馬致南, 徐　揚, 鄔姝陽, 曾　新, 李　萍

(1. 江蘇省揚州市婦幼保健院 婦產(chǎn)科, 江蘇 揚州, 225000;

江蘇省2. 南京市玄武區(qū)婦幼保健所 婦科 江蘇 南京, 210029;

3. 江蘇省南京市婦幼保健院 婦幼醫(yī)學(xué)研究中心, 江蘇 南京, 210004;

4. 江蘇省南京市婦幼保健院 婦科 內(nèi)分泌科, 江蘇 南京, 210004)

miR-1976在細菌性陰道病中的作用及其機制

馬致南1, 徐揚1, 鄔姝陽2, 曾新3, 李萍4

(1. 江蘇省揚州市婦幼保健院 婦產(chǎn)科, 江蘇 揚州, 225000;

江蘇省2. 南京市玄武區(qū)婦幼保健所 婦科 江蘇 南京, 210029;

3. 江蘇省南京市婦幼保健院 婦幼醫(yī)學(xué)研究中心, 江蘇 南京, 210004;

4. 江蘇省南京市婦幼保健院 婦科 內(nèi)分泌科, 江蘇 南京, 210004)

摘要:目的闡述miR-1976及CD105, 整合素αvβ6的關(guān)系,探討三者在陰道感染中的作用及機制。方法采用Real-Time PCR方法檢測健康及細菌性陰道病患者陰道黏膜組織中miR-1976與CD105、整合素αvβ6的表達；評估陰道上皮細胞系VK2/E6E7過表達miR-1976后其CD105, 整合素αvβ6的表達情況；闡述過表達miR-1976對VK2/E6E7細胞增殖和凋亡的影響。結(jié)果細菌性陰道病患者陰道黏膜組織中miR-1976顯著低表達，而CD105, 整合素αvβ6的mRNA顯著高表達(P<0.05); VK2/E6E7細胞過表達miR-1976后，其增殖和凋亡未受明顯影響，而CD105和整合素 αvβ6的mRNA則顯著低表達(P<0.05)。結(jié)論miR-1976通過CD105調(diào)節(jié)整合素αvβ6的表達，從而影響陰道上皮細胞的黏附能力，參與細菌性陰道病的發(fā)生。

關(guān)鍵詞:細菌性陰道病; miR-1976; CD105; 整合素αvβ6

病原微生物定植于陰道黏膜表面是陰道炎發(fā)生的第一步。當發(fā)生病原微生物入侵時，陰道黏膜上皮細胞迅速脫落(剝離)，以保護機體免受感染；但大多數(shù)病原微生物可通過改變陰道黏膜上皮細胞的黏著能力，阻斷細胞的遷移與脫落，從而定植于陰道黏膜，破壞其防御，導(dǎo)致陰道炎。治療陰道炎，從陰道黏膜本身的防御功能及機制出發(fā)，尋找新的治療靶標，有可能改變目前陰道炎治療效果不佳的現(xiàn)狀[1-3]。

整合素是細胞表面黏附分子家族成員之一，介導(dǎo)細胞間及細胞與細胞外基質(zhì)(ECM)的黏附反應(yīng)及信號傳遞，調(diào)節(jié)細胞的各種生物學(xué)行為，對細胞黏附、生存、生長、增殖、凋亡起主要調(diào)節(jié)作用[4]。其中，整合素的亞型αvβ6在腸道黏膜的感染與防御中具有重要的調(diào)控作用[5-6], 考慮到不同部位的黏膜具有相似特性，因此整合素家族成員αvβ6也可能是參與了陰道黏膜感染與防御的關(guān)鍵分子。

本研究檢測了細菌性陰道病女性陰道黏膜組織中miR-1976與CD105、整合素αvβ6的表達情況，并檢測了miR-1976在陰道上皮細胞VK2/E6E7中過表達后對其增殖和凋亡的影響以及對CD105與整合素αvβ6表達的影響，以期闡述miR-1976與CD105、整合素 αvβ6在陰道感染中的關(guān)系、作用及機制。

