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        Faecalibacterium prausnitzii基因組DNA上調(diào)外周血單個(gè)核細(xì)胞Th1型免疫應(yīng)答增強(qiáng)對(duì)人結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞的殺傷活性

        2015-02-23 03:06:34張濤,張敏,湯愛(ài)榮
        胃腸病學(xué) 2015年8期
        關(guān)鍵詞:結(jié)腸癌

        Faecalibacteriumprausnitzii基因組DNA上調(diào)外周血單個(gè)核細(xì)胞Th1型免疫應(yīng)答增強(qiáng)對(duì)人結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞的殺傷活性

        張濤1#張敏1湯愛(ài)榮1曹萍2謝麗娟1于成功1,3&

        南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院消化科1(210008)

        南京醫(yī)科大學(xué)鼓樓臨床醫(yī)學(xué)院消化科2南京鼓樓醫(yī)院集團(tuán)儀征醫(yī)院消化科3

        *基金項(xiàng)目:國(guó)家自然科學(xué)基金(81470819)

        #Email: zhangtao203@126.com

        背景:Faecalibacteriumprausnitzii(Fp)是一種具有抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用的腸道共生菌,研究發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌患者腸道內(nèi)Fp數(shù)量明顯減少,可能與腫瘤發(fā)生有關(guān)。目的:探討Fp及其基因組DNA(fDNA)干預(yù)對(duì)外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)對(duì)人結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞殺傷活性的影響及其免疫學(xué)機(jī)制。方法:將Fp、fDNA或酶解fDNA(d-fDNA)與分離自健康成人的PBMCs體外共培養(yǎng),MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PBMCs對(duì)LoVo細(xì)胞的殺傷活性,ELISA法檢測(cè)PBMCs培養(yǎng)上清液中的Th1、Th2型細(xì)胞因子干擾素-γ(IFN-γ)、白細(xì)胞介素-4(IL-4)含量,real-time PCR檢測(cè)PBMCs Th1、Th2特異性轉(zhuǎn)錄因子T-bet、GATA3表達(dá)。結(jié)果:與未予干預(yù)的PBMCs相比,fDNA干預(yù)能顯著增強(qiáng)PBMCs對(duì)LoVo細(xì)胞的殺傷活性(P<0.05),同時(shí)促進(jìn)PBMCs的IFN-γ分泌和T-bet mRNA表達(dá)(P<0.05),抑制IL-4分泌和GATA3 mRNA表達(dá)(P<0.05)。Fp和d-fDNA均未顯示出上述作用。結(jié)論:fDNA能增強(qiáng)PBMCs對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞的殺傷活性,其機(jī)制可能與上調(diào)Th1型免疫應(yīng)答有關(guān)。

        關(guān)鍵詞Faecalibacterium prausnitzii;干擾素γ;白細(xì)胞介素4;Th1-Th2平衡;結(jié)腸腫瘤;LoVo細(xì)胞

        Colonic Neoplasms;LoVo Cells

        結(jié)直腸癌為常見(jiàn)消化系統(tǒng)惡性腫瘤,發(fā)病率和死亡率在我國(guó)呈上升趨勢(shì)。結(jié)直腸癌的病因尚未明確,近年來(lái),腸道細(xì)菌與結(jié)直腸癌發(fā)病的關(guān)系日益受到關(guān)注,部分學(xué)者認(rèn)為腸道細(xì)菌及其代謝產(chǎn)物通過(guò)多種機(jī)制參與了結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展[1]。

        在機(jī)體免疫系統(tǒng)中,干擾素-γ(IFN-γ)主要由Th1細(xì)胞分泌,主要介導(dǎo)細(xì)胞免疫;而白細(xì)胞介素-4(IL-4)主要由Th2細(xì)胞分泌,主要介導(dǎo)體液免疫。有研究[2]表明,結(jié)直腸癌患者以Th2型免疫應(yīng)答占優(yōu)勢(shì),Th1細(xì)胞功能減弱,提示Th1/Th2失衡可能參與了結(jié)直腸癌的發(fā)生和進(jìn)展。

