孫廣正，侯 棟,岳宏忠,趙桂琴,姚 拓,柴曉虹,陳 龍

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學 草業(yè)學院/草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點實驗室/甘肅省草業(yè)工程實驗室/中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅省農(nóng)業(yè)科學院蔬菜研究所,甘肅 蘭州 730070)

番茄早疫病菌拮抗細菌的篩選及其抑制作用

孫廣正1，侯 棟2,岳宏忠2,趙桂琴1,姚 拓1,柴曉虹1,陳 龍1

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學 草業(yè)學院/草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點實驗室/甘肅省草業(yè)工程實驗室/中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅省農(nóng)業(yè)科學院蔬菜研究所,甘肅 蘭州 730070)

為了篩選對番茄早疫病菌具有生防作用的菌株，利用前期研究獲得的17株促生菌，采用平板對峙法測定其對病原真菌的拮抗作用及對菌絲生長的抑制作用。結果發(fā)現(xiàn),可有效拮抗番茄早疫病菌的生防菌有2株，其中，菌株FX2的抑菌活性較好，抑制率達到70.52%，菌株LHS11的抑制率為65.34%。菌株FX2和LHS11可通過次生代謝物抑制病原真菌，其中菌株LHS11的發(fā)酵液對番茄早疫病菌的抑制率達到65.40%，菌株FX2的發(fā)酵液的抑制率為47.26%。菌株FX2和LHS11能使病原菌菌絲發(fā)生不同程度扭曲變形。

番茄早疫?。籔GPR菌；生物防治；作用機理

番茄早疫病又稱輪紋病，由茄鏈格孢菌(Alternariasolani)引起，造成番茄葉斑、果腐和莖病變[1]。這種真菌病害常大面積發(fā)生，造成番茄大量減產(chǎn)，嚴重威脅番茄生產(chǎn)。尤其20世紀70年代后期以來，我國部分地區(qū)由于推廣的番茄品種抗病毒病而不抗早疫病，導致早疫病的大面積發(fā)生，危害日趨嚴重。一般年份發(fā)病率在10%，造成產(chǎn)量損失10%～30%；流行年份發(fā)病率可達100%，產(chǎn)量損失達30%～40%[2]。目前，該病害仍主要依靠化學農(nóng)藥防治，但化學農(nóng)藥的長期使用，容易造成病原菌抗藥性增強。農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展要求植物病蟲害的防治應逐步降低化學農(nóng)藥的用量，大力研發(fā)高效低毒且環(huán)境兼容性好的植保替代產(chǎn)品。

生物農(nóng)藥具有低殘留、不易產(chǎn)生抗藥性、源于生物、對環(huán)境友好等諸多優(yōu)點，已被越來越多的人們所接受，并且成為病害防治的一個重要途徑[3]。其中，利用細菌特別是植物根際促生細菌(PGPR)防治植物病害成為生物防治的重要研究領域。邢袆博[4]從番茄根際土壤中分離到菌株7-19，該菌對番茄早疫病菌株的生長具有很強的抑制作用，抑菌圈直徑為24 mm，并且菌株發(fā)酵液對另外7種病原菌也具有較高的拮抗活性。王宇婷等[5]研究發(fā)現(xiàn)，短短芽孢桿菌011菌發(fā)酵濾液對8種植物病原真菌均有抑制作用，其中對番茄早疫病菌抑制作用較強，抑菌帶寬為5.5 mm，并且對番茄早疫病菌菌絲和孢子均有致畸作用。PGPR能通過產(chǎn)生抵抗多種病原菌的抗生素類物質(zhì)、毒素或誘導寄主植物產(chǎn)生病程相關蛋白等途徑，幫助植物抵抗生物類侵害。因此，篩選高效廣適的PGPR菌成為研發(fā)生物制劑的先決條件。以前期工作獲得的17株菌為原始材料，用平板對峙生長法研究植物根際促生菌對番茄早疫病菌的防治作用，以期為該真菌引起的植物病害的生物防治提供新的菌種資源和科學依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

PGPR菌：Jm170、Jm92、LX191、G、Jx59、Lx22、Lx81、LHS11、LM4-3、4N4、XX1、XX2、XX5、XX6、FX1、FX2和F1-4，分離自小麥(Triticumaestivum)、玉米(Zeamays)、苜蓿(Medicagosativa)和三葉草(Trifoliumpratense)等植物根際，具有良好的固氮、溶磷及分泌植物激素特性(表1)，由甘肅農(nóng)業(yè)大學草業(yè)學院草地微生物實驗室提供。

