范俊俊，劉曉靜，張曉玲，齊 鵬

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 草業(yè)學(xué)院/草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/甘肅省草業(yè)工程實(shí)驗(yàn)室/中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 資源與環(huán)境學(xué)院,甘肅 蘭州 730070)

不同NO3--N /NH4+-N配比對(duì)紫花苜蓿盛花期生長(zhǎng)及結(jié)瘤固氮的影響

范俊俊1，劉曉靜1，張曉玲1，齊 鵬2

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 草業(yè)學(xué)院/草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/甘肅省草業(yè)工程實(shí)驗(yàn)室/中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 資源與環(huán)境學(xué)院,甘肅 蘭州 730070)

在完全營(yíng)養(yǎng)液條件下，采用砂培法，研究了NO3--N與NH4+-N兩種氮素形態(tài)的7種配比(氮素水平210 mg/L)對(duì)紫花苜蓿盛花期生長(zhǎng)及結(jié)瘤固氮的影響。結(jié)果表明：各形態(tài)配比下紫花苜蓿的株高、生物量、根瘤數(shù)、根瘤重及固氮酶活性均隨NO3--N/NH4+-N增大呈先增大后減小的趨勢(shì)；且NO3--N/NH4+-N比例為5/3時(shí)，紫花苜蓿的株高、生物量、根瘤數(shù)、根瘤重及固氮酶活性均取得最大值，而地上部和地下部全氮含量則在5/5時(shí)最高。綜合分析，當(dāng)?shù)厮皆?10 mg/L時(shí)，5/3處理下紫花苜蓿生長(zhǎng)較好，自身固氮能力較強(qiáng)。

紫花苜蓿；NO3--N/NH4+-N；生長(zhǎng)；結(jié)瘤固氮

氮素既可以被作物以陰離子NO3--N形式吸收，也可以被作物以陽(yáng)離子NH4+-N形式吸收[1]，且這兩種形態(tài)是植物吸收利用的兩種主要氮源形式[2]。銨態(tài)氮可直接被植物利用合成氨基酸，而植物吸收的硝態(tài)氮?jiǎng)t必須經(jīng)過還原形成銨態(tài)氮后才能被利用[3]。從生物能學(xué)的角度來(lái)看，銨態(tài)氮在同化前不需要被還原，應(yīng)該是植物優(yōu)先利用的氮源[4]。因此，對(duì)于大多作物而言，植株在NO3--N營(yíng)養(yǎng)下生長(zhǎng)良好。研究表明，NO3--N可以促進(jìn)植物根系的長(zhǎng)度生長(zhǎng)以及表面積和密度的增加[5]，NH4+-N可以促進(jìn)紫花苜蓿生物量積累和結(jié)瘤固氮[6]。裴文梅等[7]用營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)甘草的研究表明，硝態(tài)氮與銨態(tài)氮等量配合施用時(shí)，甘草根的產(chǎn)量、整株合成的藥用成分均最高。與單一的NO3--N或NH4+-N比，NO3--N和NH4+-N以適度比例混合施用可以更好的促進(jìn)絕大多數(shù)旱作作物生長(zhǎng)。

有關(guān)氮素形態(tài)配比對(duì)植物的影響報(bào)道很多，而在最適氮素濃度下NO3--N/NH4+-N對(duì)紫花苜蓿影響尚未見報(bào)道。為了進(jìn)一步研究氮素形態(tài)不同配比對(duì)‘甘農(nóng)3號(hào)’紫花苜蓿盛花期生長(zhǎng)及結(jié)瘤固氮的影響，采用砂培法，在一定氮素水平下(210 mg/L)，研究不同的配比對(duì)‘甘農(nóng)3號(hào)’紫花苜蓿盛花期生長(zhǎng)及結(jié)瘤固氮的影響，以期為紫花苜蓿合理的氮素供應(yīng)提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支撐。