1資料與方法

1.1　標本收集和處理

收集2013年9月—2014年5月由于子宮良性腫瘤在本院行全子宮切除術(shù)的健康與細菌性陰道病女性的陰道黏膜組織各30 例，術(shù)中黏膜組織離體后以4 ℃無菌PBS緩沖液沖洗后迅速置入液氮，保存待用。

1.2　材料來源

人陰道上皮細胞系VK2/E6E7購于美國模式培養(yǎng)物集存庫(ATCC); K-SFM培養(yǎng)基(美國Gibco); miR-1976慢病毒過表達載體(上海吉凱); Trizol(美國Invitrogen); Real-Time PCR試劑盒(美國Thermo); PR-7-AAD凋亡試劑盒(美國BD)；未提及試劑均購自美國Gibco公司。

1.3　方法

1.3.1Real-Time PCR:檢測健康女性與細菌性陰道病女性陰道黏膜中miR-1976, CD105、整合素 αvβ6的mRNA表達。按Trizol說明書提取組織總RNA，經(jīng)紫外分光光度法定量后，應(yīng)用實時熒光定量(RT-PCR)法檢測細胞中CD105、整合素β6亞基、內(nèi)參GAPDH基因mRNA表達水平。β6亞基上游引物序列: 5′-GAAGGAATGATCACGTACAAGGT-3′, 下游引物序列: 5′-AGCAGGCAGTCTTCACAGGT-3′; GAPDH基因上游引物序列: 5′-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3′, 下游引物序列: 5′-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3′。實時熒光定量RT-PCR采用Taqman探針法，反應(yīng)體系20 μL: 熒光定量探針反應(yīng)預(yù)混液10 μL, 探針和引物預(yù)混液1 μL, 模板cDNA 1 μL, 水8 μL。cDNA模板擴增反應(yīng)條件: 95 ℃ 10 min變性; 95 ℃ 15 s、57 ℃ 30 s, 72 ℃ 30 s, 共40個循環(huán)。RT-PCR每次實驗設(shè)3個復(fù)孔，實驗重復(fù)3次。

1.3.2細胞培養(yǎng): VK2/E6E7細胞復(fù)蘇后培養(yǎng)于K-SFM培養(yǎng)基，置于37 ℃、含5%CO2的培養(yǎng)箱中，當細胞貼壁后達到90%融合時，以0.25%胰蛋白酶、0.02% EDTA消化液消化8 min, 倒置顯微鏡下觀察見細胞形態(tài)變圓漂浮后，加入含10% FBS的DMEM/F-12培養(yǎng)基，吸取細胞懸液至10 mL離心管, 1 000 r/min離心10 min, 棄上清, 1∶3轉(zhuǎn)移細胞至25 cm培養(yǎng)瓶繼續(xù)培養(yǎng)，每2～3 d傳代1次。

1.3.3慢病毒轉(zhuǎn)染: 克隆人miR-1976所在區(qū)域500 bp左右的基因組序列(minigene), 構(gòu)建慢病毒過表達載體(GFP作為 marker); 以只含GFP的慢病毒載體為對照，包被成慢病毒顆粒，感染VK2/E6E7細胞; 72 h后在熒光顯微鏡下觀察GFP熒光蛋白表達，判斷病毒感染效率。經(jīng)預(yù)實驗后確定感染復(fù)數(shù)(MOI)=10, 將3×105個細胞接種至25 cm小瓶中(融合度約30%), 貼壁后加入miR-1976過表達慢病毒約12 μL(濃度為1×109TU/mL), 同時加入polybrene 3 μL(20 mg/mL)以增強轉(zhuǎn)染效率；在37 ℃含5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h后更換新鮮培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染72 h后熒光顯微鏡下觀察GFP熒光蛋白表達以判定轉(zhuǎn)染效果；采用Real-Time PCR技術(shù)驗證細胞內(nèi)成熟miR-1976是否過表達。同法轉(zhuǎn)染只含GFP的空白載體病毒。

