張六六，夏森玉，丁亞欣，吳 燕，劉 佳

(1. 江蘇省微生物研究所有限責(zé)任公司，江蘇無錫 214000；2. 江蘇納克生物工程有限公司，江蘇盱眙 211700;3. 無錫市濱湖區(qū)農(nóng)林局，江蘇無錫 214000)

?

有機(jī)磷農(nóng)藥高效降解微生物的篩選與鑒定

張六六1,2，夏森玉2，丁亞欣3，吳 燕1，劉 佳1

(1. 江蘇省微生物研究所有限責(zé)任公司，江蘇無錫 214000；2. 江蘇納克生物工程有限公司，江蘇盱眙 211700;3. 無錫市濱湖區(qū)農(nóng)林局，江蘇無錫 214000)

摘要[目的]篩選對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥具有高效降解能力的微生物菌種。[方法]在有機(jī)磷農(nóng)藥富集地區(qū)采樣，利用選擇培養(yǎng)的方式篩選對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥具有高效降解能力的微生物菌種，對(duì)篩選到的微生物進(jìn)行鑒定，并研究其降解特性。[結(jié)果]在長(zhǎng)期受有機(jī)磷農(nóng)藥污染的環(huán)境下采集56份土壤及污水樣本，從中篩選到可高效降解有機(jī)磷農(nóng)藥的菌株JWDP-16，其對(duì)氧化樂果的最高降解率達(dá)59.80%，該菌對(duì)其他有機(jī)磷農(nóng)藥具有廣譜降解能力，同時(shí)表現(xiàn)出良好的遺傳穩(wěn)定性，通過分類鑒定確定該菌為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)。[結(jié)論]菌株JWDP-16對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥具有高效降解能力，可進(jìn)一步研究與開發(fā)。

關(guān)鍵詞有機(jī)磷農(nóng)藥；微生物降解；分離篩選；菌種鑒定

作為一類高效、廣譜的農(nóng)藥產(chǎn)品，自20世紀(jì)40年代發(fā)明第1個(gè)產(chǎn)品“1605對(duì)硫磷”以來，有機(jī)磷農(nóng)藥(OPs)被廣泛應(yīng)用在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上，大幅提高了農(nóng)作物的產(chǎn)量[1]，目前我國(guó)的OPs使用量已占所有農(nóng)藥使用量的70%～80%[2]。隨著OPs在農(nóng)業(yè)上的大規(guī)模使用，其引起的一系列問題逐漸凸顯，所帶來的危害越來越被人們重視：造成病蟲害產(chǎn)生抗藥性，導(dǎo)致農(nóng)藥使用量逐漸加大，使得農(nóng)業(yè)生產(chǎn)力大幅下降，形成惡性循環(huán)；造成嚴(yán)重的農(nóng)產(chǎn)品農(nóng)藥殘留，直接威脅人類健康；嚴(yán)重污染土壤、水體及大氣環(huán)境，降低了周圍生物種群的多樣性，破壞生態(tài)系統(tǒng)的平衡[3-4]。同時(shí)由于OPs的自然降解周期長(zhǎng)，使得研究人為加速其降解速度是目前急需解決的關(guān)鍵技術(shù)[5]。由于大部分有機(jī)磷農(nóng)藥均為高毒類農(nóng)藥，長(zhǎng)期過量使用對(duì)人類健康和生活環(huán)境造成嚴(yán)重危害，因此，包括有機(jī)磷農(nóng)藥在內(nèi)的化學(xué)農(nóng)藥降解問題已成為目前研究的熱點(diǎn)之一[14]。

由于微生物具有繁殖速度快、代謝能力強(qiáng)、不產(chǎn)生二次污染等特點(diǎn)，因此，利用微生物進(jìn)行農(nóng)藥的降解是目前解決上述問題的重要手段[6]。農(nóng)藥的微生物降解是指利用微生物的代謝過程使農(nóng)藥的化學(xué)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，使其由有害的大分子化合物降解為無害的小分子化合物直至CO2、H2O，實(shí)現(xiàn)無害化降解的過程[7]。研究表明，微生物降解農(nóng)藥具有降解速度快、降解效果徹底、環(huán)境影響小、處理成本低等特點(diǎn)[8]。筆者在有機(jī)磷農(nóng)藥富集地區(qū)采樣，利用選擇培養(yǎng)的方式篩選了對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥具有高效降解能力的微生物菌種，并對(duì)篩選到的微生物進(jìn)行了鑒定，以期為有機(jī)磷農(nóng)藥的降解研究及微生物菌劑的開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 培養(yǎng)基。營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(NB)：蛋白胨10 g/L，牛肉膏3 g/L，氯化鈉5 g/L，pH 7.2。營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(NA)：蛋白胨10 g/L，牛肉膏3 g/L，氯化鈉5 g/L，瓊脂15～20 g/L，pH 7.2[9]。液體選擇培養(yǎng)基：普通營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基經(jīng)過滅菌后，冷卻至50 ℃左右加入1 g/L有機(jī)磷農(nóng)藥。固體選擇培養(yǎng)基：營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基經(jīng)過滅菌后，冷卻至50 ℃左右加入1 g/L有機(jī)磷農(nóng)藥。

