòu)關(guān)系[J].中國實驗方劑學(xué)雜志,2014,20(3):86-90.

[3]楊光,李雪飛,魏洪吉,等.沉默STAT3基因?qū)σ认侔┘毎掀らg質(zhì)轉(zhuǎn)換的影響[J].中華肝膽外科雜志,2014,20(5):370-374.

[4]周兵,王飛通,劉小云,等.吉西他濱誘導(dǎo)胰腺癌細胞SW1990中乳腺癌耐藥蛋白基因表達的研究[J].中華實驗外科雜志,2014,31(1):43.

[5]莊燕妍,莊曉虹,陳文博,等.3-methyladenine抑制自噬誘導(dǎo)胰腺癌細胞SW1990失巢凋亡[J].中山大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)科學(xué)版),2013,34(2):193-199.

[6]曲佳,詹昱,馮可欣,等.冬凌草甲素聯(lián)合DC-CIK細胞殺傷RPMI 8226細胞的研究[J].實用醫(yī)學(xué)雜志,2014,30(14):2208-2210.

[7]Ding C,Zhang Y,Chen H,et al.Novel nitrogen-enriched oridonin analogues with thiazole-fused A-ring: protecting group-free synthesis,enhanced anticancer profile,and improved aqueous solubility[J].J Med Chem,2013,56(12):5048-5058.

[8]劉軍樓,汪悅,徐力,等.冬凌草甲素對SW1990細胞的增殖抑制作用[J].中國癌癥雜志,2010,20(12):915-920.

[9]Bu HQ,Liu DL,Wei WT,et al.Oridonin induces apoptosis in SW1990 pancreatic cancer cells via p53- and caspase-dependent induction of p38 MAPK[J].Oncol Rep,2014,31(2):975-982.

[10]王天曉,劉迎滑,時小燕.冬凌草甲素下調(diào)STAT3-HKⅡ通路誘導(dǎo)HepG2細胞凋亡的研究[J].中國藥理學(xué)通報,2014,30(3):397-402.

[11]尹波,李志偉,張弩,等.冬凌草甲素對C6大鼠腦膠質(zhì)瘤裸鼠異種移植模型的抗腫瘤療效研究[J].腫瘤學(xué)雜志,2014,20(1):34-39.

Inhibiting effect of oridonin on human pancreatic cancer cell line SW1990 and its mechanism

WANG Wen-lan1a，F(xiàn)U Cai-wen2，F(xiàn)U Wen-hao1a，LIU Shu-fang1a，WANG Shu-lian1a，CHENG San-fang1b

(1.a.The Second Department of Internal Medicine,b.Department of Pharmacy,Shexian County Hospital of Traditional Chinese Medicine,Handan 056400,China; 2.Department of Radiology,Shexian County Hospital,Handan 056400,China)

Objective To investigate the inhibit effect of oridonin on human pancreatic cancer cell line SW1990 and its mechanism.Methods SW1990 cells were induced with different concentrations (10,20,40 μmol/L) of oridonin,the proliferation of SW1990 cells were detected by CCK-8; cell cycle and apoptosis were measured by flow cytometry; RT-PCR assay was used to detect the expression level of survivin and p21 gene mRNA.Results Different concentrations of oridonin inhibited SW1990 cells proliferation in a time-and dose-dependent manner after 1d,2 d,3 d.Oridonin at 0,10,20,40 μmol/L caused obvious cell cycle arrest in G2/M phase,and 24 h apoptosis rate were 0.87%±0.65%、1.85%±1.02%,5.38%±0.15% and 16.60%±0.50%.Compared with control group,p21 mRNA expression increased,while Survivin mRNA expression decreased.Conclusion Oridonin inhibits SW1990 cells proliferation by inducing apoptosis and arresting G2/M phase cycle,which may be related to Survivin and p21 regulatory signals.

Oridonin; Pancreatic cancer; SW1990 cells; Inhibition of proliferation

2014-10-29

1.涉縣中醫(yī)院a.內(nèi)二科，b.藥劑科，河北 邯鄲 056400；2.涉縣醫(yī)院放射科，河北 邯鄲 056400

河北省中醫(yī)藥管理局科學(xué)技術(shù)研究計劃(2008056)

10.14053/j.cnki.ppcr.201507003