丁妙霞，葉惠儀，黃江志，黃炳熾，鐘群芳，張險朋

（1.廣東省東莞市橫瀝鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)技術(shù)服務(wù)中心，廣東 東莞 523460；2東莞市動物疫病預(yù)防控制中心，廣東 東莞 523086）

一例犬布魯氏菌病的診斷

丁妙霞1，葉惠儀1，黃江志1，黃炳熾2，鐘群芳2，張險朋2

（1.廣東省東莞市橫瀝鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)技術(shù)服務(wù)中心，廣東 東莞 523460；2東莞市動物疫病預(yù)防控制中心，廣東 東莞 523086）

布魯氏菌?。˙rucellosis）是由布魯氏菌屬的細(xì)菌感染引起的一種人畜共患性傳染病，是一種以長期發(fā)熱、關(guān)節(jié)疼痛、肝脾腫大和病程慢性化為主要特征的機(jī)體變態(tài)反應(yīng)性疾病。本病分布廣泛，且有抬頭趨勢，給畜牧業(yè)和人的健康帶來較大的危害。目前，流產(chǎn)布氏桿菌（牛種菌，Brucella abortus）、豬種菌（B.suis）、馬爾他布氏桿菌（羊種菌，B.melitensis）和犬種菌（B.canis）對人類致病，且其致病力有所差異。中心近期接診一例懷疑為布魯氏菌感染的犬只，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 臨床資料中心在2015年4月27日接診一只犬，根據(jù)主訴，品種為貴賓，年齡3歲，從當(dāng)?shù)貙櫸锏曩徺I，2015年3月14日配種，2015年4月24日出現(xiàn)流產(chǎn)，送到當(dāng)?shù)氐囊婚g寵物診所求診，該診所用快速檢測試紙條檢測為布魯氏菌抗體陽性，初步懷疑是布魯氏菌病。

1.2 病料采取犬全血離心分離血清，4℃保存待檢，用棉拭子采集陰道分泌物用50%甘油PBS液放4℃保存待檢。

1.3 試劑布魯氏菌病虎紅抗原購自美國IEDXX公司，批號：382-10。布魯氏菌試管凝集抗原購自中監(jiān)所，批號：150138011。布魯氏菌病熒光PCR試劑盒購自上海之江生物技術(shù)有限公司，批號:H20150401。

1.4 方法

（1）虎紅平板凝集試驗方法按照《動物布魯氏菌病診斷技術(shù)》GB/T 18642-2002操作，在虎紅平板凝集板上加30μl血清，在受檢血清旁邊加30μL抗原，用牙簽攪動血清和抗原使之混合，用時設(shè)陰性、陽性血清對照。在陰性、陽性血清對照成立的條件下，對被檢血清進(jìn)行判定，受檢血清在4min內(nèi)出現(xiàn)肉眼可見凝集現(xiàn)象判為陽性，無凝集現(xiàn)象判為陰性。

（2）試管凝集試驗方法按照《動物布魯氏菌病診斷技術(shù)》GB/T 18642-2002操作。

（3）熒光PCR方法取50μL樣本，加50μL核酸提取液充分混勻，沸水浴10min，然后13000rpm離心10min，去上清4μL作為PCR反應(yīng)模板。按照每個反應(yīng)體系35μL布魯氏菌核酸熒光PCR檢測混合液與1μL內(nèi)部對照品，以及0.4μL酶，加入4μL提取的PCR反應(yīng)模板。熒光PCR反應(yīng)參數(shù)為，37℃，2min；93℃，15s，60℃，60s，循環(huán)40次。陽性對照FAM通道CT值小于或等于35，陰性對照無擴(kuò)增曲線試驗成立，樣品FAM通道小于或等于38判為陽性。