1.1.2 試劑。TaqDNA聚合酶和PfuDNA聚合酶均為Fermentas產(chǎn)品；細(xì)菌基因組DNA快速抽提試劑盒及PCR產(chǎn)物純化試劑盒均購(gòu)自生工生物工程(上海)有限公司。其他試劑均購(gòu)自國(guó)藥試劑公司。

1.1.3藥劑。氧化樂果、甲胺磷、甲拌磷由江蘇揚(yáng)農(nóng)化工集團(tuán)有限公司生產(chǎn)；水胺硫磷由湖北仙隆化工股份有限公司生產(chǎn)；二嗪磷由河南地衛(wèi)士生物科技有限公司生產(chǎn)；甲基嘧啶磷由先正達(dá)公司生產(chǎn)；毒死蜱由海南正業(yè)中農(nóng)高科股份有限公司生產(chǎn)。敵敵畏、敵百蟲、對(duì)硫磷由江蘇納克生物工程有限公司惠贈(zèng)。

1.1.4主要儀器。Biophotometer plus分光光度計(jì)(德國(guó)Eppendorf公司)、C1000核酸電泳系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司)、ChemiDoc MP全能型凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司)、AL104型電子天平(瑞士Mettler Toledo公司)、PHS-3CT實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)(上海今邁儀器有限公司)。

1.2方法

1.2.1 樣本的采集。采樣地點(diǎn)：① 江蘇蘇北地區(qū)某有機(jī)磷農(nóng)藥生產(chǎn)企業(yè)污水處理區(qū)及工廠、倉(cāng)庫(kù)周邊土壤；② 無錫附近地區(qū)經(jīng)常噴灑有機(jī)磷農(nóng)藥或最近噴灑過有機(jī)磷農(nóng)藥的大田、果園、蔬菜大棚等。采樣方法：① 對(duì)于土壤樣品的采集，用預(yù)先滅菌的小鏟子取表土及地表下5～10 cm處的土樣1 000 g左右，盛于預(yù)先滅菌的牛皮紙袋中，扎緊[10]；② 對(duì)于廢渣等樣品，用預(yù)先滅菌鑷子夾入滅菌的牛皮紙袋中，扎緊；③ 對(duì)于污染水樣，用滅菌帶蓋小玻璃瓶盛約100 ml水樣。所有采集得到的樣品均標(biāo)明時(shí)間、地點(diǎn)和環(huán)境等情況。

1.2.2 樣本中菌種的分離與純化。稱取1 g(或1 ml)采集獲得的樣本加入到10 ml PBS緩沖液中，振蕩分散2 h。取1 ml振蕩后的溶液加入到100 ml液體選擇培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)24 h。將培養(yǎng)后的菌液涂布于固體選擇培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)并定期觀察，挑取在選擇培養(yǎng)基上正常生長(zhǎng)且菌落形態(tài)不同的菌株進(jìn)行劃線分離直至單菌落，保藏。

1.2.3 高活性、高有機(jī)磷農(nóng)藥降解能力菌株的篩選。

1.2.3.1初篩。以菌落在相同條件下菌落生長(zhǎng)水解圈的大小和生長(zhǎng)繁殖能力作為初篩依據(jù)。首先將分離到菌株點(diǎn)樣接種在固體選擇培養(yǎng)基中央，37 ℃培養(yǎng)48 h，觀察其生長(zhǎng)情況并測(cè)量水解圈的大小，3次重復(fù)。同時(shí)用接種環(huán)挑取菌株接種于液體選擇培養(yǎng)基中，每組3次重復(fù)，37 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)48 h，測(cè)定其OD600值。

