譚海濱，李繼昌*

（東北農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學學院，黑龍江 哈爾濱 150030）DOI:10．3969/J.ISSN．1671-6027．2015．08.008

禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病毒檢測方法研究進展

譚海濱，李繼昌*

（東北農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學學院，黑龍江 哈爾濱 150030）DOI:10．3969/J.ISSN．1671-6027．2015．08.008

禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病毒（REV）屬于反轉(zhuǎn)錄病毒屬。此病毒主要感染火雞、鵝、雞、鶴鶉和鴨等禽類并引起以淋巴-網(wǎng)狀細胞增生為特征的腫瘤性病理綜合征。禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病與雞馬立克氏?。∕D）和雞淋巴細胞白血病（AL）均是禽病毒性腫瘤性疾病，且都可以引起嚴重的免疫抑制。目前，因為REV等免疫抑制性疾病所造成的直接或由于疫苗帶毒所造成的間接損失已日益成為影響?zhàn)B禽生產(chǎn)和養(yǎng)殖效益的嚴重因素。

目前，對REV的檢測國內(nèi)外已經(jīng)建立了多種檢測方法：如聚合酶鏈式反應（PCR）、反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應（RT-PCR）法、間接免疫熒光（IFA）、病毒中和試驗（NT）、酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）和核酸探針法等。但是由于前些年我國對REV在雞群危害的嚴重性認識不夠，直到目前為止我國尚未建立自己的REV商品化的監(jiān)測手段，大部分的規(guī)?；B(yǎng)雞場還沒有將REV的監(jiān)測納入日常工作范疇，但是對于目前REV的發(fā)展勢頭、對養(yǎng)禽業(yè)的危害和國內(nèi)外經(jīng)濟貿(mào)易的需求來看，廣泛地開展REV的監(jiān)測已經(jīng)是大勢所趨，研究并確立符合我國養(yǎng)雞業(yè)的REV檢測方法,不僅適合我國養(yǎng)禽業(yè)的技術(shù)需求，且具備了巨大的市場潛力，一定會產(chǎn)生深遠的社會效益和經(jīng)濟效益?，F(xiàn)重點對目前HVT疫苗中污染物REV檢測的PCR、RT-PCR和IFA三種較為常用的檢測方法的國內(nèi)外研究進展做如下介紹：

1 PCR技術(shù)用于檢測REV的研究進展

PCR（polymerase chain raction）技術(shù)是由美國科學家穆利斯提出的一種體外簡化條件下模擬DNA在體內(nèi)復制的DNA快速擴增的方法，這項技術(shù)于1993年獲得諾貝爾化學獎。PCR是一種看起來簡單的體外擴增DNA序列的技術(shù)，具有特異、敏感、產(chǎn)率高，快速、簡便，重復性好、易自動化等突出優(yōu)點。能在一個Ephendof管內(nèi)將所要研究的目的基因或某一DNA片段于數(shù)小時內(nèi)擴增至十萬乃至百萬倍。隨著分子生物學技術(shù)的快速發(fā)展，PCR技術(shù)已經(jīng)滲透到各項疫病的檢測，并且已經(jīng)應用到REV的檢測中。應用PCR方法檢測REV是基于REV反轉(zhuǎn)錄病毒復制周期、RNA轉(zhuǎn)化為DNA。REV的前病毒DNA插入到宿主細胞的DNA中，因此直接提取組織或者細胞的DNA，應用PCR法即可直接擴增出目的片段，達到檢測的目的。REV的LTR序列非常穩(wěn)定，且不同毒株之間的差異非常小。1993年，Aly等首先根據(jù)REV的LTR序列設(shè)計了引物建立了普通PCR方法檢測到了REV的前病毒DNA。Diallo、hertig等人用PCR方法從馬立克氏病疫苗、禽痘疫苗和新城疫疫苗中檢測到了污染的REV，并發(fā)現(xiàn)使用這些疫苗后雞產(chǎn)生了矮小綜合征和腫瘤。2007年，sllval利用PCR方法對商品馬立克氏病疫苗進行檢測，檢測到了REV病毒的污染。國內(nèi)翟新驗等利用前病毒長末端重復序列（LTR）區(qū)設(shè)計引物進行擴增，建立了PCR檢測禽REV的方法，該方法可以檢測出SNV毒株，且和MDV等病毒無交叉反應，特異性較好，但是未能檢測出REV-T毒株。趙麗青等，在Light Cycler建立平臺基礎(chǔ)上，利用SYBR GreenI染料能特異性地與雙鏈DNA結(jié)合而發(fā)出熒光的特性，建立了一種熒光PCR方法檢測REV的方法，病毒的最低檢出濃度為10-7。本方法的建立為開展HVT疫苗中污染物REV的檢測提供了一種快速、有效、靈敏的方法，它即可以作為REV分子流行病學調(diào)查的一種方法，也可以作為REV確診的實驗室診斷方法，并且可以進行大批量檢測。