表1 供試菌株Table1 Tested strains

注:“*”待鑒定,“-”表示促生特性微弱，其余菌株促生特性尚未發(fā)表

供試植物病原真菌：番茄早疫病菌由甘肅農(nóng)業(yè)大學草業(yè)學院提供。

培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基用于真菌培養(yǎng)和平板對峙培養(yǎng)[12]，馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂18～20 g，加水至1 L。

LB固體培養(yǎng)基用于分離和保存根際細菌[13]：牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，瓊脂20 g，pH 7.0～7.2，加水至1 L。LB液體培養(yǎng)基用于發(fā)酵根際細菌。

1.2 方法

1.2.1 優(yōu)良生防菌初篩 按榮良燕的方法[12]，采用平板對峙法測定所有的供試菌株對番茄早疫病菌的拮抗作用。將保存在PDA斜面上的番茄早疫病菌接種到PDA平板上，25 ℃培養(yǎng)5～7 d。供試PGPR菌接種在LB液體培養(yǎng)基中，150 r/min，培養(yǎng)24 h，細菌菌液濃度106μg/mL備用。再將病原菌與細菌同時接種在PDA平板上，平板中心接種真菌，菌餅的直徑為6 mm，距中心1.7 cm處等距離接種4種不同的細菌(用加液槍將菌液垂直滴在培養(yǎng)基上)，每種組合3個重復。25 ℃培養(yǎng)，根據(jù)真菌的生長情況在適宜天數(shù)測量真菌距細菌近端的半徑。

抑菌率= [ (對照菌落直徑-處理菌落直徑)/對照菌落直徑]×100%

1.2.2 優(yōu)良生防菌復篩 挑選抑菌圈較大，被抑制病菌邊緣平齊且拮抗作用持久的生防菌進行復篩。方法同1.2.1。距平板中心1.7 cm處4點接種同一種細菌，每種組合3個重復。

1.2.3 生防菌發(fā)酵液的抑菌作用 發(fā)酵液的制備：按文獻[14]的方法，將活化好的優(yōu)良生防菌單菌落，接種至含100 mL的LB液體培養(yǎng)基搖瓶中，于28 ℃，150 r/min搖床培養(yǎng)24 h，移至150 mL離心管中，12 000 r/min離心20 min，先用無菌濾紙過濾，再用0.22 μm微孔濾膜過濾除菌得無菌發(fā)酵液。將收集的發(fā)酵液存放至4 ℃冰箱備用。

在無菌條件下，將無菌發(fā)酵液與冷卻至45 ℃的PDA培養(yǎng)基按1∶9的比例混勻，并制成含無菌發(fā)酵液的平板培養(yǎng)基，以不含發(fā)酵液(加同樣比例的無菌水)PDA平板為空白對照。每個處理設3個重復，試驗重復2次。在平板中央放入直徑6 mm的病原菌菌餅，25 ℃恒溫培養(yǎng)，從第3 d開始觀察生長情況，在對照菌落長滿平板時，采用十字交叉法測量菌落直徑，計算菌絲生長抑制率，得到生防效果最好的菌株。

1.2.4 生防菌對病原菌菌絲生長的影響 在顯微鏡(10×40)下觀察靠近生防菌的抑菌圈邊緣菌絲生長情況，以正常生長的病原菌邊緣菌絲為對照，在顯微鏡下觀察生防菌對病原菌菌絲形態(tài)的影響。

1.2.5 優(yōu)良生防菌株拮抗反應測試 按文獻[15]的方法，采用牛津杯法測試優(yōu)良生防菌株間的拮抗反應。將一種菌在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h的菌懸液，以2%(v/v)的量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)48 h；發(fā)酵液8 000 r/min離心10 min，上清過0.22 μm濾膜，取濾液100 μL滴加在含有2%另一種細菌的LB平板中央的牛津杯中(直徑7 mm)，待發(fā)酵濾液擴散后置28 ℃條件下恒溫培養(yǎng)。以無菌水作陰性對照。將供試細菌兩兩進行抑菌試驗，每個處理3次重復，1 d后觀察抑菌圈的有無，若有抑菌圈，說明兩細菌間有拮抗作用，若無抑菌圈，且細菌生長良好，則說明這兩個細菌可以共存，各菌株間沒有拮抗作用。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析 采用SPSS 16.0軟件中的Duncan氏新復極差法對所有數(shù)據(jù)進行單因素分析。