        對(duì)結(jié)直腸癌患者腸道菌群的定量分析顯示,患者腸道內(nèi)產(chǎn)丁酸細(xì)菌Faecalibacteriumprausnitzii(F.prausnitzii, Fp)和直腸真桿菌(Eubacteriumrectale)數(shù)量明顯減少,可能與腫瘤發(fā)生有關(guān)[3]。體內(nèi)外研究[4-5]顯示,F(xiàn)p及其培養(yǎng)上清液具有抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用。本研究以Fp及其基因組DNA(fDNA)干預(yù)人外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs),觀察其對(duì)PBMCs對(duì)人結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞殺傷活性的影響以及PBMCs IFN-γ、IL-4分泌和Th1、Th2特異性轉(zhuǎn)錄因子T-bet、GATA3的表達(dá)變化,旨在為Fp用于結(jié)直腸癌的治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

        材料與方法

        一、標(biāo)本來(lái)源

        隨機(jī)收集2014年6月-2014年10月南京市鼓樓醫(yī)院體檢中心健康體檢者20名,其中男10名,女10名,年齡21~53歲,平均(32.3±12.0)歲。入選者遵循自愿原則完成實(shí)驗(yàn)。

        二、菌株、細(xì)胞株和主要試劑

        Fp菌種(ATCC 27766,美國(guó)模式菌種保藏中心),人結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞(南京市鼓樓醫(yī)院消化科實(shí)驗(yàn)室保存),細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、DNAse Ⅰ、引物合成(上海捷瑞生物工程有限公司),淋巴細(xì)胞分離液(天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司),MTT、DMSO、植物血凝素(PHA)[生工生物工程(上海)股份有限公司],人IFN-γ、IL-4 ELISA試劑盒(Abcam plc.),RNAiso Plus總RNA提取試劑、PrimeScriptTM逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Perfect Real Time)、SYBR?Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)(TAKARA BIO INC.)。

        三、方法

        1. Fp培養(yǎng):參照文獻(xiàn)方法配制培養(yǎng)基[5],將Fp置于厭氧箱(37 ℃, 97% CO2, 2% H2)內(nèi)培養(yǎng),根據(jù)600 nm處吸光度值(A值)結(jié)合平板菌落計(jì)數(shù)計(jì)算細(xì)菌濃度。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)末期菌液離心,收集細(xì)菌,以PBS重懸并調(diào)整濃度至1×109CFU/mL,-20 ℃冰箱保存。

        2. fDNA和酶解fDNA(d-fDNA)的制備:以細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取fDNA,經(jīng)紫外分光光度計(jì)測(cè)定A260/A280為1.8~1.9。DNAseⅠ 37 ℃水浴4 h以完全酶解細(xì)菌DNA,作為fDNA的對(duì)照。收集fDNA和d-fDNA,-20 ℃冰箱保存。

        3. PBMCs的分離和培養(yǎng):抽取20名健康成人外周血,F(xiàn)icoll密度梯度離心法分離 PBMCs,以RPMI 1640培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素)重懸并調(diào)整濃度至1×106/mL。

        4. MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PBMCs殺傷活性:以PBMCs為效應(yīng)細(xì)胞,以LoVo細(xì)胞為靶細(xì)胞。將源自10名健康成人的PBMCs以1×105/孔(0.1 mL)接種于24孔板,分別加入40 μL Fp(1×109CFU/mL)、fDNA(25 μg/mL)或d-fDNA(25 μg/mL)并補(bǔ)足完全培養(yǎng)基至1 mL,共培養(yǎng)24 h,以未予干預(yù)的PBMCs作為對(duì)照,離心,棄上清,以完全培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞沉淀。每組1×105個(gè)效應(yīng)細(xì)胞與2×103個(gè)靶細(xì)胞共培養(yǎng)于96孔板(效靶比50∶1),另設(shè)單獨(dú)培養(yǎng)的PBMCs和LoVo細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞對(duì)照組和靶細(xì)胞對(duì)照組,每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)72 h,棄上清,PBS重懸2次,加入MTT孵育4 h,棄上清,加入DMSO,以酶標(biāo)儀測(cè)定490 nm處A值。效應(yīng)細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的殺傷率={1-[(實(shí)驗(yàn)組A值-效應(yīng)細(xì)胞對(duì)照組A值)/靶細(xì)胞對(duì)照組A值]}×100%。

        5. ELISA法檢測(cè)PBMCs培養(yǎng)上清液IFN-γ、IL-4含量:將源自另10名健康成人的PBMCs以1×106/孔(1 mL)接種于24孔板,加入IFN誘生劑PHA(100 μg/mL)培養(yǎng)24 h,分別加入40 μL Fp(1×109CFU/mL)、fDNA(25 μg/mL)或d-fDNA(25 μg/mL),另設(shè)只加PHA的對(duì)照組,繼續(xù)培養(yǎng)24 h,離心,收集上清,-20 ℃冰箱保存。按相應(yīng)ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)操作,檢測(cè)IFN-γ、IL-4含量。