1.4　MTT 法檢測細胞增殖

轉(zhuǎn)染miR-1976過表達慢病毒載體72 h后，將VK2/E6E7細胞以4 000個/孔置入96孔板中，同時設(shè)置陰性對照和空白對照組，每組設(shè)6個平行孔，繼續(xù)培養(yǎng)0、24、48、72 h，于每孔加入濃度為5 μg/mL的MTT溶液10 μL, 繼續(xù)培養(yǎng)4 h, 棄上清，每孔加100 μL DMSO溶液終止反應(yīng)，搖床震蕩10 min, 在酶標儀上測出每孔490 nm波長的吸光度值，繪制細胞增殖曲線。實驗重復(fù)3次。

1.5　PE-7AAD雙標記法檢測細胞凋亡

細胞轉(zhuǎn)染miR-1976過表達慢病毒載體培養(yǎng)72 h后收獲細胞, PBS洗滌2次，重懸于100 μL 1×Binding Buffer, 混勻，加入5 μL PE和5 μL 7-AAD, 室溫避光反應(yīng)15 min; 300 g、4℃離心5 min, 棄上清，加400 μL 1×Binding Buffer, 混勻。1 h內(nèi)流式細胞儀檢測細胞凋亡率。設(shè)置空白對照組及陰性對照組。實驗重復(fù)3次。

Real-Time PCR法檢測CD105與整合素αvβ6在過表達miR-1976的VK2/E6E7細胞與其對照組細胞中的表達情況。方法同前。

2結(jié)果

2.1　miR-1976、CD105及整合素αvβ6在細菌性陰道病女性陰道黏膜組織中的表達

表達三PCR: glycumtance ogy, Nan Nanjing, Nanjing, Jiangsu, Real-Time PCR檢測健康與細菌性陰道病女性的陰道黏膜組織各30例，細菌性陰道病女性陰道黏膜組織中miR-1976表達下調(diào)6.3倍，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05), 表明細菌性陰道病女性陰道黏膜中miR-1976明顯下調(diào)(圖1A)。Real-Time PCR檢測健康與細菌性陰道病女性的陰道黏膜組織，可見CD105在細菌性陰道病女性陰道黏膜組織中表達增高3.1倍，整合素αvβ6在細菌性陰道病女性陰道黏膜組織中表達增高2.4倍，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05), 表明CD105、整合素αvβ6在細菌性陰道病女性的陰道黏膜組織中顯著高表達(圖1 B、1C)。

A. miR-1976在細菌性陰道病組低表達

B. CD105在細菌性陰道病組高表達

C. 整合素αvβ6在細菌性陰道病組高表達

圖1miR-1976與CD105、整合素αvβ6在

細菌性陰道病女性陰道黏膜組織中的表達

2.2　過表達miR-1976對VK2/E6E7細胞中miR-1976與CD105、整合素αvβ6表達的影響

熒光顯微鏡結(jié)果如圖2B示，綠色熒光為GFP表達，可見轉(zhuǎn)染陽性率>80%，慢病毒轉(zhuǎn)染成功。

2.3　Real-Time PCR及MTT結(jié)果

VK2/E6E7細胞中miR-1976表達增高(約5.5倍)(圖3 A); MTT結(jié)果示慢病毒轉(zhuǎn)染后，過表達miR-1976細胞與空載慢病毒細胞均于細胞培養(yǎng)約36 h達增殖平臺期，慢病毒載體對細胞增殖能力無明顯影響(圖3B)。

