李倩

（哈爾濱維科生物技術(shù)開發(fā)公司，黑龍江 哈爾濱 150069）

標準化無菌及支原體檢驗培養(yǎng)基應(yīng)用試驗

李倩

（哈爾濱維科生物技術(shù)開發(fā)公司，黑龍江 哈爾濱 150069）

經(jīng)靈敏度檢查合格的標準化無菌及支原體檢驗培養(yǎng)基已經(jīng)在4個生物制藥公司進行應(yīng)用實驗并且投入使用，分批進行抗原檢測，99.5%的培養(yǎng)基經(jīng)試驗檢測未被污染，可以投入使用。本文圍繞這種無菌及支原體檢驗培養(yǎng)基進行研究分析，從材料和方法入手，最終進行檢測實驗以及方法探討。

無菌；支原體檢驗；培養(yǎng)基

支原體是一種常見于生物制品中的污染微生物，它的污染不像細菌或者真菌那樣容易被肉眼看見，所以在其培養(yǎng)時也很難被觀察，這樣就需要我們配置適宜的培養(yǎng)基。支原體對生長條件的要求比較嚴格，比如對營養(yǎng)條件的要求，對溫度，濕度，pH的要求。由于這個原因，支原體的檢驗培養(yǎng)基一直是從事此方面工作人員難以解決的問題，下面我們就一起來分析研究本實驗的培養(yǎng)基檢驗試驗，具體情況如下:

1　材料

葡萄糖，乳蛋白水解物，25%酵母浸出物，1%L-半膚氨酸10.0mL，10%精氨酸，血清（本實驗室采集），NaCl，KCl等鹽，PPLO肉湯粉等；本實驗用的所有類型的水都是北京某生物制藥廠生產(chǎn)的，都是經(jīng)過國家藥品檢測而達到標準的水質(zhì)，其他實驗材料也都是經(jīng)過有關(guān)部門質(zhì)量檢測的。而本實驗的支原體檢驗培養(yǎng)基在制備時，完全按照國家制定標準完成，有質(zhì)量的保障。

2　方法

2.1培養(yǎng)基的制備無菌檢驗培養(yǎng)基：需要用到的材料有硫乙醇酸鹽、酪陳瓊脂和葡萄糖蛋白陳干粉。對這些材料進行簡單的處理。將這三種材料的培養(yǎng)基分別按照9mL/支，6mL/支，7mL/支進行封裝，之后采用高溫高壓法進行滅菌，控制適當?shù)臅r間，準備為后期試驗所用。

支原體檢驗培養(yǎng)基：主要原料有：一定量的PPLO肉湯粉和葡萄糖，25%酵母浸出液100.0mL，10%精氨酸20.0mL，10倍濃縮MEM溶液10.0mL，血清，青霉素（8萬IU/mL）10.0mL蒸餾水。配制后調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH，使之維持弱堿性，采用適宜的方法去除雜菌的污染，然后在-20℃條件下進行保存。所用的固體培養(yǎng)基就是在此基礎(chǔ)上加入適量的瓊脂，使培養(yǎng)基呈現(xiàn)固態(tài)，但培養(yǎng)基的成分及含量基本保持不變。

2.2支原體檢驗培養(yǎng)基的應(yīng)用試驗培養(yǎng)基的配制的成功與否要看培養(yǎng)基培養(yǎng)支原體的情況以及支原體生長的情況。本實驗選用豬鼻支原體（BTS-7）進行試驗，試驗的方法為：將培養(yǎng)基依次稀釋10倍到10-3，10-4，10-5，一直依次遞減，再將支原體加入其中，將其置于適宜溫度下培養(yǎng)4～5d，當其中一組試驗的培養(yǎng)基的顏色出現(xiàn)明顯變化時停止試驗，即為試驗終點，記錄實驗數(shù)據(jù)，進行后期分析。