        6. Real-time PCR檢測(cè)PBMCs T-bet、GATA3 mRNA表達(dá):實(shí)驗(yàn)步驟5培養(yǎng)的各組細(xì)胞離心后收集細(xì)胞沉淀,以RNAiso Plus試劑提取總RNA,逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,行real-time PCR擴(kuò)增目的片段。引物序列:T-bet F 5’-TGA CAT GAT GAA AGG AAC AGA AAC A-3’, R 5’-CCC CAA CCA ACT ACT AAA CAG AGA A-3’; GATA3 F 5’-CCT CCT CTC TGC TCT TGG CTA C-3’, R 5’-AGA ATA AAA CGG GAC CAG GTT GTA A-3’; 內(nèi)參β-actin F 5’-GTT GCG TTA CAC CCT TTC TTG AC-3’, R 5’-CTC GGC CAC ATT GTG AAC TTT G-3’。PCR反應(yīng)體系:SYBR?Premix Ex TaqTM10 μL,上、下游引物各0.4 μL,ROX Reference Dye Ⅱ 0.4 μL,cDNA 2 μL,去離子水6.8 μL,共20 μL。反應(yīng)條件: 95 ℃ 30 s,1個(gè)循環(huán);95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s,40個(gè)循環(huán)。2-△△Ct法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。

        四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

        結(jié)果

        一、PBMCs對(duì)LoVo細(xì)胞的殺傷活性

        經(jīng)Fp、fDNA或d-fDNA干預(yù)24 h的PBMCs,以效靶比50∶1與LoVo細(xì)胞共培養(yǎng)72 h后,fDNA組PBMCs對(duì)LoVo細(xì)胞的殺傷率為(49.43±6.77)%,顯著高于未予干預(yù)PBMCs組的(26.50±6.72)%(P<0.05);Fp組和d-fDNA組PBMCs殺傷率分別為(35.73±1.97)%和(28.80±5.45)%,均低于fDNA組,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),兩組殺傷活性與未予干預(yù)PBMCs組相比均無(wú)明顯差異(P>0.05)(圖1)。

        *兩組間比較,P<0.05

        圖1Fp、fDNA和d-fDNA干預(yù)對(duì)PBMCs對(duì)LoVo細(xì)胞殺傷活性的影響

        二、PBMCs IFN-γ、IL-4分泌

        經(jīng)PHA刺激以及Fp、fDNA或d-fDNA干預(yù) 24 h 的PBMCs,fDNA組IFN-γ分泌量為(529.4±36.3) pg/mL,顯著高于Fp組[(288.6±31.0) pg/mL]、d-fDNA 組[(220.3±20.7) pg/mL]和對(duì)照組[(203.2±23.6) pg/mL](P<0.001);fDNA組IL-4分泌量為(14.35±2.10) pg/mL,顯著低于d-fDNA組[(29.57±4.92) pg/mL]和對(duì)照組[(30.91±3.35) pg/mL](P<0.05),與Fp組[(20.23±3.76) pg/mL]相比無(wú)明顯差異(P>0.05)。Fp組、d-fDNA組IFN-γ、IL-4分泌量與對(duì)照組相比差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖2)。

        三、PBMCs T-bet、GATA3 mRNA表達(dá)

        經(jīng)PHA刺激以及Fp、fDNA或d-fDNA干預(yù) 24 h 的PBMCs,fDNA組T-bet mRNA相對(duì)表達(dá)量為1.699±0.082,顯著高于d-fDNA組(1.066±0.201)和對(duì)照組(P<0.05),與Fp組(1.144±0.204)相比無(wú)明顯差異(P>0.05);fDNA組GATA3 mRNA相對(duì)表達(dá)量為(0.511±0.077),顯著低于d-fDNA組(1.066±0.101)和對(duì)照組(P<0.05),與Fp組(0.799±0.143)相比無(wú)明顯差異(P>0.05)。Fp組、d-fDNA組T-bet、GATA3 mRNA相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照組相比差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖3)。