2.4　細胞凋亡

慢病毒轉(zhuǎn)染VK2/E6E7細胞后，細胞凋亡率明顯增加，未轉(zhuǎn)染細胞凋亡率為1%，而轉(zhuǎn)染空載慢病毒載體的細胞凋亡率為60.2%; 但轉(zhuǎn)染過表達miR-1976慢病毒載體的細胞凋亡率較空載慢病毒凋亡率低，僅為32.5%, 差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05), 表明miR-1976過表達后慢病毒載體對VK2/E6E7細胞凋亡有明顯影響，而miR-1976過表達則對其凋亡無明顯影響(圖4)。

A. 攝于白光

B. 攝于綠光

A. miR-1976慢病毒感染VK2/E6E7

B. miR-1976慢病毒感染VK2/E6E7

細胞后對其增殖的影響情況

圖3miR-1976慢病毒感染VK2/E6E7細胞

2.5　miR-1976過表達的VK2/E6E7細胞中CD105及整合素αvβ6的表達

miR-1976過表達的VK2/E6E7細胞中CD105表達下調(diào)2.3倍，整合素αvβ6表達下調(diào)2.1倍，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05), 表明VK2/E6E7細胞中過表達miR-1976后CD105及整合素αvβ6表達明顯下調(diào)(圖5)。

A. 為對照組細胞的凋亡情況; B. 為空載慢病毒載體對細胞凋亡的影響; C. 為miR-1976過表達對細胞凋亡的影響。

圖4過表達miR-1976對VK2/E6E7細胞凋亡的影響

3討論

越來越多的研究[7]顯示，具有調(diào)控功能的非編碼RNA-miRNAs是有潛力的生物標志物，其大小20～25個核苷酸。成熟的miRNA在RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物(RISC)引導(dǎo)下在轉(zhuǎn)錄后對靶基因mRNA的表達實施調(diào)控。在哺乳動物中，多數(shù)情況是與部分互補mRNA的3′-UTR區(qū)片段完全或不完全配對，降解靶mRNA或阻遏其轉(zhuǎn)錄后蛋白質(zhì)的翻譯，即負向調(diào)控基因表達。microRNA

圖5 miR1976過表達對CD105與整合素αvβ6表達的影響

在人類多種疾病中發(fā)揮調(diào)控作用，可以作為潛在的診斷標志、預(yù)后標志及治療靶標[8]。本實驗發(fā)現(xiàn)miR-1976在細菌性陰道病患者陰道黏膜組織中的表達明顯下調(diào)，同時CD105及整合素αvβ6的表達明顯上升; miR-1976過表達慢病毒載體不影響VK2/E6E7細胞的增殖和凋亡，但其過表達后陰道上皮細胞VK2/E6E7中CD105及整合素αvβ6表達明顯下調(diào)。這一結(jié)果提示miR-1976可能通過調(diào)節(jié) CD105的表達進而調(diào)節(jié)整合素αvβ6的表達，從而影響陰道上皮細胞的黏著能力，進而參與陰道黏膜的感染與防御功能。

CD105是一類比較新的細胞黏附分子，主要與細胞的增殖有關(guān)并參與腫瘤血管的生成；細胞表面的αvβ6通過胞外區(qū)與其配體結(jié)合后，通過胞內(nèi)區(qū)與細胞內(nèi)骨架蛋白如肌動蛋白、踝蛋白和紐蛋白等相互作用，介導(dǎo)細胞黏附，并將細胞外基質(zhì)(ECM)所承載的信號經(jīng)過復(fù)雜的通路傳遞至細胞核內(nèi)，從而影響細胞基因的表達，進而影響細胞的運動、增殖、分化、凋亡[9]。本研究結(jié)果證實，細菌性陰道病女性陰道黏膜組織中整合素αvβ6的表達顯著高于正常女性陰道黏膜組織，提示整合素αvβ6在細菌性陰道病中發(fā)揮重要作用。miR-1976在VK2/E6E7細胞過表達后使CD105表達下調(diào)、同時使整合素αvβ6的表達下調(diào)，提示miR-1976可能在陰道上皮細胞中直接調(diào)控CD105、整合素αvβ6。