1 材料和方法

1.1 供試材料

供試品種‘甘農(nóng)3號(hào)’紫花苜蓿(Medicagosativacv.Gannong No.3)，供試菌株為中華根瘤菌(12531)，來(lái)源苜蓿根瘤和誘變菌株，均由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 粗砂處理 將粗砂經(jīng)自來(lái)水沖洗多次，直到?jīng)_洗用水不再渾濁為止，再用蒸餾水沖2～3次。121 ℃滅菌，150 ℃烘干后，備用。

1.2.2 種子處理 選取大小均勻，顆粒飽滿的紫花苜蓿種子，95%乙醇浸泡5 min，0.1% HgCl2溶液滅菌3 min，無(wú)菌水沖洗5～6次，最后用無(wú)菌濾紙吸干，備用[8]。

1.2.3 根瘤菌培養(yǎng) 將中華根瘤菌(12531)采用平板劃線培養(yǎng)，挑起單個(gè)菌落，將其接入YMA液體培養(yǎng)基[9]。在28 ℃下120 r/min的恒溫?fù)u床上培養(yǎng)至菌液的光密度值(D600nm)≥1.0時(shí)，再在10 000 r/min下離心10 min，除去上清液用無(wú)菌水洗下根瘤菌體并配制成吸光值為0.6的菌懸液，備用。

1.2.4 營(yíng)養(yǎng)液配置 (1)Fahraeus無(wú)氮植物營(yíng)養(yǎng)液：Na2HPO4·12H2O 0.15 g，MgSO4·7H2O 0.12 g，檸檬酸鐵0.005 g，CaCl2·2H2O 0.1 g，KH2PO40.1 g，Gibson微量元素1 mL，H2O 1 000 mL，pH 6.5～7.0。

(2)Gibson微量元素液：H3BO32.86 g，ZnSO4·7H2O 0.22 g ，CuSO4·5H2O 0.08 g，MnSO4·4H2O 2.03 g ，Na2MoO4·2H2O 1.26 g，H2O 1 000 mL[10]。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選用直徑16 cm、高20 cm 的花盆，裝入經(jīng)自來(lái)水沖洗再用蒸餾水清洗并經(jīng)過高溫滅菌的粗砂10 kg。每盆播種100粒滅菌種子，播種14 d后進(jìn)行間苗，每盆定苗50株，然后澆入營(yíng)養(yǎng)液，置于塑料防雨棚內(nèi)。根據(jù)前期試驗(yàn)結(jié)果[11，12]設(shè)氮素水平為210 mg/L(以純氮計(jì))，設(shè)NO3--N、NH4+-N兩種氮素形態(tài)7種配比，NH4+-N/NO3--N分別為12.5/87.5；25/75；37.5/62.5；50/50；62.5/37.5；75/25；87.5/12.5，即：1/7、1/3、3/5、5/5、5/3、3/1、7/1,共7個(gè)處理，每處理重復(fù)10次，完全隨機(jī)排列。以Fahraeus無(wú)氮植物營(yíng)養(yǎng)液為基本營(yíng)養(yǎng)液，分別加入Ca(NO3)2和(NH4)2SO4配制所需氮素濃度，并調(diào)節(jié)pH7，結(jié)合無(wú)氮營(yíng)養(yǎng)液一同施入。

2014年4月10日播種，每日噴澆3次蒸餾水，每次100 mL，直至對(duì)生真葉完全展開；之后每周淋澆1次配制營(yíng)養(yǎng)液，每次500 mL；每7 d用蒸餾水淋洗盆栽1次以防止砂培中鹽分積累，而后澆入新配置營(yíng)養(yǎng)液。紫花苜蓿生長(zhǎng)至三片復(fù)葉時(shí)，每盆接種新培養(yǎng)的苜蓿根瘤菌液50 mL。在盛花期測(cè)定紫花苜蓿株高，生物量，根瘤數(shù)，根瘤重，固氮酶活性及全氮含量。