2 結(jié)果

2.1 虎紅平板凝集試驗結(jié)果用虎紅平板凝集試驗進(jìn)行初

篩，檢測血清，肉眼可見凝集現(xiàn)象，血清抗體陽性。

2.2 試管凝集試驗結(jié)果采用試管凝集試驗對虎紅平板凝集試驗陽性的血清進(jìn)行確認(rèn)，抗體滴度達(dá)到1：100，確定為布魯氏菌抗體陽性。

2.3 熒光PCR結(jié)果采用熒光PCR方法檢測陰道分泌物，陽性質(zhì)控ct值為19.5，樣品ct值為21，陰性質(zhì)控?zé)o擴(kuò)增曲線，樣品布魯氏菌病陽性，詳見圖1。

3 討論

根據(jù)血清學(xué)和病原學(xué)檢測的結(jié)果，結(jié)合臨床癥狀，初步診斷為該犬只感染布魯氏菌病，也是東莞市首次檢測到犬的布魯氏菌病。布魯氏菌的病原學(xué)診斷主要是從血液或者感染的組織中分離培養(yǎng)布魯氏菌來確診。布魯氏菌的分離培養(yǎng)是診斷布魯氏菌病的金標(biāo)準(zhǔn)，但是由于布魯氏菌的分離率比較低，容易污染，若加上抗生素，則分離效率更低，此外，分離所需要的時間比較長，至少3～8d，有時甚至達(dá)45d。另一方面，分離布魯氏菌對實驗室環(huán)境和要求較高并存在生物安全風(fēng)險，需要在生物安全防護(hù)級別比較高的才能進(jìn)行分離培養(yǎng)。鑒于實驗室的條件，此次試驗未對熒光PCR檢測為陽性的樣品進(jìn)行分離培養(yǎng)。此次試驗采用熒光PCR方法檢測陰道分泌物結(jié)果為陽性，證明應(yīng)用熒光PCR方法檢測布魯氏菌是可行的，熒光PCR具有靈敏性和特異性高，能實現(xiàn)多重反應(yīng)、自動化程度高、無污染、實時和準(zhǔn)確等特點。目前，已廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究等領(lǐng)域，特別是近幾年來在動物疫病的診斷中得到了廣泛的應(yīng)用。凝集試驗是布魯氏菌病診斷的一種常用的方法，包括血清凝集實驗、乳環(huán)沉淀試驗和抗人免疫球蛋白試驗，其中標(biāo)準(zhǔn)試管凝集試驗是我國的法定的檢測方法?；⒓t平板凝集抗原是用抗原性良好的布魯氏菌菌株經(jīng)培養(yǎng)，滅活，離心收集菌體后用虎紅染料染色后懸浮于乳酸緩沖液中制成，該方法靈敏度高，價格便宜，操作方便，檢測快速，適于動物群體布魯氏菌病的普查。在國際貿(mào)易中是牛、羊、豬布魯氏菌病檢測的指定試驗，在我國也用于動物布魯氏菌病監(jiān)測的初篩。

布魯氏菌病對人的危害不同種類的布魯氏菌大多具有不同宿主間交叉感染的能力，并具有極為明顯的宿主危害傾向性。人類布魯氏菌病主要來自動物，主要是通過接觸發(fā)病及帶菌動物和被布魯氏菌污染的畜產(chǎn)品而感染。犬的布魯氏菌病是人感染該病的傳染源之一，犬的布魯氏菌對人類具有致病性，雖然犬的布魯氏致病性不及羊種、牛種和豬種，但也對公共衛(wèi)生構(gòu)成很大的威脅。對于該犬只檢出布魯氏病，建議對該犬只實施安樂死，并進(jìn)行無害化處理，加強(qiáng)對環(huán)境的清潔和消毒。同時，要加強(qiáng)對家畜布魯氏菌病的監(jiān)測，摸清家畜中布魯氏菌感染的情況，為布魯氏菌病的防控、凈化奠定基礎(chǔ)。

圖1 熒光PCR方法檢測樣品布魯氏菌病結(jié)果圖

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10．3969/J.ISSN．1671-6027．2015．08.085