2 RT-PCR方法檢測REV的研究進展

RT-PCR（reverse transcription PCR）是反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應的縮寫，是PCR的一種廣泛應用的變形。在RT-PCR過程中，一條RNA鏈首先被逆轉(zhuǎn)錄成為互補DNA，然后再以此DNA為模板通過PCR進行DNA擴增。由于反轉(zhuǎn)錄與PCP反應在同一反應體系進行,大大的提高了RT-PCR的反應效率。目前關(guān)于應用RT-PCR方法檢測REV的報道相對較少。在國內(nèi)，葛菲菲從已經(jīng)感染了REV-T株的雞胚成纖維細胞中抽提出染色體DNA，并將此作為模板用于PCR檢測，同時采用Trizol方法提取病毒RNA并作為模板,進行RT-PCR反應，通過此方法擴增出來的基因片段和理論值基本一致，該RT-PCR方法的靈敏度是10-4稀釋倍數(shù)，與其他病毒沒有交叉反應，結(jié)果證明應用RT-PCR方法檢測REV是一種靈敏且特異的方法，初步建立了REV的RT-PCR檢測方法。畢研麗等根椐GenBank中已發(fā)表的禽呼腸孤病毒（ARV）、禽網(wǎng)狀內(nèi)皮增生病病毒（REV）、禽白血病病毒（ALV）等3種病毒的基因組序列,設(shè)計了3對分別與ARV、REV和ALV某段基因序列互補的引物。在建立各病毒單項RT-PCR技術(shù)的基礎(chǔ)上,同時優(yōu)化了三重RT-PCR反應條件，建立了3種病毒的三重RT-PCR技術(shù)，該三重RT-PCR技術(shù)能檢出10pg的ALV、1pg的ARV和10pg的REV模板。建立的多重RT-PCR檢測方法,具有特異、快速、準確的特點,可用于對這3種病毒的同時檢測和鑒別診斷。

3 間接免疫熒光法（IFA）用于檢測REV的研究進展

免疫熒光技術(shù)就是應用抗原和抗體可以結(jié)合的特性，同時結(jié)合熒光色素標記技術(shù)，使其反應的結(jié)果可以在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)一種特異性熒光反應。間接免疫熒光法是將待檢細胞首先用未標記的抗體處理，在抗原抗體形成免疫復合物后，再用熒光標記的二抗與其反應，即可檢測出特異抗原在細胞中的存在部位，具有熒光增強效應。該方法具備熒光效率高，標記后下降不明顯、熒光色澤與背景色澤對比鮮明、標記后能保持生物學活性和免疫活性、標記方法簡單、快速，安全無毒等特點。國內(nèi)最早榮駿弓用禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病病毒（REV）感染SPF雞胚次代成纖維細胞涂片為抗原，確定了待檢血清稀釋度和兔抗雞IgG熒光抗體的稀釋度工作濃度，建立了檢測REV抗體的間接免疫熒光法（IFA）。劉紹瓊等分別用免疫組織化學（IHC）法、間接免疫熒光（IFA）法對腫瘤病雞不同臟器中的禽網(wǎng)狀內(nèi)皮增生病病毒（REV）進行了檢測，兩種方法均在腫瘤病雞的腫瘤、法氏囊、骨髓、肝臟、心臟、脾臟、腺胃等組織切片和觸片中檢測出了REV，兩種方法的檢測結(jié)果完全吻合。IHC法檢測結(jié)果顯示不同組織的細胞被染成褐色或深褐色，IFA法檢測結(jié)果顯示不同組織的細胞內(nèi)均可見亮綠色熒光。結(jié)果表明，IHC法與IFA法均可用于檢測不同臟器中REV的分布，具有直觀、染色特異性強和簡便快速的特點。IFA檢測方法均能夠?qū)乖M行精確定位，避免了在采樣過程中各組織交叉污染而造成檢測結(jié)果的可靠性降低，該方法將有利于禽網(wǎng)狀內(nèi)皮增生病的診斷并為生產(chǎn)實踐提供實驗依據(jù)。

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