1.4 測(cè)定方法

每個(gè)處理隨機(jī)取30株單株測(cè)定植株高度，取平均值；取樣洗凈用濾紙吸干地上部和地下部水分，放入烘箱105 ℃下殺青15 min，再在65～75 ℃下烘干至衡重，稱其干重，每個(gè)處理重復(fù)6次。

每處理取10株，統(tǒng)計(jì)單株根瘤數(shù)。將每個(gè)單株上摘下的根瘤在電子天平上稱根取鮮根瘤重，每個(gè)處理重復(fù)10次。

固氮酶活性采用乙炔還原法測(cè)定[13，14]。稱取0.2 g的新鮮根瘤置于11 mL玻璃瓶中，加蓋橡皮塞后，從中吸出1.1 mL空氣，注入1.1 mL乙炔，室溫下反應(yīng)30 min后，待機(jī)器穩(wěn)定后，用微量注射器抽取混合氣體50 μL注入氣相色譜儀(GC)進(jìn)樣柱中，測(cè)定C2H2、C2H4峰值。然后，在同樣條件下用標(biāo)準(zhǔn)乙烯測(cè)定并繪制乙烯的標(biāo)準(zhǔn)曲線，由此計(jì)算根瘤樣品的固氮酶活性。每個(gè)處理3次重復(fù)。測(cè)定儀器為GC-7890F氣相色譜儀，柱溫170 ℃，進(jìn)樣器140 ℃，F(xiàn)ID檢測(cè)器150 ℃。氣體壓力N2為0.3 mPa，H2為0.08 mPa，空氣為0.15 mPa。C2H4水平μmol/(g·h) =h·x(樣品峰面積)×C(標(biāo)準(zhǔn)C2H4水平，μmol/mL)/ hs(標(biāo)準(zhǔn)C2H4峰面積)×24.9×t(C2H2反應(yīng)時(shí)間，h)×m(瘤重，g)。

植株全氮含量采用濃H2SO4-H2O2法測(cè)定[15]，每個(gè)處理重復(fù)3 次。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2003軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，并用SPSS 17.0進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 NO3--N/NH4+-N對(duì)紫花苜蓿盛花期株高、地上、地下生物量的影響

在供氮水平一定的條件下，隨NO3--N/NH4+-N增大，株高呈先增后減的趨勢(shì)(表1)，NO3--N/NH4+-N為5/3時(shí)，其株高為39.33 cm，顯著高于其他處理(P<0.05)。植株高度是衡量牧草生長(zhǎng)狀況的重要指標(biāo)，與產(chǎn)量呈正相關(guān)，高植株通常有更高的相對(duì)產(chǎn)量潛力[16]，因此，5/3處理時(shí)地上生物量也最大。當(dāng)NO3--N/NH4+-N大于5/5時(shí)，NO3--N所占比例大的處理地上生物量大于NH4+-N比例大的處理。地下生物量隨處理的不同與地上生物量基本呈相同的變化趨勢(shì)，其最大與最小值分別出現(xiàn)在5/3和3/1處理。

表1 NO3--N /NH4+-N配比下紫花苜蓿的株高、地上、地下生物量Table1 Effects of NO3--N /NH4+-N on the plant height,aboveground and underground biomass of alfalfa

注：同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)

