馮春國

(山東省墾利縣人民醫(yī)院 重癥醫(yī)學(xué)科, 山東 墾利, 257500)

重組人粒細胞集落刺激因子對腦出血大鼠神經(jīng)功能及外周血CD34+細胞、腦組織MAP-2的影響

馮春國

(山東省墾利縣人民醫(yī)院 重癥醫(yī)學(xué)科, 山東 墾利, 257500)

摘要:目的探討重組人粒細胞集落刺激因子(rhG-CSF)對腦出血大鼠神經(jīng)功能外周血CD34+細胞及腦組織中組織微管相關(guān)蛋白-2(MAP-2)的影響。方法將36只雄性Wistar大鼠隨機分為假手術(shù)組、模型組和rhG-CSF組。后2組采用注射自體不凝血法建立腦出血模型。術(shù)后rhG-CSF組皮下注射rhG-CSF 60 μg/(kg·d), 共8 d。模型組與假手術(shù)組皮下注射等量生理鹽水, 1次/d, 共8 d。結(jié)果術(shù)后1 d, rhG-CSF組和模型組均有不同程度神經(jīng)功能缺損，NSS評分無顯著差別(P>0.05), rhG-CSF組術(shù)后4、8 d均較前一時間點顯著改善(P<0.01), 且評分顯著低于模型組(P<0.01), 顯著高于假手術(shù)組(P<0.01)。術(shù)后4 d, rhG-CSF組與模型組動員的外周血CD34+含量顯著升高(P<0.05或P<0.01), 術(shù)后8 d, rhG-CSF組與模型組大鼠外周血CD34+含量均均較術(shù)后4 d時顯著下降(P<0.05); 術(shù)后4、8 d時組間比較，3組間均有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05或P<0.01)。術(shù)后8 d, 假手術(shù)組MAP-2蛋白表達量最高，模型組最低，rhG-CSF組顯著高于模型組，但仍低于假手術(shù)組(P<0.05或P<0.01)。結(jié)論rhG-CSF可促進腦出血區(qū)神經(jīng)元的增生和修復(fù)，增加外周血CD34+細胞含量，改善腦出血后神經(jīng)功能。

關(guān)鍵詞:重組人粒細胞集落刺激因子; 腦出血; 神經(jīng)功能; CD34+細胞; 組織微管相關(guān)蛋白-2

腦出血是指非外傷性腦動脈、靜脈及各毛細血管自發(fā)破裂引起的腦內(nèi)出血，又稱自發(fā)性腦出血，其發(fā)病率、致殘率及死亡率高，臨床發(fā)生率占全部腦卒中的35%[1]。傳統(tǒng)治療降低了腦出血病死率，而致殘率卻未得改善。目前，干細胞移植治療壞死腦神經(jīng)元，恢復(fù)損傷的神經(jīng)元功能已取得一定療效。重組人粒細胞集落刺激因子(rhG-CSF)可動員內(nèi)源性骨髓基質(zhì)干細胞(BMSC)釋放至外周血中，介導(dǎo)受損神經(jīng)細胞再生[2]。CD34抗原選擇性地表達于人類及其他哺乳動物造血干細胞表面，增強造血干細胞的定植，促進造血干細胞的植入、造血功能恢復(fù)以及免疫功能重建。微管相關(guān)蛋白-2(MAP-2)是一種神經(jīng)元骨架蛋白，參與神經(jīng)元的生長和損傷后修復(fù)過程，是表達成熟的神經(jīng)元標(biāo)志物[3]。本研究主要觀察了rhG-CSF對腦出血大鼠的神經(jīng)功能、外周血CD34+細胞及腦組織MAP-2的影響，現(xiàn)報告如下。

1材料與方法

1.1　實驗動物

SPF級雄性Wistar大鼠36只，10～12周齡，體質(zhì)量200～250 g, 由山東省實驗動物中心提供，合格證號SCXK(魯)20130004。

1.2　藥物與試劑

rhG-CSF注射液購自山東齊魯制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字S20063065。鼠源CD34單克隆抗體購自美國SantaCruz公司。MAP-2多克隆抗體購自美國Sigma公司。SABC免疫組化染色試劑盒和DAB顯色試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.3　方法