1.2.3.2復(fù)篩。采用分光光度計(jì)測(cè)定菌株對(duì)氧化樂果的降解能力[11]。磷含量(x)與吸光度(y)之間的線性關(guān)系良好，標(biāo)準(zhǔn)線性方程(圖1)為：y=0.558 2x+0.016 5,R2=0.999 2。

圖1　磷含量對(duì)吸光度值的標(biāo)準(zhǔn)曲線

將初篩獲得的菌株接種至液體選擇培養(yǎng)基中，以不接種菌的空液體選擇培養(yǎng)基作為對(duì)照，試驗(yàn)進(jìn)行5次重復(fù)，37 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)72 h。采用分光光度法分別測(cè)定培養(yǎng)前后培養(yǎng)液中有機(jī)磷含量，按照公式：有機(jī)磷農(nóng)藥降解率=(M2-M1)/M1×100%(其中，M1為培養(yǎng)后的有機(jī)磷含量，M2為培養(yǎng)前的有機(jī)磷含量)，計(jì)算有機(jī)磷降解率，考察各菌株對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥的降解能力。

1.2.4菌種有機(jī)磷農(nóng)藥降解特性研究。

1.2.4.1有機(jī)磷農(nóng)藥廣譜降解能力的研究。選擇甲胺磷、胺硫磷、甲拌磷、敵敵畏、敵百蟲、二嗪磷、甲基嘧啶磷、對(duì)硫磷、氯吡硫磷(毒死蜱)9種常見的有機(jī)磷農(nóng)藥，分別與營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基配制成1 g/L的液體選擇培養(yǎng)基，采用“1.2.3”復(fù)篩方法研究復(fù)篩獲得的菌株對(duì)9種有機(jī)磷農(nóng)藥的廣譜降解能力。

1.2.4.2菌種降解能力的遺傳穩(wěn)定性研究。對(duì)復(fù)篩獲得的菌種進(jìn)行傳代培養(yǎng)，采用“1.2.3”復(fù)篩方法分別測(cè)定初始菌株(F0)、第5代菌株(F5)和第10代菌株(F10)對(duì)氧化樂果的降解能力，確定菌種對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥降解能力的遺傳穩(wěn)定性。

1.2.5 有機(jī)磷農(nóng)藥降解菌的分類鑒定。

1.2.5.1菌落形態(tài)及顯微結(jié)構(gòu)觀察。將篩選獲得的有機(jī)磷農(nóng)藥高效降解菌涂布于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，觀察菌落形態(tài)。采用結(jié)晶紫對(duì)其細(xì)胞進(jìn)行染色，觀察菌種的顯微結(jié)構(gòu)。

1.2.5.2生理生化鑒定。根據(jù)菌落形態(tài)及顯微結(jié)構(gòu)鑒定的結(jié)果，按《常用細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[12]和《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[13]上的鑒定指標(biāo)對(duì)降解菌進(jìn)行生理生化鑒定。

1.2.5.3分子鑒定。采用16S rDNA的方法對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥高效降解菌進(jìn)行分子鑒定，設(shè)計(jì)的引物為5′-AGAGTTTATCTGCCG-3′和5′-GGTTACCTTGTTACGATT-3′。采用細(xì)菌基因組DNA快速抽提試劑盒提取降解菌基因組，并進(jìn)行PCR試驗(yàn)，PCR反應(yīng)條件為:94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性1 min，52 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物采用PCR產(chǎn)物純化試劑盒進(jìn)行純化，純化產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(1.4%瓊脂糖)驗(yàn)證，并送生工生物工程(上海)有限公司測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果與序列庫(kù)進(jìn)行比對(duì)并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1初篩結(jié)果通過對(duì)樣本中菌種的分離和純化，共獲得25株可在含有1 g/L氧化樂果的選擇培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的菌株，將其依次編號(hào)為JWDP-01～JWDP-25。再經(jīng)過生長(zhǎng)繁殖能力及水解圈大小的測(cè)定，發(fā)現(xiàn)JWDP-05、JWDP-09、JWDP-10、JWDP-16、JWDP-24 5株菌對(duì)氧化樂果的耐藥性較強(qiáng)，在含藥的選擇培養(yǎng)基上可產(chǎn)生較大的水解圈，同時(shí)OD600值也明顯大于其他菌株(表1)，表明其生長(zhǎng)繁殖能力較高。因此，選用該5株菌作為復(fù)篩的出發(fā)菌株，測(cè)定其對(duì)氧化樂果的降解能力。