2.2 NO3--N/NH4+-N對(duì)紫花苜蓿盛花期根瘤數(shù)、根瘤重和固氮酶活性的影響

從量化的根系形態(tài)指標(biāo)能夠較為直觀的判斷硝銨配比對(duì)紫花苜蓿長(zhǎng)勢(shì)的影響。除1/7外，隨著NO3--N/NH4+-N比例的增加，根瘤數(shù)先增加后減小(表2)。根瘤數(shù)在5/3處理下達(dá)到最大，為每株36.3個(gè)；7/1處理時(shí)根瘤數(shù)最少，每株僅為11.3個(gè)。植株單株根瘤數(shù)越多，其根瘤重越重。根瘤干重與鮮重均與根瘤數(shù)呈現(xiàn)相同的趨勢(shì)，且5/3處理時(shí)最重，與其他處理差異顯著(P<0.05)。根瘤數(shù)、根瘤重均表現(xiàn)為NH4+-N>NO3--N。固氮酶活性的高低反映其固定大氣中氮的能力強(qiáng)弱。NO3--N/NH4+-N為5/3時(shí)，固氮酶活性最高，顯著高于其他處理(P<0.05)，與最低處理1/3相比增加了67.8%。由此可見NO3--N/NH4+-N為5/3時(shí)，紫花苜蓿自身固氮能力最強(qiáng)。

表2 NO3--N /NH4+-N配比下紫花苜蓿的根瘤數(shù)、根瘤重和固氮酶活性Table2 Effects of NO3--N /NH4+-N on root nodule number,root nodulation and nitrogenase activity of alfalfa

2.3 NO3--N/NH4+-N對(duì)花苜蓿盛花期地上和地下部全氮含量的影響

地上部和地下部全氮含量在NO3--N/NH4+-N為5/5時(shí)最高(圖1)，分別為2.76%和2.47%，顯著高于其他處理(P<0.05)。地上部分全氮含量NO3--N/NH4+-N為5/3時(shí)最小，為2.03%；處理1/7、1/3、5/5、3/1、7/1顯著高于5/3和3/5，而1/7、1/3、3/1、7/1之間差異不顯著。地下部分全氮含量在3/1處理下最低，為1.87%；由此可見，當(dāng)?shù)厮揭欢〞r(shí)，NO3--N/NH4+-N比例并不是影響紫花苜蓿全氮含量的主要因素。

圖1 NO3--N/NH4+-N配比下紫花苜蓿的地上、地下部全氮含量Fig.1 Effects of NO3--N/NH4+-N on aboveground and aboveground nitrogen content of alfalfa

3 討論與結(jié)論

研究報(bào)道，施氮不僅能提高紫花苜蓿的生物產(chǎn)量[17]和種子產(chǎn)量，還能增加其干物質(zhì)和氮素積累量[18]，可明顯改善紫花苜蓿的品質(zhì)[19]。朱祝軍等[20]研究發(fā)現(xiàn)，適宜的硝態(tài)氮與銨態(tài)氮配比有利于菜豆的生長(zhǎng)發(fā)育。董守坤等[21]在大豆的研究上表明NH4+-N 和NO3--N的共同存在更有利于大豆的生長(zhǎng)。Britto等[22]認(rèn)為,在高比例的硝態(tài)氮或銨態(tài)氮處理下,過多的能量消耗用于 NO3--或NH4+的轉(zhuǎn)移,從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)和糖類合成的減少。孫園園等[23]發(fā)現(xiàn)菠菜在銨硝配比為25∶75 的營(yíng)養(yǎng)液中產(chǎn)量最高，銨硝配比超過50∶50 時(shí)產(chǎn)量下降。試驗(yàn)研究表明：盛花期，NO3--N/NH4+-N<5/3時(shí)，地上以及地下生物量均大于NO3--N/NH4+-N>5/3的處理。NO3--N/NH4+-N為5/3時(shí)，株高顯著高于其他處理，而地上生物量與地下生物量分別顯著高于除1/7和5/5以外處理。因?yàn)镹O3--N和NH4+-N同時(shí)存在于生長(zhǎng)的介質(zhì)中會(huì)相互影響彼此的吸收速率及吸收動(dòng)力學(xué)，NO3--N可以促進(jìn)植物對(duì)NH4+-N的吸收[11]，在硝態(tài)氮供應(yīng)充足的情況下，根系多吸收了銨態(tài)氮，從而促進(jìn)了根系的生長(zhǎng)[24]。另外，適當(dāng)增施銨態(tài)氮促進(jìn)了地上部的生長(zhǎng)，光合作用增強(qiáng)，因此，生物量也會(huì)增加。Walch-Liu等[25]也發(fā)現(xiàn)的銨態(tài)氮易導(dǎo)致植物體內(nèi)激素平衡的失調(diào)和細(xì)胞分裂素含量急劇下降,降低氮同化能力，從而影響作物的產(chǎn)量。