1.3.1分組、腦出血模型建立及給藥方法: 36只SD大鼠隨機分為假手術(shù)組、模型組和rhG-CSF組，每組12只。以10%水合氯醛按3 mL/kg腹腔注射麻醉。模型組和rhG-CSF組采用自體血注入法制備腦出血模型[4]。立體定向儀固定，頭部正中縱形切口，暴露前囟和冠狀縫，冠狀縫前0.2 mm、中縫向右旁開0.4 cm處開顱骨至硬腦膜。取0.1 mL尾動脈血，將頭皮針刺入腦內(nèi)，進針深度為6 mm。將75 μL自體不凝血(肝素抗凝)緩慢注入基底節(jié)區(qū)，留針10 min后緩慢拔針。造模后根據(jù)Berderson等[5]方法進行模型評價，抗側(cè)方推力減弱伴爬行時向?qū)?cè)劃圈，或意識喪失不能行走說明大鼠腦出血模型建立成功。術(shù)后1 h開始給藥, rhG-CSF組皮下注射rhG-CSF 60 μg/(kg·d), 共8 d。模型組和假手術(shù)組皮下注射等量生理鹽水, 1次/d，共8 d。

1.3.2神經(jīng)行為學(xué)評價：以神經(jīng)功能缺損評分(NSS)評價大鼠神經(jīng)功能缺損情況: 0分，神經(jīng)功能正常; 1分，輕度，即提尾時左前肢屈曲; 2分，中度，即行走時向左側(cè)轉(zhuǎn)圈; 3分，中度，向左側(cè)傾斜; 4分，無自發(fā)行走，意識減退; 5分，與缺血有關(guān)的死亡。評分越高表明神經(jīng)功能缺損越嚴(yán)重。

1.3.3外周血CD34+細胞含量檢測：治療第1、4、8天，麻醉大鼠，腹主動脈取血1 mL，使用溶血素裂解紅細胞, 1 500轉(zhuǎn)/min, 離心半徑3.5 cm, 離心5 min后棄上清，加入PBS制成有核細胞懸液，使用CD34+單抗標(biāo)記并用流式細胞儀進行計數(shù)。細胞含量用CD34+細胞占外周血白細胞百分比表示。

1.3.4MAP-2含量檢測：采用免疫組織化學(xué)法檢測，術(shù)后第8天，神經(jīng)功能缺損評分及腹主動脈取血后，大鼠以4 ℃ 40 g/L多聚甲醛溶液經(jīng)左心室至主動脈灌注，然后取距離前額2 mm至視交叉處部位剝?nèi)∈竽X，脫水，石蠟包埋。腦組織石蠟切片常規(guī)脫蠟水化。采用SABC法行免疫組化染色檢測MAP-2陽性細胞。每例標(biāo)本取4張片子，在400倍視野下每張片子上在出血病灶區(qū)隨機取5個視野, Image-Pro Plus 5.0軟件進行圖像分析平均吸光度值。

1.4　觀察指標(biāo)

觀察3組手術(shù)后1、4、8 d的NSS評分和外周血CD34+細胞含量，以及術(shù)后8 d各組MAP-2蛋白表達水平。

2結(jié)果

2.1　各組NSS評分比較

假手術(shù)組未出現(xiàn)神經(jīng)功能缺損情況, rhG-CSF組和模型組均有不同程度神經(jīng)功能缺損，表明腦出血模型建立成功。模型組術(shù)后各時間點評分無顯著改善, rhG-CSF組術(shù)后4、8 d均較前一時間點顯著改善(P<0.01)。術(shù)后1 d, rhG-CSF組和模型組評分無顯著差別(P>0.05), 但均高于假手術(shù)組(P<0.01); 術(shù)后4 d和8 d時rhG-CSF組評分顯著低于模型組(P<0.01), 顯著高于假手術(shù)組(P<0.01)。見表1。