2.2復(fù)篩結(jié)果由圖2可知，與對(duì)照組相比，初篩分離到的JWDP-05、JWDP-09、JWDP-10、JWDP-16、JWDP-24 5株菌對(duì)氧化樂果的降解能力有大幅提高，表明其對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥均有一定的降解作用，其中以JWDP-09和JWDP-16最突出，因此，選用JWDP-09和JWDP-16作為進(jìn)一步研究的菌種，對(duì)菌株的有機(jī)磷農(nóng)藥降解特性進(jìn)行研究。

2.3菌種有機(jī)磷農(nóng)藥降解特性的研究結(jié)果

2.3.1廣譜降解能力。由表2可知，JWDP-16菌株對(duì)9種不同的有機(jī)磷農(nóng)藥均有良好的降解作用，降解能力表現(xiàn)為更好的廣譜性，而JWDP-09菌株對(duì)敵敵畏、甲基嘧啶磷和對(duì)硫磷幾乎無降解作用，對(duì)其他幾種有機(jī)磷農(nóng)藥的降解能力也普遍弱于JWDP-16菌株。

表1　初篩結(jié)果

圖2　復(fù)篩結(jié)果

有機(jī)磷農(nóng)藥種類校正農(nóng)藥降解率*∥%JWDP-09JWDP-16甲胺磷40.0233.95水胺硫磷31.1340.21甲拌磷12.8836.46敵敵畏3.4521.63敵百蟲10.5618.77二嗪磷27.9861.09甲基嘧啶磷0.2627.45對(duì)硫磷1.4538.04氯吡硫磷(毒死蜱)50.6746.67

注：*校正農(nóng)藥降解率=(處理組農(nóng)藥降解率-對(duì)照組農(nóng)藥降解率)/(1-對(duì)照組農(nóng)藥降解率)×100%。

2.3.2降解能力的遺傳穩(wěn)定性。由表3可知，JWDP-09和JWDP-16 2株菌分別經(jīng)過5代次和10代次的傳代培養(yǎng)后，對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥的降解能力均表現(xiàn)出良好的遺傳穩(wěn)定性。綜合該2株菌對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥的廣譜降解能力與遺傳穩(wěn)定性，確定JWDP-16菌株為進(jìn)一步研究發(fā)酵及生產(chǎn)的出發(fā)菌株，并對(duì)其進(jìn)行分類鑒定。

表3　 有機(jī)磷農(nóng)藥降解能力的遺傳穩(wěn)定性

2.4降解菌JWDP-16的分類鑒定結(jié)果

2.4.1 菌落形態(tài)及顯微結(jié)構(gòu)的觀察。結(jié)果表明，在營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h后，JWDP-16菌落直徑達(dá)到0.5～0.8 cm，乳白色，不透明，有臍狀突出，迎光觀察呈白蠟狀，邊緣不整齊，有褶皺。顯微結(jié)構(gòu)觀察顯示：經(jīng)過結(jié)晶紫染色后，JWDP-16為長(zhǎng)桿狀，長(zhǎng)2.5～3.5 μm，寬0.8～0.9 μm，以成對(duì)或鏈狀排列，有明顯的橢圓形芽孢，芽孢中生或次端生，無莢膜。根據(jù)觀察結(jié)果初步確定該菌種為芽孢桿菌類菌株。

2.4.2 生理生化鑒定結(jié)果。根據(jù)生理生化鑒定結(jié)果(表4)，對(duì)比細(xì)菌鑒定手冊(cè)上的指標(biāo)，初步判斷JWDP-16為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)。

表4　JWDP-16菌株生理生化試驗(yàn)鑒定結(jié)果

注：“+”表示陽(yáng)性反應(yīng);“-”表示陰性反應(yīng)。

2.4.3 分子鑒定結(jié)果。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，獲得1 400～1 600 bp長(zhǎng)度的基因序列(圖3)。將PCR產(chǎn)物純化后進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果表明該基因序列的長(zhǎng)度為1 533 bp。將序列在NCBI上進(jìn)行比對(duì)，證實(shí)JWDP-16菌株為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)，并構(gòu)建了相應(yīng)的發(fā)育樹(圖4)。

