桑金鳳,張根葆,2,周淑艷

(皖南醫(yī)學(xué)院 1.病理生理學(xué)教研室;2.蛇毒研究室,安徽 蕪湖 241002)

·基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)·

尖吻蝮蛇毒PCA對(duì)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞的影響

桑金鳳1,張根葆1,2,周淑艷1

(皖南醫(yī)學(xué)院 1.病理生理學(xué)教研室;2.蛇毒研究室,安徽 蕪湖 241002)

目的：觀察皖南尖吻蝮蛇毒蛋白C激活劑(PCA)對(duì)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)的影響并分析其可能機(jī)制。方法：常規(guī)培養(yǎng)HUVEC，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化,用MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性。實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、LPS損傷組和PCA實(shí)驗(yàn)組。將HUVEC接種在96孔板內(nèi)加藥處理，對(duì)照組加入PBS緩沖液，LPS損傷組加入0.1 μg/ mL LPS，PCA實(shí)驗(yàn)組分別加入0.16、0.32、0.63、1.25、2.50、5.00、10.00、20.00、40.00 μg/ mL的 PCA溶液和0.16、0.32、0.63、1.25 μg/ mL的PCA與0.1 μg/ mL 的LPS的混合液。每個(gè)濃度設(shè)5個(gè)復(fù)孔，每孔加藥200 μL，作用12 h后進(jìn)行細(xì)胞活性測(cè)定并觀察細(xì)胞形態(tài)。結(jié)果：PCA濃度低于2.50 μg/ mL時(shí)對(duì)HUVEC活性和形態(tài)沒(méi)有明顯影響，但可減輕LPS引起的HUVEC活性抑制和形態(tài)改變。高于2.50 μg/ mL時(shí)PCA可抑制HUVEC的活性并引起其形態(tài)改變。結(jié)論：低濃度PCA在一定程度上可減輕LPS引起的HUVEC損傷。

蛇毒；PCA；HUVEC；細(xì)胞活性

【DOI】10.3969/j.issn.1002-0217.2015.05.001

蛇毒富含多種蛋白質(zhì)、多肽等活性物質(zhì)，大量資料顯示其具有抗凝、抗血栓及抗腫瘤等臨床應(yīng)用價(jià)值。PCA是一種抗血栓作用的蛇毒蛋白組分，在1986年由Klein等[1]從蛇毒中第一次分離純化得到，本實(shí)驗(yàn)室在2008年從皖南尖吻蝮蛇毒中也分離得到該組分，測(cè)得其分子量為18.5 ku，等電點(diǎn)為pl 4.9[2],查閱國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)關(guān)于其作用機(jī)制的報(bào)道并不多見(jiàn)。前期實(shí)驗(yàn)除證實(shí)PCA具有改善內(nèi)毒素、梗死等造成的大鼠心肌損傷，抑制大鼠微血栓形成[3]等作用外，還可引起大鼠血漿中EPCR、TM等血管內(nèi)皮細(xì)胞(VEC)分泌的活性物質(zhì)的改變[4]，因此，推測(cè)PCA可能是通過(guò)影響VEC的功能來(lái)發(fā)揮其抗血栓等作用。本實(shí)驗(yàn)欲在體外培養(yǎng)的HUVEC基礎(chǔ)上更直觀地觀察PCA對(duì)VEC的影響，為后續(xù)PCA抗凝血機(jī)制的研究和臨床應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 皖南尖吻蝮蛇毒PCA組分(由本實(shí)驗(yàn)室蛇毒研究室從皖南尖吻蝮蛇粗毒中分離得到的一種蛋白組分，其分子量為18.5 ku，等電點(diǎn)為pl 4.9)，PBS緩沖液、DMEM完全培養(yǎng)基(賽默飛世爾生物化學(xué)制品有限公司)，0.25%胰蛋白酶+0.02EDTA(上海吉諾生物科技有限公司),胎牛血清(杭州四季青公司)，5%CO2培養(yǎng)箱(Thermo)，倒置相差顯微鏡(OLYMPUS IX51)，內(nèi)毒素(LPS)，MTT、DMSO(Sigma)。