2.2　各組外周血CD34+細胞含量比較

術(shù)后1 d時，各組CD34+細胞含量無顯著差異(P>0.05)。術(shù)后4 d時，假手術(shù)組無顯著變化, rhG-CSF組與模型組動員的外周血CD34+含量顯著升高(P<0.05或P<0.01); 術(shù)后8 d, rhG-CSF組與模型組大鼠外周血CD34+含量均較術(shù)后4 d時顯著下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。術(shù)后4、8 d時組間比較, 3組比較有顯著差異(P<0.05或P<0.01)。見表2。

分

與同時期假手術(shù)組比較, **P<0.01; 與同時期模型組比較, ##P<0.01; 與本組前一時刻比較, △△P<0.01。

表2　3 組大鼠術(shù)后外周血CD34+細胞含量　%

表2　3 組大鼠術(shù)后外周血CD34+細胞含量　%

組別例數(shù)術(shù)后1d術(shù)后4d術(shù)后8d假手術(shù)組120.16±0.050.15±0.070.15±0.06模型組120.16±0.040.29±0.16*△0.19±0.01*△rhG-CSF組120.15±0.060.58±0.16**##△△0.42±0.14**##△

與同時期假手術(shù)組比較, *P<0.05, **P<0.01; 與同時期模型組比較, ##P<0.01;

與本組前一時間點比較，△P<0.05, △△P<0.01。

2.3　各組MAP-2蛋白表達水平

術(shù)后8 d，假手術(shù)組免疫組化染色結(jié)果顯示染色強，排列整齊均勻，形態(tài)規(guī)則。rhG-CSF組出血灶周邊則染色均勻，形態(tài)較規(guī)則，突起排列呈束狀，這意味著神經(jīng)軸突和樹突增生活躍。模型組出血灶周邊有少量MAP-2表達，染色程度較低，排列稀疏。見圖1。

A. 假手術(shù)組; B: rhG-CSF組; C. 模型組

圖1神經(jīng)元MAP-2免疫組化染色結(jié)果

假手術(shù)組、rhG-CSF組和模型組MAP-2蛋白表達量分別為(0.33±0.18)、(0.21±0.05)、(0.13±0.09)，兩兩比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。

3討論

腦出血可導(dǎo)致神經(jīng)功能受損，如何減輕神經(jīng)功能損傷，是目前腦出血研究的重點[6]。越來越多的證據(jù)[7]表明，高度分化的腦神經(jīng)細胞是可再生的，腦出血可誘導(dǎo)內(nèi)源性干細胞的增殖分化，但數(shù)量極少，自身修復(fù)能力有限。rhG-CSF可動員自身BMSC遷移到受損的腦組織區(qū)域，重塑受損神經(jīng)元，是一種新興干細胞移植療法[8-9]。研究[10]顯示大鼠皮下注射rhG-CSF動員BMSC, 可加速損傷血管段的內(nèi)皮再生，動員BMSC歸巢至腦缺血損傷區(qū)，免疫染色證實BMSC可分化成膠質(zhì)細胞以及神經(jīng)元細胞等, MRI檢查可見病灶明顯縮小。本研究用發(fā)現(xiàn)rhG-CSF組給藥后NSS評分逐漸降低，且低于同時間點模型組(P<0.01), 表明rhG-CSF可有效改善腦出血大鼠神經(jīng)功能。

CD34抗原選擇性地表達于哺乳動物造血干細胞表面，是造血干細胞的表面標(biāo)志，檢測外周血CD34+細胞含量可反映外周血干細胞的含量[11-12]。Ponte[13]研究表明G-CSF可促進基質(zhì)金屬蛋白酶-2依賴性CD34+細胞的遷移。有研究表明急性腦缺血后神經(jīng)功能的修復(fù)程度與外周血CD34+細胞的水平呈正相關(guān)[14]。本研究中，盡管rhG-CSF組術(shù)后8 d外周血CD34+細胞較術(shù)后4 d有所下降，提示rhG-CSF可有效促進CD34+細胞遷移，加快神經(jīng)功能修復(fù)。

