烏梅丸對結腸炎大鼠δ阿片受體、β-抑制蛋白1、Bcl-2表達的影響

張麗娟1陳小艷2范恒1#段雪云3

華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬協(xié)和醫(yī)院中西醫(yī)結合科1(430022)

湖北省襄陽市中心醫(yī)院(北區(qū))消化科2湖北中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院藥劑科3

*基金項目：國家自然科學基金(30772878，81072944)

背景：潰瘍性結腸炎(UC)是慢性非特異性腸道炎癥性疾病，發(fā)病機制尚未明確，腸黏膜免疫功能紊亂可能起有關鍵作用。目的：探討烏梅丸對結腸炎模型大鼠δ阿片受體(DOR)、β-抑制蛋白1(β-arrestin1)、Bcl-2表達的影響。方法：56只Sprague-Dawley大鼠隨機分為模型組、烏梅丸組、美沙拉秦組和空白組，模型組、烏梅丸組和美沙拉秦組采用5% TNBS和50%乙醇灌腸誘導結腸炎。造模成功后，烏梅丸組、美沙拉秦組分別予烏梅丸藥液和美沙拉秦懸濁液灌胃，模型組和空白組予0.9% NaCl溶液灌胃，連續(xù)15 d，第16 d處死大鼠，取結腸標本。分別采用免疫組化法和real-time PCR檢測結腸組織DOR、β-arrestin1、Bcl-2蛋白和mRNA表達。結果：烏梅丸能明顯改善模型大鼠的結腸炎癥損傷。模型組結腸組織DOR、β-arrestin1、Bcl-2蛋白和mRNA表達水平較空白組顯著升高(P<0.05)；烏梅丸組和美沙拉秦組DOR、β-arrestin1、Bcl-2蛋白和mRNA表達水平較模型組顯著降低(P<0.05)，但兩組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結論：DOR-β-arrestin1-Bcl-2信號轉導通路參與了UC發(fā)病過程，烏梅丸可能通過干預該通路發(fā)揮對UC的治療效應。

關鍵詞結腸炎, 潰瘍性；受體, 阿片樣, δ；抑制蛋白；基因，bcl-2；烏梅丸

潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis, UC)是慢性非特異性腸道炎癥性疾病，發(fā)病機制尚未明確。目前細胞因子介導的諸多信號轉導通路在UC發(fā)病中的作用備受關注。炎性細胞因子誘導T淋巴細胞在腸道內大量聚集，導致腸黏膜免疫功能紊亂，此為UC發(fā)病過程中的關鍵環(huán)節(jié)[1-3]。Itoh等[4]對克羅恩病(Crohn’s disease, CD)患者的研究發(fā)現(xiàn)，抗凋亡蛋白Bcl-2與促凋亡蛋白Bax比例失衡可導致腸黏膜T細胞凋亡缺陷，可能與腸道慢性炎癥的發(fā)生有關。β-抑制蛋白1(β-arrestin1)作為細胞內信號轉導分子，可將δ阿片受體(δ-opioid receptor, DOR)刺激信號轉運至細胞核，促進Bcl-2基因轉錄，使CD4+T細胞凋亡抵抗增加，誘導自身免疫性疾病發(fā)生[5-6]。目前，臨床治療炎癥性腸病(IBD)以5-氨基水楊酸類、糖皮質激素、免疫抑制劑以及生物制劑為主。有研究[7]表明烏梅丸治療UC的療效與5-氨基水楊酸相當。本研究通過探討烏梅丸對結腸炎模型大鼠結腸組織DOR、β-arrestin1、Bcl-2表達的影響，分析烏梅丸治療UC的潛在分子機制。

材料與方法

一、實驗動物和主要試劑

健康雄性清潔級Sprague-Dawley(SD)大鼠56只，8周齡，體質量200~250 g，由華中科技大學同濟醫(yī)學院動物中心提供，SPF級環(huán)境下飼養(yǎng)。2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)購自Sigma公司；烏梅丸藥液組方中各味生藥購自武漢協(xié)和醫(yī)院；美沙拉秦購自Ethypharm公司；兔抗大鼠DOR多克隆抗體購自Millipore公司，兔抗大鼠β-arrestin1單克隆抗體購自CST公司，兔抗大鼠Bcl-2多克隆抗體購自武漢博士德生物工程有限公司，兔/鼠通用型免疫組化試劑盒購自Takara公司；TRIzol?試劑、逆轉錄試劑盒購自Invitrogen公司，real-time PCR試劑盒購自Toyoko公司。