2.3培養(yǎng)基的保存試驗用控制變量的方法，對培養(yǎng)基進行保存的檢測試驗。先取5支試管，分別加入等量且適宜的培養(yǎng)基，放入-20℃恒溫箱中保存，記為第1組；再取5支試管，加入與第1組等量的培養(yǎng)基，放入37℃的恒溫箱里保存，記為第2組。將兩組的五支試管分別保存1d，2d，3d，4d，5d。前兩組在保存規(guī)定時間后，將培養(yǎng)基與室溫溫度相同時，直接進行上述檢測試驗。而我們設(shè)置的第3組實驗則是將相同量的5支試管的培養(yǎng)基先進行-20℃保存0.5d，1d，1.5d，2臺，2.5d，再保存在37℃下相應(yīng)的天數(shù)，進行這種冰凍-融化處理，在進行檢測，記錄試驗的結(jié)果。

3　結(jié)果

從支原體檢驗培養(yǎng)基的試驗中可以看出，這種配置方法的培養(yǎng)基濃度對于支原體培養(yǎng)的影響不大，先出現(xiàn)顏色變化的培養(yǎng)基也是隨機的，而對所有參加檢測的抗原，非禽源支原體檢驗培養(yǎng)基抽檢樣品，其中包括疫苗，細胞培養(yǎng)上清液等，血清支原體檢驗培養(yǎng)基抽檢血清樣品，他們在無菌培養(yǎng)基檢測的結(jié)果一致。均沒有污染情況產(chǎn)生。而經(jīng)過培養(yǎng)基的保存試驗可以得出結(jié)論，從支原體的生長速度可以看出，培養(yǎng)基在低溫和適度高溫，以至緩凍的條件下都可以保持較高的穩(wěn)定性，支原體活菌滴度平均達到109/mL，營養(yǎng)條件保持良好，pH值沒有明顯變化，各個微量元素的含量無明顯變化，且批次之間沒有差異。

4　討論

將培養(yǎng)基進行一定的改良，可以確保培養(yǎng)基的質(zhì)量，提高檢驗工作的效率。由于支原體檢驗培養(yǎng)基對于培養(yǎng)條件要求特別嚴格，所以在配制時應(yīng)注意改良方法。影響其質(zhì)量的條件因素有很多，通常情況下一般的影響因素有溫度，濕度以及培養(yǎng)時氧氣的濃度。溫度主要能夠影響支原體的存活狀況，溫度過高將使支原體無法正常正常生存繁殖，溫度過低則又會使支原體處于休眠狀態(tài)，所以控制培養(yǎng)時的溫度是十分重要的。濕度對支原體培養(yǎng)的影響也是較為顯著的，濕度強度會直接影響到支原體的生長。培養(yǎng)過程中氧氣濃度不僅會影響支原體的生長速度，還可能有助于其他的雜菌生長，導(dǎo)致支原體的培養(yǎng)失敗。在支原體的培養(yǎng)過程中要對培養(yǎng)的溫度、濕度及氧氣濃度都要進行嚴格的控制，只要這樣才能進一步保證支原體培養(yǎng)的成功。

5　結(jié)語

本文對標準化無菌及支原體檢驗培養(yǎng)基應(yīng)用試驗進行分析研究，改進了支原體檢驗培養(yǎng)基的配制，使它的更易保存，不易被污染。長期以來支原體培養(yǎng)檢驗的培養(yǎng)基的原料質(zhì)量一直沒有統(tǒng)一的標準，但通過大量的試驗研究總結(jié)了對于配制培養(yǎng)基的配制更有利的各原材料的質(zhì)量參數(shù)配比。避免了因培養(yǎng)基質(zhì)量而帶來的各種實驗誤差，提高了支原體檢驗工作的準確性。而且試驗中對于培養(yǎng)基保存條件的實驗更是進行了深入研究，模擬了各種情況下的保存，這為支原體檢驗培養(yǎng)基的儲存和運輸起到了很好的作用。

［1］張瑞婷，等.獸用生物制品的支原體污染檢驗及注意事項［J］.中國獸藥雜志2012，35（2）:28-30.

［2］羅玉峰，等，標準化無菌及支原體檢驗培養(yǎng)基應(yīng)用試驗［J］.中國獸藥雜志，2012，43（6）:26-29.

［3］羅玉峰，等.獸用藥品無菌檢驗用硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基的研究［J］.中國獸藥雜志，2011，43（4）:28-29.

10.3969/J.ISSN.1671-6027.2015.07.017