2 結果與分析

2.1 篩選拮抗番茄早疫病菌的優(yōu)良生防菌

在供試生防菌中，有效拮抗番茄早疫病菌的有2株，抑制率大于60%(表2)。在培養(yǎng)3 d后，除了菌株Jm92和4N4，其他菌株均表現(xiàn)出一定的抑制作用，抑制率大于30%的菌株有7株，其中，菌株FX2的抑菌活性較好，抑制率達到43.80%，和其他菌株相比差異顯著。隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加，8株生防菌的抑制率有所提高，其余菌株失去抑菌活性。培養(yǎng)7 d，菌株LHS11和FX2能明顯抑制病原菌菌絲的生長(圖1-A2，A3)，抑制率均大于60%。其中，F(xiàn)X2的抑菌能力較強，抑制率達到70.52%，與LHS11差異不顯著，和其他菌株相比差異顯著。培養(yǎng)9 d后，在半徑為45 mm的平板上長滿對照菌落(圖1-A1)。

表2 生防菌對番茄早疫病菌的拮抗作用Table2 Inhibition of bio-control strains against Alternaria solani

注:“-”表示無抑制作用，表中數(shù)據(jù)為平均值±標準差，同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示差異顯著(P< 0.05)

2.2 生防菌發(fā)酵液與番茄早疫病菌拮抗

供試生防菌在培養(yǎng)3 d以后，LHS11和FX2的發(fā)酵液對番茄早疫病菌均有抑制作用，抑制率分別為52.07%和33.06%(表3)。隨著天數(shù)的增加，發(fā)酵液對病原菌的抑制率提高。培養(yǎng)7 d，LHS11和FX2的發(fā)酵液表現(xiàn)出明顯的抑制作用(圖1-B2，B3)，其中，LHS11的發(fā)酵液的抑菌能力較強，抑制率達到65.40%，F(xiàn)X2為47.26%。

表3 生防菌與番茄早疫病菌拮抗及抑制率Table3 Antagonism and inhibition rate of fermentation solution of bio-control strains against Alternaria solani

圖1 生防菌與番茄早疫病菌平板對峙Fig.1 The panel confrontation of bio-control strains and Alternaria solani

注：A.活菌;B.發(fā)酵液;C.菌絲光鏡照片;1.對照;2.生防菌LHS11;3.生防菌FX2；C.為光鏡照片,放大倍數(shù)為10×40；C1.正常菌絲；C2.菌絲膨大；分枝增多C3.菌絲彎曲、腫脹,細胞質(zhì)外滲

2.3 生防菌對番茄早疫病菌菌絲生長抑制作用

挑取經(jīng)生防菌抑制的番茄早疫病菌菌絲在顯微鏡下觀察，生防菌LHS11使菌絲膨大變粗(圖1-C3)。菌株FX2使菌絲中膨大出球形節(jié)點，有的細胞中看不到細胞質(zhì)，僅剩細胞壁(圖1-C2)。對照番茄早疫病菌菌絲呈均勻絲狀，纖細，表面光滑(圖1-C1)。

2.4 菌株拮抗反應測試

在1 d后觀察發(fā)現(xiàn)無抑菌圈，且細菌生長良好，說明優(yōu)良生防菌LHS11和FX2之間可以共存，沒有拮抗作用。

3 討論

隨著人們對環(huán)境和食品安全要求的提高，對植物病害防治提出了新的要求，研制開發(fā)無污染、低殘留、環(huán)境和諧型的生物農(nóng)藥已經(jīng)成為農(nóng)藥發(fā)展新的熱點。李振東等[16]研究發(fā)現(xiàn)，莫海威芽孢桿菌Z17對8種病害的抑菌帶寬均>5 mm，其中，對番茄早疫病菌的抑菌帶寬達到8 mm。何建清等[17]研究發(fā)現(xiàn)放線菌10-4對番茄早疫病菌的抑制率達到93.1%，其發(fā)酵原液和5倍稀釋液在活體植株上對番茄早疫病的防治效果分別達到77.2%和70.9%，并且對小麥根腐病菌、稻瘟病菌、立枯絲核菌、小麥全蝕病菌、蘋果炭疽病菌和玉米大斑病菌的生長抑制率均達到90%以上。試驗篩選得到生防活性較好的菌株LHS11和FX2，其中，F(xiàn)X2的抑菌活性較好，抑制率為70.52%。2株生防菌的發(fā)酵液對病原菌均表現(xiàn)出抑菌能力，其中，菌株LHS11的抑制率為65.40%。前期工作還發(fā)現(xiàn)菌株LHS11和FX2對尖孢鐮刀菌、油菜菌核病菌、小麥長蠕孢、黃瓜枯萎病和立枯絲核菌也有很好的抑菌活性。因此，菌株LHS11和FX2具有良好的應用潛力和前景。