根瘤固氮酶活性是衡量豆科植物固氮有效性的重要指標(biāo)。蒯佳林[26]研究發(fā)現(xiàn)，NH4+-N 培養(yǎng)下紫花苜蓿根瘤數(shù)量、根瘤固氮酶活性和均明顯好于NO3--N 培養(yǎng)。宋海星等[27]研究表明，NO3--N與NH4+-N 均不同程度地抑制根瘤固氮酶活性，但NH4+-N對(duì)根瘤固氮的抑制作用明顯低于NO3--N。葉芳等[11]研究發(fā)現(xiàn)，適量的NO3--N和NH4+-N均能促進(jìn)紫花苜蓿結(jié)瘤固氮，但二者以一定的比例混合效果更佳。試驗(yàn)研究表明：氮素水平一定時(shí)，NO3--N/NH4+-N為5/3時(shí)，根瘤數(shù)，根瘤重最大；而NO3--N/NH4+-N>5/3時(shí)，根瘤數(shù)、根瘤重以及固氮酶活性均減小，這與以上學(xué)者的研究結(jié)果相一致，并得出了NO3--N/NH4+-N的最佳配比。

在氮素水平為210 mg/L下，NO3--N /NH4+-N比例為5/3，即NO3--N /NH4+-N為62.5/37.5時(shí)，紫花苜蓿生長(zhǎng)較好，且自身固氮能力較強(qiáng)。

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Effects of the ratios of NO3--N /NH4+-N on growth,nodulation and nitrogen-fixation of alfalfa at flowering stage

FAN Jun-jun1,LIU Xiao-jing1,ZHANG Xiao-ling1,QI Peng2

(1.CollegeofGrasslandScience,GansuAgriculturalUniversity,Lanzhou730070,China；2.KeyLaboratoryofGrasslandEcosystemofMinistryofEducation/Sino-U.S.CentersforGrazingLandEcosystemSustainability,Lanzhou730070,China;3.CollegeofResourcesandEnvironmentalScience,GansuAgriculturalUniversity,Lanzhou730070,China)

Under the condition of complete nutrient solution,the effect of 7 ratios of NO3--N/NH4+-N (the nitrogen level was 210 mg/L) on growth，nodulation and nitrogen-fixation of alfalfa were studied at flowering stage by sand culture method.The results showed that along with the increase of NO3--N/NH4+-N ratio,plant height,biomass,nodule number,nodule weight and nitrogenase activity showed a trend of increasing first and then decreasing under different ratios of NO3--N/NH4+-N.The plant height,biomass,nodule number,nodule weight and nitrogenase activity of alfalfa achieved the maximum at 5/3,while the total nitrogen content of aboveground and underground were highest at 5/5.Under the nitrogen level of 210 mg/L,alfalfa performed best under 5/3 treatment and the nitrogen-fixing ability was the strongest as well.

alfalfa;ratios of NO3--N /NH4+-N;growth;nodulation and nitrogen-fixation

2014-12-08；

2014-12-24

國(guó)家自然科學(xué)基金(31460622)；甘肅省財(cái)政廳項(xiàng)目“外源氮素供應(yīng)對(duì)紫花苜蓿產(chǎn)量和品質(zhì)形成影響研究”資助

范俊俊(1989-)，男，甘肅天水人，碩士研究生。 E-mail：fan1990124@163.com 劉曉靜為通訊作者。

S 144.5

A

1009-5500(2015)01-0044-05