二、方法

1. 模型制備和分組：56只SD大鼠隨機分為模型組、烏梅丸組、美沙拉秦組和空白組，每組14只，禁食不禁水，24 h后采用10%水合氯醛(0.3 mL/100 g)腹腔注射麻醉。模型組、烏梅丸組和美沙拉秦組采用5% TNBS 0.6 mL+50%乙醇0.25 mL灌腸誘導結腸炎，具體步驟參照Morris等[8]的研究，空白組給予等體積0.9% NaCl溶液。因造模過程中有大鼠死亡，各組大鼠數(shù)量不均，故每組取10只大鼠用于后續(xù)實驗。造模成功后，烏梅丸組予烏梅丸藥液(0.51 g/mL)、美沙拉秦組予美沙拉秦懸濁液(0.5 g/L)、模型組和空白組予0.9% NaCl溶液空腹灌胃，3 mL/只，1次/d，連續(xù)15 d。第16 d禁食不禁水24 h后處死大鼠，采集距肛門8 cm病變明顯處結腸標本。

2. 組織病理學檢查：取大鼠結腸標本置于4%甲醛溶液中固定，常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片，行HE染色，觀察大鼠結腸黏膜組織病理學改變。

3. 免疫組化法檢測DOR、β-arrestin1、Bcl-2蛋白表達：采用兔/鼠通用型免疫組化試劑盒進行檢測。各組大鼠結腸標本石蠟包埋、切片、脫蠟、水化，微波高壓修復抗原，以3% H2O2阻斷內源性過氧化物酶，分別加入兔抗大鼠DOR多克隆抗體(1∶400)、兔抗大鼠β-arrestin1單克隆抗體(1∶200)、兔抗大鼠Bcl-2多克隆抗體(1∶500)，4 ℃過夜，加入聚合酶增強劑，室溫孵育30 min，加入酶標羊抗兔二抗，室溫孵育30 min，DAB顯色，蘇木精復染，常規(guī)脫水，中性樹膠封片，光學顯微鏡下觀察。采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件，分析目的蛋白免疫組化染色陽性物質累積光密度(IOD)值。

4. Real-time PCR檢測DOR、β-arrestin1、Bcl-2 mRNA表達：取各組大鼠結腸標本，以TRIzol?試劑提取總RNA，逆轉錄合成cDNA，具體步驟參照逆轉錄試劑盒說明書。采用Primer 6.0軟件設計DOR、β-arrestin1、Bcl-2、β-actin引物。DOR引物上游：5’-GCA TCT GGG TCT TGG CTT CA-3’，下游：5’-GCG AAG AGG AAC ACG CAG AT-3’；β-arrestin1引物上游：5’-GCT GTG GAA CTG CCC TTT ACC-3’，下游：5’-CCA TCA TCC TCT TCG TCC TTG-3’；Bcl-2引物上游：5’-TTT GAT TTC TCC TGG CTG TCT-3’，下游：5’-CTG ATT TGA CCA TTT GCC TG-3’；內參β-actin引物上游：5’-CGT TGA CAT CCG TAA AGA CCT C-3’，下游：5’-TAG GAG CCA GGG CAG TAA TCT-3’。上述引物均由上海英駿生物技術有限公司合成。按試劑盒說明書進行操作，行real-time PCR擴增。反應條件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個循環(huán)，4 ℃終止反應。采用2-△△Ct法計算目的基因相對表達量。

三、統(tǒng)計學分析

結果

一、結腸組織病理學改變

空白組結腸黏膜組織結構完整，腺體排列整齊；模型組結腸黏膜組織腺體排列紊亂，杯狀細胞減少，黏膜層和固有層可見彌漫性淋巴細胞、中性粒細胞以及漿細胞浸潤；烏梅丸組和美沙拉秦組結腸黏膜組織結構完整，與模型組相比，黏膜層和固有層炎性細胞浸潤減輕，杯狀細胞增多，腺體排列較整齊(圖1)。

A：空白組；B：模型組；C：烏梅丸組；D：美沙拉秦組

二、結腸組織DOR、β-arrestin1、Bcl-2蛋白表達

DOR、β-arrestin1、Bcl-2免疫組化染色陽性物質定位于細胞質，呈棕色。與空白組相比，模型組結腸組織DOR、β-arrestin1和Bcl-2蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)。與模型組相比，烏梅丸組和美沙拉秦組結腸組織DOR、β-arrestin1和Bcl-2蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)，但兩組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(表1，圖2-4)。