Muenzner等[10]在Science發(fā)表的研究論文證實，陰道中的淋病奈瑟菌(neisseria gonorrhoeae)與黏膜上皮細胞表面的癌胚抗原相關(guān)的細胞黏附分子(CEACAMs)結(jié)合將引發(fā) CD105的從頭合成, CD105通過激活整合素的內(nèi)向信號轉(zhuǎn)導(dǎo)功能使整合素的活性增加，增強受感染的黏膜上皮細胞的黏著能力，避免其遷移與脫落，有利于淋病奈瑟菌的定植及感染。這與本研究結(jié)果具有一致性。分析細菌性陰道病發(fā)病機制可能為miR-1976低表達，解除了對靶基因CD105的抑制作用, CD105從頭合成增加，增強整合素αvβ6的活性，使陰道壁上皮細胞的黏附能力增強，脫落減少，有利于致病菌定植于陰道壁上皮細胞并感染細胞，從而導(dǎo)致細菌性陰道病的發(fā)生。

本研究通過比較miR-1976過表達前后VK2/E6E7細胞中CD105和整合素αvβ6表達水平的變化，發(fā)現(xiàn)miR-1976過表達可以下調(diào)CD105和整合素αvβ6的表達，這將有助于闡明 miR-1976 在陰道上皮細胞中的生物學(xué)功能及其參與陰道黏膜感染與防御功能的分子機制，提示miR-1976可能成為一個新的極具前景的陰道炎治療的靶點。

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Function and mechanism of miR-1976 in bacterial vaginosis

MA Zhinan1, XU Yang1, WU Shuyang2,

ZENG Xin3, LI Ping4

(1.DepartmentofObstetricsandGynecology,YangzhouMaternalandChildHealthCare

Hospital,Yangzhou,Jiangsu, 225000; 2.DepartmentofGynecology,Maternaland

ChildHealthCareCenterofXuanwuDistrictinNanjing,Nanjing,Jiangsu, 210029;

3.TheResearchCenterofMaternalandChildMedicine,NanjingMaternal

andChildHealthCareHospital,Nanjing,Jiangsu, 210004; 4.Departmentof

Gynecology,NanjingMaternalandChildHealthCareHospital,Nanjing,Jiangsu, 210004)

ABSTRACT:ObjectiveTo clarify the relationship among miR-1976, CD105and integrin αvβ6 and to evaluate the function and mechanism of miR-1976, CD105and integrin αvβ6 in vaginal mucosa infection.MethodsThe expression levels of miR-1976, CD105and integrin αvβ6 in vaginal mucosa of healthy women and vaginitis ones were detected by real-time PCR, and the expression levels of CD105and integrin αvβ6 in VK2/E6E7 cell lines were investigated under the circumstance of miR-1976 over-expressed. Meanwhile, flow cytometry was used to evaluate the influence of lentivirus on cell proliferation and apoptosis.ResultsThe expression of miR-1976 was significantly lower in vaginitis mucosa than in healthy ones(P<0.05), and the mRNA of CD105and integrin αvβ6 were much higher reversely(P<0.05). After miR-1976 was over-expressed in VK2/E6E7 cell lines, the cell proliferation and apoptosis were scarcely impacted by the lentivirus, and the mRNA of CD105and integrin αvβ6 were much lower than before(P<0.05). ConclusionIt has been verified that miR-1976 can regulate the expression of integrin αvβ6 through CD105, and miR-1976 also participate in vaginal mucosa infection through influencing the adhesion ability of vaginal mucosa cells.

KEYWORDS:bacterial vaginal disease; miR-1976；CD105; integrin αvβ6

通信作者:李萍, E-mail:liping0099@126.com

基金項目:國家自然科學(xué)基金資助項目(81370679); 江蘇省揚州市科技計劃項目(2014189)

收稿日期:2014-12-20

中圖分類號:R 711.73

文獻標志碼:A

文章編號:1672-2353(2015)07-006-05DOI: 10.7619/jcmp.201507002