1.2 方法

1.2.1 HUVEC細(xì)胞培養(yǎng) HUVEC購(gòu)自南京凱基生物公司，培養(yǎng)液選取高糖DMEM培養(yǎng)基加含10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素溶液，置于37 ℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。用0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA對(duì)細(xì)胞進(jìn)行消化，按1∶2比例進(jìn)行傳代，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及生長(zhǎng)狀況，選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好、形態(tài)正常的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 在倒置顯微鏡下觀察藥物處理前后HUVEC形態(tài)的改變。

1.2.3 檢測(cè)HUVEC活性 待HUVEC鋪板率達(dá)80%，經(jīng)胰酶消化后用含10%胎牛血清的DEME懸浮HUVEC，在細(xì)胞計(jì)數(shù)儀下計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞濃度至3×104個(gè)/ mL，接種于一次性96孔板中，每孔200 μL。將96孔板放入CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)，棄去原培養(yǎng)液，對(duì)照組加入PBS緩沖溶液，LPS損傷組加入0.1 μg/ mL的LPS溶液，PCA實(shí)驗(yàn)組分別加入濃度為0.16、0.32、0.63、1.25、2.50、5.00、10.00、20.00、40.00 μg/ mL的PCA溶液和0.16、0.32、0.63、1.25 μg/ mL的PCA與0.1 μg/ mL的LPS的混合溶液，每個(gè)濃度組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，每孔200 μL。繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞12 h，于結(jié)束前4 h加入20 μL MTT(5 mg/ mL)，后吸凈細(xì)胞上液每孔加入150 μL DMSO，振蕩搖勻10 min，490 nm測(cè)定光密度(OD值)，計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率。生長(zhǎng)抑制率(IR)=(1-用藥組平均OD值/對(duì)照組OD值)×100%。

2 結(jié)果

2.1 PCA對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響

2.1.1 PCA對(duì)HUVEC形態(tài)的影響 正常HUVEC為橢圓形、多角形或短梭形，胞漿均勻，邊界清晰，呈鋪路石樣貼壁生長(zhǎng)。在0.16～1.25 μg/ mL間的PCA作用下HUVEC形態(tài)仍然為橢圓形、多角形或短梭形，邊界清楚，胞漿豐富，呈鋪路石樣排列。但濃度>2.50 μg/ mL的PCA則會(huì)使HUVEC形態(tài)發(fā)生改變，細(xì)胞體積增大，發(fā)出分枝或出芽樣改變，邊界模糊，胞漿內(nèi)出現(xiàn)顆粒樣改變，細(xì)胞排列不規(guī)則(見(jiàn)圖1)。

A:對(duì)照組,B:PCA(1.25 μg/ mL)組，C:PCA(40 μg/ mL)組

圖1 不同PCA濃度對(duì)HUVEC形態(tài)的影響(×200)

Fig 1 Different concentration of PCA on the morphology of HUVEC(×200)

2.1.2 PCA和LPS聯(lián)合作用對(duì)HUVEC形態(tài)的影響 0.1 μg/ mL的LPS使細(xì)胞呈明顯的梭形化，細(xì)胞體積縮小，邊界清晰，排列紊亂。將0.63～1.25 μg/ mL的PCA和0.1 μg/ mL的LPS共同作用于HUVEC后，細(xì)胞仍為橢圓形或梭形，胞漿豐富，邊界清晰，呈鋪路石樣改變(見(jiàn)圖2)。

A:對(duì)照組,B:LPS(0.1 μg/ mL)組,C:LPS(0.1 μg/ mL)+PCA

(1.25 μg/ mL)組

圖2 PCA和LPS聯(lián)合作用對(duì)HUVEC形態(tài)的影響(×200)