組 別例數(shù)DORβ-arrestin1Bcl-2空白組1050.73±2.2823.74±3.4724.79±3.95模型組10129.19±5.30a59.98±5.75a51.03±7.68a烏梅丸組1051.23±3.45b25.69±6.51b25.93±3.92b美沙拉秦組1056.89±8.62b24.53±0.47b31.69±4.35b

a與空白組比較，P<0.05；b與模型組比較，P<0.05

A：空白組；B：模型組；C：烏梅丸組；D：美沙拉秦組

圖2各組大鼠結腸組織DOR蛋白表達(免疫組化ABC法，×400)

A：空白組；B：模型組；C：烏梅丸組；D：美沙拉秦組

圖3各組大鼠結腸組織β-arrestin1蛋白表達(免疫組化ABC法，×400)

A：空白組；B：模型組；C：烏梅丸組；D：美沙拉秦組

圖4各組大鼠結腸組織Bcl-2蛋白表達(免疫組化ABC法，×400)

三、結腸組織DOR、β-arrestin1、Bcl-2 mRNA表達

與空白組相比，模型組結腸組織DOR、β-arrestin1和Bcl-2 mRNA表達水平顯著升高(P<0.05)。與模型組相比，烏梅丸組和美沙拉秦組結腸組織DOR、β-arrestin1和Bcl-2 mRNA表達水平顯著降低(P<0.05)，但兩組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(表2)。

組 別例數(shù)DORβ-arrestin1Bcl-2空白組101.11±0.191.12±0.200.99±0.04模型組109.92±2.40a9.96±2.39a2.03±0.44a烏梅丸組103.81±0.66b3.80±0.67b1.21±0.11b美沙拉秦組104.29±1.32b4.30±1.31b1.11±0.16b

a與空白組比較，P<0.05；b與模型組比較，P<0.05

討論

IBD患者腸黏膜T淋巴細胞凋亡調控缺陷導致細胞凋亡抵抗增加，可能是IBD發(fā)病機制的中心環(huán)節(jié)[4,9-11]。細胞凋亡由多種細胞內、外信號分子共同調節(jié)，其中抗凋亡蛋白Bcl-2與促凋亡蛋白Bax比例平衡是調節(jié)CD4+T細胞凋亡的重要途徑。研究[12-13]發(fā)現(xiàn)，與Bcl-2-/-小鼠相比，Bcl-2轉基因小鼠的CD4+T細胞生存期明顯延長。本研究結果顯示，模型組大鼠結腸組織Bcl-2蛋白和mRNA表達水平較空白組顯著升高，提示Bcl-2在UC發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用，可能與其調節(jié)CD4+T細胞凋亡有關。Shi等[14]的研究以β-arrestin1 siRNA干擾Jurkat細胞，發(fā)現(xiàn)Bcl-2蛋白和mRNA表達下調，推測β-arrestin1可能是調節(jié)Bcl-2表達的上游信號分子，兩者共同調控CD4+T細胞生理功能。

研究[15-16]指出，β-arrestin1可介導G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)的生物信號傳遞，從而調節(jié)細胞凋亡。Pol等[17]的研究指出，β-arrestin1激活后可將DOR轉運至細胞核，聚集于p27和c-fos基因啟動子序列區(qū)域，促使Bcl-2啟動子轉錄活性增強。該團隊進一步的研究發(fā)現(xiàn)，結腸炎模型小鼠腸黏膜DOR mRNA和蛋白表達顯著增加，推測可能機制為白細胞介素-1(IL-1)與腸道神經(jīng)源性核轉錄因子核因子-κB(NF-κB)位點結合，促進DOR基因轉錄和翻譯。

本研究結果表明，模型組大鼠結腸組織DOR、β-arrestin1、Bcl-2蛋白和mRNA表達水平均較空白組顯著升高，其可能機制為：β-arrestin1將DOR膜受體信號轉運至細胞核，促進抗凋亡蛋白Bcl-2表達，從而抑制炎癥受損腸黏膜CD4+T細胞凋亡，使CD4+T細胞在腸黏膜內持續(xù)過度聚集，最終導致腸道炎癥慢性反復發(fā)作。由此推測，DOR-β-arrestin1-Bcl-2信號轉導通路在UC發(fā)病過程中起重要作用。