注：M. DNA Marker; 1、2. JWDP-16菌株。圖3　 JWDP-16菌株的16S rDNA電泳圖譜

圖4　 JWDP-16菌株系統(tǒng)發(fā)育樹

3 結(jié)論與討論

該研究表明，在農(nóng)藥廠、果園、蔬菜地等經(jīng)常接觸有機(jī)磷農(nóng)藥的地區(qū)采集到56份樣本，從中篩選到25株農(nóng)藥降解菌，其中JWDP-16菌株對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥氧化樂果的降解能力最強(qiáng)，培養(yǎng)72 h的最高降解率達(dá)到59.80%。通過對(duì)JWDP-16菌株降解特性的研究表明，該菌對(duì)甲胺磷、水胺硫磷、甲拌磷等9種有機(jī)磷農(nóng)藥具有良好的廣譜降解能力。同時(shí)傳代試驗(yàn)表明，第5代、第10代與初始菌株間的降解能力無明顯差異，表現(xiàn)出良好的遺傳穩(wěn)定性。經(jīng)過多步鑒定，確定JWDP-16菌株為枯草芽孢桿菌?？莶菅挎邨U菌具有生長(zhǎng)繁殖能力強(qiáng)、易于工業(yè)化生產(chǎn)、抗逆性強(qiáng)、易于在土壤中生存、對(duì)人畜及環(huán)境無害等特點(diǎn)，一直以來是微生物領(lǐng)域研究和應(yīng)用的重點(diǎn)。

由于微生物在生長(zhǎng)繁殖能力方面的優(yōu)勢(shì)，使得微生物降解農(nóng)藥技術(shù)成為解決農(nóng)藥降解問題的關(guān)鍵手段[15]。段海明[16]研究表明從有機(jī)磷農(nóng)藥及土壤樣本中分離到的3株蠟狀芽孢桿菌(Bacilluscereus)對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥甲基對(duì)硫磷、毒死蜱和三唑磷均具有良好的降解效果；楊慧[17]從有機(jī)磷農(nóng)藥生產(chǎn)車間土壤中分離到2株對(duì)氧化樂果具有降解能力的菌株，一株為假單胞菌屬(Pseudomonassp.)，另一株為氣球菌屬(Aerococcussp.)?？梢姡谟袡C(jī)磷農(nóng)藥污染嚴(yán)重的區(qū)域仍有大量微生物存在，這些微生物主要以分解代謝有機(jī)磷農(nóng)藥獲得相應(yīng)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和能量供其生長(zhǎng)繁殖，從而達(dá)到降解農(nóng)藥的目的。目前，農(nóng)藥降解菌主要有2種應(yīng)用方式：一是采用固定化技術(shù)，該技術(shù)可以維持較高的生物活性和酶活性[18]。趙仁邦等[19]研究了草酸青霉ZHJ6固定化后對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥甲胺磷的降解作用，結(jié)果表明降解率從原來的60%提高到70%。二是制成性質(zhì)穩(wěn)定的微生物菌劑，該方法主要是將微生物菌體與惰性載體進(jìn)行混合造粒。王連祥等[20]利用枯草芽孢桿菌制成的復(fù)合微生物菌劑研究對(duì)農(nóng)藥的降解作用，結(jié)果表明該微生物菌劑對(duì)土壤使用3 d后，農(nóng)藥降解率最高達(dá)90%以上。同時(shí)將可降解農(nóng)藥的微生物菌種與能解磷解鉀、固氮等作用的土壤功能性菌種進(jìn)行結(jié)合，制成具有多種功能的復(fù)合微生物菌劑，也是農(nóng)用微生物菌劑開發(fā)的一個(gè)重要研究方向。該研究通過篩選對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥具有高效降解能力的微生物菌種，獲得1株可高效降解有機(jī)磷農(nóng)藥的菌株JWDP-16，并確定其為枯草芽孢桿菌，為微生物菌劑開發(fā)提供了材料。

參考文獻(xiàn)

[1] RAGNARSDOTTIR K V.Environment fate and toxicology of organophosphate pesticides[J].J Geolog Soc,2000,157:859-876.

[2] 劉維屏.農(nóng)藥環(huán)境化學(xué)[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2006.

[3] 林玉鎖,龔瑞忠,朱忠林.農(nóng)藥與生態(tài)環(huán)境保護(hù)[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2000.

[4] 李欽云,趙玲玲.有機(jī)磷農(nóng)藥對(duì)食品的污染及防治[J].工業(yè)衛(wèi)生與職業(yè)病,2005,31(4):260-263.

[5] 鐘寧,曾清如,姜潔凌，等.有機(jī)磷農(nóng)藥的降解及其研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代農(nóng)藥,2005,4(6):1-5.