Fig 2 Combined PCA with LPS on the morphology of HUVEC (×200)

2.2 PCA對(duì)細(xì)胞活性變化的影響

2.2.1 PCA對(duì)細(xì)胞活性的影響 用MTT法測(cè)定細(xì)胞活性，從表1可看出，隨濃度增加PCA對(duì)細(xì)胞的抑制率增大，OD值減小。PCA為2.50 μg/ mL組細(xì)胞的OD值和對(duì)照組OD值比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，PCA>2.50 μg/ mL組細(xì)胞的OD值和對(duì)照組OD值間差異更加顯著(P<0.01)。

組別PCA濃度(μg/mL)OD值IR(%)對(duì)照組-0．533±0．021-PCA實(shí)驗(yàn)組0．160．528±0．0220．930．320．526±0．0381．400．630．520±0．0292．411．250．511±0．0224．012．500．494±0．019?7．385．000．450±0．032??15．5910．000．403±0．013??24．4020．000．328±0．017??38．3340．000．272±0．014??48．96F值-74．952-P值-0．000-

*表示與對(duì)照組比較P<0.05,**表示與對(duì)照組比較P<0.01

2.2.2 PCA和LPS共同作用前后細(xì)胞活性的變化 由表2可知，與對(duì)照組比較，LPS損傷組細(xì)胞的OD值顯著降低(P<0.01)。PCA實(shí)驗(yàn)組中PCA濃度0.63 μg/ mL組和1.25 μg/ mL組細(xì)胞的OD值明顯大于LPS損傷組(P<0.05)。

組別LPS濃度(μg/mL)PCA濃度(μg/mL)OD值IR(%)對(duì)照組--0．526±0．017-LPS損傷組0．10-0．422±0．029??19．74PCA實(shí)驗(yàn)組0．100．160．428±0．02118．610．100．320．444±0．02815．460．100．630．470±0．022#10．520．101．250．481±0．014△8．47F值--15．043-P值--0．000-

**表示與對(duì)照組比較P<0.01,#表示與LPS損傷組比較P<0.05,△表示與LPS損傷組比較P<0.01

3 討論

隨著我國(guó)人口老齡化程度日益加劇，血栓性疾病的發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，已經(jīng)嚴(yán)重危害到人們的健康且降低了人們的生活質(zhì)量，而現(xiàn)有抗血栓藥存在效果不穩(wěn)定等弊端，因此，新型抗血栓藥物的研發(fā)一直倍受關(guān)注。目前臨床所用的許多抗血栓藥物都是血管內(nèi)皮細(xì)胞合成的抗栓物質(zhì)或其衍生物，如前列環(huán)素[5]、AT-Ⅲ與肝素[6]、組織纖溶酶原激活物[7]等。大量研究證實(shí)生理狀態(tài)下血管內(nèi)皮細(xì)胞通過(guò)分泌多種抗凝、促凝因子及粘附分子等維持血液的流動(dòng)狀態(tài)，而當(dāng)血管內(nèi)皮細(xì)胞受到損傷時(shí)則釋放大量的促凝物質(zhì)促進(jìn)血栓的形成[8]，可見(jiàn)血栓性疾病的發(fā)生、發(fā)展與治療都和血管內(nèi)皮細(xì)胞密切相關(guān)。這些均提示從血管內(nèi)皮細(xì)胞的角度出發(fā)來(lái)研發(fā)抗血栓藥物有著重要意義。蝮蛇毒中的PCA組分可通過(guò)激活血漿蛋白C發(fā)揮抗凝作用，有研究證實(shí)PCA對(duì)心肌梗死、腦梗死等血栓性疾病也有改善作用[3]，可見(jiàn)將PCA開(kāi)發(fā)為一種天然的抗血栓藥物具有很大的應(yīng)用前景，但又因蛇毒組分復(fù)雜且毒副作用大，所以探明PCA抗凝機(jī)制、最佳抗凝劑量等具有非常重要的意義。