烏梅丸組方由烏梅、細辛、干姜、黃連、黃柏、當歸、附子、蜀椒、桂枝、人參10味藥組成?？v觀全方，集酸苦甘辛于一體，辛開苦降，寒熱并用，溫清斂補，攻補兼施，藥性剛柔相濟，有利于臟腑氣血陰陽恢復，促進陰平陽秘。UC屬于中醫(yī)“大瘕瀉”范疇，是以脾胃虛弱為本、濕熱內蘊為標的本虛標實病癥，急性期主要以標實為主，通過辨證論治，烏梅丸功效與UC病因病機一致，因此以烏梅丸治療UC能取得較好的臨床療效。

在現(xiàn)代醫(yī)學中，諸多研究[18-21]探討了烏梅丸用于治療UC的分子機制，發(fā)現(xiàn)烏梅丸可上調結腸炎模型大鼠結腸組織中的抗炎細胞因子IL-10表達，下調促炎細胞因子腫瘤壞死因子(TNF)-α、IL-6、IL-8表達，抑制NF-κBp65活性。本研究結果表明，烏梅丸能改善結腸炎模型大鼠的結腸黏膜組織病理學改變，顯著降低結腸組織DOR、β-arrestin1、Bcl-2蛋白和mRNA表達，與美沙拉秦療效相當，推測其可能通過干預DOR-β-arrestin1-Bcl-2信號轉導通路，發(fā)揮對UC的治療效應。

綜上所述，本研究結果顯示，DOR-β-arrestin1-Bcl-2信號轉導通路參與了UC發(fā)病過程；烏梅丸對UC具有一定治療作用，其可能通過干預DOR-β-arrestin1-Bcl-2信號轉導通路，使結腸組織CD4+T細胞的凋亡敏感性增加，炎性細胞因子分泌減少，恢復腸道免疫系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)，從而緩解UC癥狀。上述結果為烏梅丸治療UC的分子機制研究開辟了新的途徑。

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(2015-04-12收稿；2015-06-18修回)

Effects of Wumeiwan on δ-Opioid Receptor, β-Arrestin1 and Bcl-2 Expressions in Rats with ColitisZHANGLijuan1,CHENXiaoyan2,FANHeng1,DUANXueyun3.1DepartmentofIntegratedChineseandWesternMedicine,UnionHospitalAffiliatedtoTongjiMedicalCollegeofHuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan(430022);2DepartmentofGastroenterology,XiangyangCentralHospital,Xiangyang,HubeiProvince;3DepartmentofPharmacy,theAffiliatedHospitalofHubeiUniversityofChineseMedicine,Wuhan

Correspondence to: FAN Heng, Email: fanheng009@aliyun.com

Background: Ulcerative colitis (UC) is a chronic and nonspecific intestinal inflammatory disease and its pathogenic mechanism has not yet been clarified. Intestinal mucosal immune function disorder may play a key role in the pathogenesis of UC. Aims: To investigate the effects of Wumeiwan on expressions of δ-opioid receptor (DOR), β-arrestin1 and Bcl-2 in rats with colitis. Methods: Fifty-six Sprague-Dawley rats were randomly divided into model group, Wumeiwan group, mesalazine group and blank group. Rats in model group, Wumeiwan group and mesalazine group were administered intrarectally with 5% TNBS and 50% ethanol to induce experimental colitis. After colitis models were established, rats in Wumeiwan group and mesalazine group were administered intragastrically with Wumeiwan and mesalazine suspension, respectively, and rats in model group and blank group were given intragastrically with 0.9% NaCl solution, all for 15 days. On day 16, all the rats were sacrificed and colon samples were obtained. Protein and mRNA expressions of DOR, β-arrestin1 and Bcl-2 in colonic tissue were determined by immunohistochemistry and real-time PCR, respectively. Results: The inflammatory injury in colonic tissue of rats with experimental colitis was significantly attenuated when treated with Wumeiwan, Protein and mRNA expressions of DOR, β-arrestin1 and Bcl-2 in colonic tissue of model group were significantly higher than those of blank group (P<0.05). Protein and mRNA expressions of DOR, β-arrestin1 and Bcl-2 in colonic tissue of Wumeiwan group and mesalazine group were significantly lower than those of model group (P<0.05), however, no significant differences were found between the two groups (P>0.05). Conclusions: DOR-β-arrestin1-Bcl-2 signal transduction pathway may play a central role in the pathogenesis of UC. Intervening this signaling pathway may be one of the mechanisms of attenuating UC by Wumeiwan.

Key wordsColitis, Ulcerative;Receptors, Opioid, delta;Arrestin;Genes, bcl-2;WUMEI PILL

通信作者#本文, Email: fanheng009@aliyun.com

DOI:10.3969/j.issn.1008-7125.2015.08.005