生防菌防治植物病害的作用機制主要有營養(yǎng)和空間位點的競爭、分泌抗菌物質(zhì)、寄生和誘導植物體抗性。任璐等[18]研究發(fā)現(xiàn)，植物內(nèi)生細菌yc8發(fā)酵液對番茄早疫病菌孢子萌發(fā)有較強的抑制作用，發(fā)酵液處理后可造成病原菌細胞畸形，胞內(nèi)物質(zhì)外泄和細胞壁崩潰。馬桂珍等[19]研究發(fā)現(xiàn)，多粘類芽孢桿菌L1-9菌株的發(fā)酵液和無菌發(fā)酵液能明顯降低番茄早疫病菌的孢子萌發(fā)率并抑制芽管的伸長，并且發(fā)酵液的抑制作用高于無菌發(fā)酵液。試驗發(fā)現(xiàn)生防菌LHS11使番茄早疫病菌菌絲膨大變粗，菌株FX2使病原菌菌絲中膨大出球形節(jié)點，有的細胞中看不到細胞質(zhì)，僅剩細胞壁。本研究主要從對病原菌菌絲形態(tài)的影響及其分泌抗菌物質(zhì)的角度對生防菌抑菌機理進行初步探索，對菌株后續(xù)的研究有一定的參考價值。至于其是否還存在其他的作用機制還有待于進一步的研究探索。

為了進一步明確PGPR菌對番茄早疫病菌的防效以及對植株的促生作用，還可通過盆栽試驗和大田試驗測定優(yōu)良生防菌的防病能力。梁建根等[20]篩選得到生防能力較好的菌株，在盆栽試驗中研究發(fā)現(xiàn)，PGPR菌均能促進植物的生長，也能防止病害的發(fā)生。李志新等[21]用兩種PGPR菌劑不同接種劑型處理油菜，發(fā)現(xiàn)PGPR菌劑能明顯增加油菜的單株有效角果數(shù)，還能降低油菜菌核病的發(fā)病率。一些學者發(fā)現(xiàn)施用PGPR菌肥也可促進農(nóng)作物根長、根系干重及根體積等根系性狀的改善[22，23]。大多數(shù)的研究表明，混配制劑提高了生物防治的效果，但前提是拮抗同一病原菌的生防菌組合間表現(xiàn)為親和性。試驗中篩選得到的優(yōu)良生防菌LHS11和FX2之間無拮抗反應，在后續(xù)工作中可通過混配防治病害，為盆栽試驗和大田試驗奠定基礎。

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Screening of bacteria antagonizingAlternariasolaniand its inhibitory effects

SUN Guang-zheng1，HOU Dong2，YUE Hong-zhong2，ZHAO Gui-qin1，YAO Tuo1，CHAI Xiao-hong1，CHEN Long1

(1.CollegeofPrataculturalScience,GansuAgriculturalUniversity/KeyLaboratoryofGrasslandEcosystem，MinistryofEducation/PrataculturalEngineeringLaboratoryofGansuProvince/Sino-U.S.CentersforGrazinglandEcosystemSustainability,Lanzhou730070,China；2.KeyLaboratoryofGrasslandEcosystem,MinistryofEducation,Lanzhou730070,China)

Seventeen strains of plant growth promoting rhizobacteria (PGPR) acquired from the preliminary studies were used to study their antagonistic effects on pathogenic fungi and the inhibition of mycelial growth in order to obtain biocontrol agents for promoting plant growth and also preventAlternariasolani,and to clarify the inhibitory efficiency of agents by panel confrontation method.The results showed that two strains efficiently antagonizedAlternariasolani,the inhibition rate of strain FX2 was higher which could reach 70.52% and LHS11 65.34%.FX2 and LHS11 could prevent disease by secondary metabolites,the inhibition rate of the fermentation solution of LHS11 reached 65.40%.The strains FX2 and LHS11 could make the mycelial twist and deformation at different degrees.

Alternariasolani；plant growth promoting rhizobacteria (PGPR)；biocontrol；mechanism

2014-08-21；

2014-10-14

公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項經(jīng)費(201303112)和現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術體系(CARS-08-C)資助

孫廣正 (1988-)，男，甘肅慶陽人，在讀碩士研究生。 E-mail：sunfanfan885@163.com 姚拓為通訊作者。

S 431

A

1009-5500(2015)01-0032-06