MAP-2是主要表達于神經(jīng)元樹突及胞體內(nèi)微管，參與神經(jīng)元的生長和修復(fù)過程，是成熟神經(jīng)元的標(biāo)志性蛋白。MAP-2在缺血中心幾乎無喪失，而在完整的神經(jīng)元和缺血半暗帶則會表達升高。本研究免疫組化結(jié)果顯示模型組MAP-2表達最低，rhG-CSF組出血灶周邊則染色均勻，形態(tài)較規(guī)則，突起排列呈束狀, MAP-2蛋白表達顯著高于同時間點模型組，這意味著rhG-CSF可有效促進神經(jīng)樹突和胞體增生。

綜上所述, hG-CSF治療急性腦出血大鼠可動員BMSC歸巢至出血部位，參與損傷腦缺血組織部位神經(jīng)元修復(fù)及功能恢復(fù)，與夏明武等[15]報道基本一致，為臨床應(yīng)用hG-CSF治療腦出血提供了依據(jù)。

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Influence of rhG-CSF on the neurological function and peripheral blood CD34+cells and MAP-2 in brain tissues of rats with ICH

FENG Chunguo

(DepartmentofIntensiveMedicine,ThePeople′sHospitalofKenliCounty,Kenli,Shandong, 257500)

ABSTRACT:ObjectiveTo explore the influence of recombinant human granulocyte-colony stimulating factor (rhG-CSF) on the neurological function, peripheral blood CD34+cells and microtubule associated protein-2 (MAP-2) in brain tissues of rats with intracerebral hemorrhage (ICH). MethodsA total of 36 male Wistar rats were randomly divided into sham-operation group, model group and rhG-CSF group. The model group and the rhG-CSF group were established by injecting autologous un-coagulated blood. After operation, subcutaneous injection of rhG-CSF 60 μg/(kg·d) was given to the rhG-CSF group for 8 days. The model group and the sham-operation group were injected subcutaneously with equivalent normal saline, 1 time per day for totally 8 days. ResultsOne day after operation, the rhG-CSF group and the model group had different degrees of neurological functional deficits, but neurological severity score(NSS) showed no significant difference (P>0.05). Four and eight days after operation, the neurological function significantly improved when compared with the previous time point in the rhG-CSF group (P<0.01), and NSS score in the rhG-CSF group was significantly lower than that in the model group (P<0.01), and was significantly higher than that in the sham-operation group (P<0.01). The peripheral blood CD34+cell level increased apparently 4 days after operation in the rhG-CSF group and the model group, and there was significant difference (P<0.05 or P<0.01). Eight days after operation, the peripheral blood CD34+cell level in the rhG-CSF group and the model group decreasedsignificantly when compared with that 4 days after operation(P<0.05).There were significant differences among three groups at each time point (P<0.05 or P<0.01). Eight days after operation, MAP-2 level was the highest in the sham-operation group and the lowest in the model group, which was still significantly lower in the model group and higher in the sham-operation group when compared with the rhG-CSF group (P<0.05 or P<0.01). ConclusionThe rhG-CSF can improve the hyperplasia and repair of neurons, increase peripheral blood CD34+cell level and improve the neurological function after hemorrhage in ICH.

KEYWORDS:recombinant human granulocyte-colony stimulating factor; intracerebral hemorrhage; neurological function; CD34+cells; microtubule associated protein-2

基金項目:中國高校醫(yī)學(xué)期刊臨床專項資金(11321453)

收稿日期:2014-12-09

中圖分類號:R 722.15

文獻標(biāo)志碼:A

文章編號:1672-2353(2015)07-025-04DOI: 10.7619/jcmp.201507006