        討論

        Fp是一種具有抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用的腸道共生菌,占健康成人腸道菌群總量的5%以上, 是腸道內(nèi)代謝最為活躍的細(xì)菌之一,對(duì)維持腸道健康具有重要作用[6]。研究[3,7]發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌患者腸腔內(nèi)和附著于腸黏膜的Fp數(shù)量較健康成人明顯減少,且癌組織Fp數(shù)量少于正常黏膜組織,提示Fp減少可能參與了結(jié)直腸癌的發(fā)生。

        兩組間比較,*P<0.05,***P<0.001

        兩組間比較,*P<0.05,**P<0.01

        Fp能分解糖類產(chǎn)生丁酸,是腸道內(nèi)主要的產(chǎn)丁酸細(xì)菌之一。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)丁酸具有抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用[8],據(jù)此推測(cè),F(xiàn)p可能通過(guò)產(chǎn)丁酸發(fā)揮抗癌作用。本課題組前期研究結(jié)果表明,F(xiàn)p與人結(jié)腸癌細(xì)胞共培養(yǎng)能直接抑制癌細(xì)胞增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡,本實(shí)驗(yàn)將Fp與PBMCs共培養(yǎng),卻發(fā)現(xiàn)其并不能提高PBMCs對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷活性,其原因可能為Fp具有促進(jìn)初始T細(xì)胞向調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg細(xì)胞)分化的作用[5],而Treg細(xì)胞是機(jī)體抗腫瘤免疫的負(fù)性調(diào)節(jié)因子,可促進(jìn)腫瘤免疫逃逸。此外,閔軍等[9]的研究發(fā)現(xiàn)丁酸誘導(dǎo)的未成熟樹(shù)突細(xì)胞可通過(guò)高表達(dá)吲哚胺2,3雙加氧酶、低表達(dá)IL-12等抑制T細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)機(jī)體免疫耐受。上述結(jié)果表明,F(xiàn)p雖然具有直接抗腫瘤作用,但在抗腫瘤免疫中可能起負(fù)性調(diào)節(jié)作用。

        一些細(xì)菌基因組DNA存在非甲基化胞嘧啶-磷酸-鳥(niǎo)嘌呤二核苷酸結(jié)構(gòu)(CpG序列),文獻(xiàn)報(bào)道CpG序列可通過(guò)調(diào)節(jié)機(jī)體免疫,如增強(qiáng)巨噬細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的吞噬作用、增加抗腫瘤細(xì)胞因子分泌等途徑發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng),一些人工合成的CpG寡脫氧核苷酸(ODN)已被作為有效佐劑用于免疫調(diào)節(jié)和腫瘤的免疫治療[10-11]。CpG序列根據(jù)結(jié)構(gòu)差異可分為CpG-A、CpG-B和CpG-C,三者可能通過(guò)不同路徑發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能[10]。Fp的基因組DNA同樣存在非甲基化CpG序列,但其結(jié)構(gòu)不明。目前研究顯示,免疫細(xì)胞表面的模式識(shí)別受體Toll樣受體9(TLR9)可特異性識(shí)別并結(jié)合細(xì)菌非甲基化CpG序列和人工合成的CpG序列,TLR9活化后可激活多種免疫細(xì)胞,導(dǎo)致有效的Th1型免疫應(yīng)答和抗腫瘤效應(yīng)[11]。本實(shí)驗(yàn)表明fDNA與PBMCs共培養(yǎng)能增強(qiáng)其對(duì)人結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞的殺傷活性,從而抑制腫瘤細(xì)胞增殖,結(jié)合上述研究結(jié)果,推測(cè)fDNA可能是通過(guò)激活TLR9,調(diào)節(jié)PBMCs向Th1亞群分化而發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)。