本實(shí)驗(yàn)利用MTT法檢測(cè)PCA作用前后HUVEC的活性顯示，PCA在0.16～2.50 μg/ mL時(shí)對(duì)HUVEC活性無(wú)明顯影響，且濃度在0.63～1.25 μg/ mL時(shí)可減輕LPS對(duì)HUVWC的活性抑制，PCA>2.50 μg/ mL 時(shí)明顯抑制HUVEC的活性，并呈劑量依賴性。于倒置顯微鏡下觀察PCA作用前后HUVEC的形態(tài)變化，0.63～1.25 μg/ mL的 PCA不會(huì)引起明顯的細(xì)胞形態(tài)變化，且可減輕內(nèi)毒素引起的細(xì)胞形態(tài)改變，而>2.50 μg/ mL的PCA會(huì)引起明顯的細(xì)胞形態(tài)改變。Natrin和BF-CT1都是由蛇毒中分離純化得到的蛋白質(zhì)[9]，有關(guān)研究發(fā)現(xiàn)兩者均可通過(guò)阻斷細(xì)胞增殖周期誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[10-11]，PCA也是一種蛇毒蛋白組分，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示高濃度PCA可抑制HUVEC活性并引起其形態(tài)改變，PCA這種作用的機(jī)制也可能是通過(guò)阻斷細(xì)胞增殖周期從而誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。熊晶等[12]研究得出蛇毒pENW可通過(guò)抑制NO的分泌減輕LPS對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的損傷作用，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果PCA在0.63～1.25 μg/ mL時(shí)也可減輕LPS對(duì)HUVEC的損傷作用，其機(jī)制也可能是通過(guò)抑制LPS引起的內(nèi)皮細(xì)胞分泌功能改變，但PCA對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的具體作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

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Effects of protein-C activator fromAgkistrodonAcutusvenom on human umbilical veinendothelial cells

SANGJinfeng,ZHANGGenbao,ZHOUShuyan

Department of Pathophysiology,Wannan Medical College,Wuhu 241002,China

Objective：To observe the effects protein-C activator(PCA) extracted from the venom ofAgkistrodonacutuson the human umbilical vein endothelial cells (HUVECs),and investigate the potential mechanisms of this effects.Methods:HUVECs were conventionally cultured,and observed under the inverted microscope for their morphologically changes.MTT method was used to detect the cell activity.The experiment consisted of control group,LPS-induced injury group and PCA treatment group.HUVECs were initially inoculated into separate 96-well plate.Then control group were treated with PBS buffer,LPS injury was induced with LPS in dose of 0.1 μg/ mL,and PCA group were treated with PCA in dose of 0.16,0.32,0.63,1.25,2.50,5.00,10.00,20.00 and 40.00 μg/ mL and mixed solution of 0.1 μg/ mL LPS and PCA dosed by 0.16,0.32,0.63 and 1.25 μg/ mL,respectively.Five duplicated wells were set for individual plate into which 200 μL of the cell solution was added.After 12 hours of culturing,the cell activity and its morphology were determined and observed.Results:PCA level lower than 2.50 μg/ mL had no effect on the activity of HUVECs,yet reduced the damage of LPS to HUVEC.Contrarily,PCA concentration over 2.50 μg/ mL significantly inhibited the activity of HUVECs and modified their morphology.Conclusion:Low concentration of PCA can,to a certain extent,reduce the injury of HUVECs caused by LPS.

snake venom;PCA;HUVEC;cell activity

1002-0217(2015)05-0409-04

安徽省教育廳自然科學(xué)研究基金重點(diǎn)項(xiàng)目( KJ2011A266)

2015-02-05

桑金鳳(1989-),女,2013級(jí)碩士研究生,(電話)18325326198,(電子信箱) 972952842 @qq.com； 張根葆,男,教授,碩士生導(dǎo)師,(電子信箱) zgb858@163.com,通訊作者.

R 996.3

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