[6] 金志剛,張彤,朱懷蘭.污染物生物降解[M].上海:華東理工大學(xué)出版社,1997： 213-214.

[7] 周斌,方萍,張亞雷，等.有機(jī)磷農(nóng)藥生物降解技術(shù)研究進(jìn)展[J].化工環(huán)保,2005,25(5):353-354.

[8] 王永杰,李順鵬,沈標(biāo).有機(jī)磷農(nóng)藥廣譜活性降解菌的分離及其生理性研究[J].南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),1999,22(2):42-45.

[9] 錢存錄,黃儀秀.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教程[M].北京:北京大學(xué)出版社,1997.

[10] 中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部.土壤檢測(cè) 第1部分:土壤樣品的采集、處理和貯存：NY/T 1121.1-2006[S].北京:中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社,2006.

[11] 李志瑞.有機(jī)磷農(nóng)藥降解菌的分離篩選及其降解性能的初步研究[D].西安:西北大學(xué),2008.

[12] 沈萍,范秀容,李廣武.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)[M].北京:高等教育出版社,1996:1-214.

[13] 李秀珠,蔡妙英.常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)[M].北京：科學(xué)出版社，2001.

[14] MULBRY W W,KEARNEY P C.Degradation of pesticides by microorganisms and the potential for genetic manipulation[J].Crop Prot,1991,10:334-346.

[15] 朱福興,王沫,李建洪.降解農(nóng)藥的微生物[J].微生物學(xué)通報(bào),2004,31(5):120-123.

[16] 段海明.毒死蜱降解細(xì)菌的篩選、降解特性及其固定化研究[D].泰安:山東農(nóng)業(yè)大學(xué),2011.

[17] 楊慧.有機(jī)磷農(nóng)藥降解菌的分離、鑒定及固定化研究[D].哈爾濱:黑龍江大學(xué),2008.

[18] 吳曉磊,劉建廣,黃霞，等.海藻酸鈉和聚乙烯醇作為固定化微生物包埋劑的研究[J].環(huán)境科學(xué),1992,14(2):18-31.

[19] 趙仁邦,靳存華,劉衛(wèi)華.草酸青霉ZHJ6固定化后對(duì)甲胺磷農(nóng)藥降解的影響[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào),2012,28(26):247-251.

[20] 王連祥,閆桑,袁方曜，等.不同微生物菌劑降解土殘農(nóng)藥的研究[J].山東農(nóng)業(yè)科學(xué),2010(4):75-78.

Screening and Identification of Microorganisms with High Performance of Organophosphorus Pesticides Degrading

ZHANG Liu-liu1,2, XIA Sen-yu2, DING Ya-xin3et al (1. Jiangsu Institute of Microbiology Co., Ltd, Wuxi, Jiangsu 214000; 2. Jiangsu Nake Biological Engineering Co., Ltd, Xuyi, Jiangsu 211700; 3. Binghu District Bureau of Agriculture and Forestry of Wuxi City, Wuxi, Jiangsu 214000)

Abstract[Objective] To screen out microorganisms with high performance of organophosphorus pesticides degrading. [Method] We collected samples from rich area of organophosphorus pesticides, isolated and identified microorganisms with high performance of organophosphorus pesticides degrading, and studied the strains’ degradation characteristics. [Result] After screening of strains from 56 samples which were collected from soil and water seriously polluted by organophosphorus pesticides, a strain JWDP-16 with high degrading ability was obtained. The stain JWDP-16 had the highest degradation rate of 59.80% to omethoate. Degradation characteristics showed that the strain JWDP-16 had broad spectrum degradation ability for other organophosphorus pesticides, and also had genetic stability. The strain JWDP-16 was identified asBacillussubtilis. [Conclusion] The strain JWDP-16 has high degradation ability of organophosphorus pesticides and is worth further studying.

Key wordsOrganophosphorus pesticides; Microbial degradation; Screening; Strain identification

收稿日期2015-11-25

作者簡(jiǎn)介張六六(1973-)，男，江蘇泗洪人，高級(jí)工程師，從事農(nóng)業(yè)微生物研究。

基金項(xiàng)目江蘇省無錫市農(nóng)業(yè)科技支撐-生物農(nóng)業(yè)技術(shù)專項(xiàng)(309058-916018)。

中圖分類號(hào)S 482

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A

文章編號(hào)0517-6611(2015)36-212-04