        在腫瘤免疫應(yīng)答中,活化的初始CD4+T細(xì)胞分化為不同T細(xì)胞亞群,發(fā)揮不同免疫調(diào)節(jié)作用:Th1型免疫應(yīng)答分泌IL-2或IFN-γ等細(xì)胞因子,促進(jìn)抗腫瘤免疫應(yīng)答,Th2型免疫應(yīng)答則通過(guò)分泌IL-4、IL-13等,促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)[12],Th1、Th2型細(xì)胞因子表達(dá)間接反映了相應(yīng)T細(xì)胞亞群的功能,IFN-γ和IL-4分別為典型的Th1和Th2型細(xì)胞因子[13]。T-bet為Th1特異性轉(zhuǎn)錄因子,通過(guò)作用于IFN-γ等基因位點(diǎn),促進(jìn)相應(yīng)基因轉(zhuǎn)錄,正向調(diào)控T細(xì)胞向Th1方向分化,而GATA3通過(guò)作用于IL-4等Th2型細(xì)胞因子基因位點(diǎn),正向調(diào)控T細(xì)胞向Th2方向分化,為Th2特異性轉(zhuǎn)錄因子[14]。有研究[2,15]表明結(jié)直腸癌患者存在Th1/Th2失衡,主要表現(xiàn)為Th2型免疫應(yīng)答上調(diào),Th1型免疫應(yīng)答下調(diào),Th1/Th2失衡與結(jié)直腸癌的發(fā)生、進(jìn)展、轉(zhuǎn)移和預(yù)后相關(guān),糾正Th1/Th2失衡可能為結(jié)直腸癌的治療提供了一個(gè)新途徑。本研究將Fp、fDNA和d-fDNA與源自健康成人的PBMCs共培養(yǎng),觀察了此種干預(yù)對(duì)PBMCs殺傷活性及其Th1/Th2分化、應(yīng)答的影響,發(fā)現(xiàn)fDNA能顯著增強(qiáng)PBMCs對(duì)LoVo細(xì)胞的殺傷活性,同時(shí)促進(jìn)IFN-γ分泌和T-bet mRNA表達(dá),抑制IL-4分泌和GATA3 mRNA表達(dá),F(xiàn)p和d-fDNA的作用則不明顯,表明Fp可通過(guò)其基因組DNA影響PBMCs的分化方向、糾正Th1/Th2失衡,從而發(fā)揮抗腫瘤作用。

        綜上所述,本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)fDNA能增強(qiáng)PBMCs對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞的殺傷活性,其機(jī)制可能與上調(diào)Th1型免疫應(yīng)答有關(guān)。以fDNA作為生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑為結(jié)直腸癌的治療研究提供了新的嘗試途徑,相關(guān)研究有待深入開(kāi)展。

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        ·論著·

        FaecalibacteriumprausnitziiGenomic DNA Enhances the Killing Activity of Peripheral Blood Mononuclear Cells against Human Colon Cancer LoVo Cells by Upregulating Th1 Immune ResponseZHANGTao1,ZHANGMin1,TANGAirong1,CAOPing2,XIELijuan1,YUChenggong1,3.1DepartmentofGastroenterology,theAffiliatedDrumTowerHospitalofNanjingUniversityMedicalSchool,Nanjing(210008);2DepartmentofGastroenterology,theDrumTowerClinicalMedicalCollegeofNanjingMedicalUniversity,Nanjing;3DepartmentofGastroenterology,YizhengHospital,DrumTowerHospitalGroupofNanjing,Nanjing

        Correspondence to: YU Chenggong, Email: chenggong_yu@nju.edu.cn

        Background:Faecalibacteriumprausnitzii(Fp) is a commensal intestinal bacterium that exhibits anti-inflammatory and immunomodulatory capacityinvivoandinvitro. It has been reported that Fp in intestinal lumen was reduced in patients with colorectal cancer, which might be a factor associated with cancer development. Aims: To investigate the effect and immunological mechanism of Fp and its genomic DNA (fDNA) on the killing activity of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) against human colon cancer LoVo cells. Methods: PBMCs derived from healthy adults were co-culturedinvitrowith Fp, fDNA, or the digested fDNA (d-fDNA), respectively. Killing activity of PBMCs against LoVo cells was measured by MTT assay; concentrations of interferon-gamma (INF-γ), a Th1-type cytokine and interleukin-4 (IL-4), a Th2-type cytokine in culture supernatant of PBMCs were determined by ELISA; and expressions of T-bet and GATA3, the transcription factors specific for Th1 and Th2 cells, were measured by real-time PCR. Results: Compared with the PBMCs not treated, fDNA could significantly enhance the killing activity of PBMCs against LoVo cells (P<0.05); meanwhile, it promoted IFN-γ secretion, up-regulated T-bet mRNA expression and inhibited IL-4 secretion and GATA3 mRNA expression in PBMCs (P<0.05). Similar effects were not observed in PBMCs treated with Fp and d-fDNA. Conclusions: fDNA enhances the killing activity of PBMCs against human colon cancer cells by up-regulating Th1 immune response.

        Key wordsFaecalibacterium prausnitzii;Interferon-gamma;Interleukin-4;Th1-Th2 Balance;

        通信作者&本文,Email: chenggongyu@nju.edu.cn

        DOI:10.3969/j.issn.1008-7125.2015.08.002

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