秀 花

(西藏農(nóng)牧科學(xué)院 草業(yè)科學(xué)研究所，西藏 拉薩 850009)

不同放牧強(qiáng)度下冰草自然居群的遺傳多樣性分析

秀 花

(西藏農(nóng)牧科學(xué)院 草業(yè)科學(xué)研究所，西藏 拉薩 850009)

采用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)不同放牧強(qiáng)度下冰草自然居群的遺傳多樣性進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，放牧導(dǎo)致冰草部分位點(diǎn)丟失，但整個(gè)冰草居群仍表現(xiàn)出豐富的多態(tài)性，ISSR檢測(cè)的多態(tài)性條帶比率為96.46%，居群間的遺傳差異很小，放牧并未使冰草居群產(chǎn)生遺傳分化。由Shannon’s和Nei’多樣性指數(shù)檢測(cè)的各個(gè)引物在4個(gè)冰草居群內(nèi)的遺傳多樣性的大小排列順序?yàn)椋褐卸确拍翗拥?重度放牧樣地>無(wú)放牧樣地>輕度放牧樣地。

冰草居群；ISSR；放牧強(qiáng)度；遺傳多樣性

冰草屬(Agropyron)為禾本科早熟禾亞科大麥族小麥亞族植物。全世界近百種，我國(guó)共有15種，主要分布?xì)W亞大陸溫帶、北美大草原、美國(guó)、加拿大。在歐亞大陸中，俄國(guó)、蒙古、和中國(guó)北部最為豐富，是典型草原、荒漠草原和草原地區(qū)沙地及西北半農(nóng)半牧區(qū)的常見(jiàn)牧草。

冰草屬于優(yōu)等牧草，具有抗旱、耐寒、耐堿、耐踐踏、壽命長(zhǎng)、分蘗能力強(qiáng)等特性，營(yíng)養(yǎng)豐富，抽穗期營(yíng)養(yǎng)價(jià)值最高，消化率高，草質(zhì)柔軟、適口性良好，在冬春飼草缺乏起著重要的作用。是放牧和打草兼用型牧草，并已廣泛馴化栽培作為草地補(bǔ)播草種。

有關(guān)冰草遺傳多樣性的研究報(bào)道很多，閻貴興[1]發(fā)現(xiàn)冰草屬植物不同種間存在核型多型性；云錦鳳等[2]對(duì)蒙古冰草B染色體進(jìn)行了分析；解新民[3]對(duì)蒙古冰草遺傳多樣性研究結(jié)果表明，蒙古冰草種內(nèi)居群間及同一居群內(nèi)的不同個(gè)體間存在豐富的多樣性；李景欣等[4]利用根尖壓片法，從細(xì)胞水平對(duì)來(lái)自6個(gè)不同居群的冰草的遺傳多樣性進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，冰草種內(nèi)居群間存在一定程度的分化和變異，一些北美國(guó)家有關(guān)冰草的研究，主要側(cè)重其生態(tài)建設(shè)、耐牧性及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的運(yùn)輸和儲(chǔ)存等。近年來(lái)，ISSR分析技術(shù)在品種鑒定和種質(zhì)資源的遺傳多樣性研究中得到廣泛應(yīng)用，有關(guān)冰草不同放牧強(qiáng)度下遺傳多樣性的研究報(bào)道較少，試驗(yàn)應(yīng)用ISSR分析技術(shù)對(duì)不同放牧強(qiáng)度下的冰草遺傳多樣性及其分化進(jìn)行研究，并為探索合理的放牧制度和草地利用方式，防止草原放牧和放牧草原的恢復(fù)提供理論基礎(chǔ)，為篩選耐牧基因提供遺傳學(xué)信息。

1 材料和方法

在植物生長(zhǎng)旺盛期按株采集冰草(Agroptroncristatum)新鮮葉片。株距50 m以上，選擇株叢徑中等、生長(zhǎng)正常的植株30株，剪去葉片，用保鮮膜包好放入冰盒帶回實(shí)驗(yàn)室，貯存于-20 ℃冰箱備用。

1.1 試驗(yàn)地自然概況

試驗(yàn)地位于內(nèi)蒙古自治區(qū)赤峰市克什克騰旗達(dá)里諾爾國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)境內(nèi)砧子山以東，N 116°381′～116°411′，E 43°251′～43°271′，氣候?qū)儆谥袦匦痛箨懶詺夂?，年平均氣溫?～2 ℃，≥10 ℃積溫1 300～1 700 ℃，年降水量350～400 mm,無(wú)霜期為60～80 d,植物生長(zhǎng)期4～9月,土壤類型為暗栗鈣土。

草原群落隨放牧強(qiáng)度的變化，在居民點(diǎn)或家畜飲水點(diǎn)周圍相繼分布的環(huán)狀帶上最明顯，即由此向外輻射，沿半徑方向構(gòu)成草原群落的放牧梯度，因此，在試驗(yàn)區(qū)以居民點(diǎn)為一端，沿草原群落變化的方向設(shè)置樣帶。按照放牧草原分級(jí)方法，將草地劃分為輕度放牧樣地、中度放牧樣地、重度放牧樣地和無(wú)放牧樣地(夏季無(wú)放牧的圍封區(qū))。

1.2 DNA的提取與檢測(cè)

稱取0.25 g新鮮葉片。采用CTAB法提取每個(gè)植株的總DNA，用0.7%的瓊脂糖電泳檢測(cè)DNA質(zhì)量， DNA的純度和濃度通過(guò)紫外吸收法測(cè)定。

1.3 ISSR反應(yīng)條件及程序

PCR反應(yīng)體系的建立主要通過(guò)對(duì)DNA濃度、引物等條件進(jìn)行初步的調(diào)整，達(dá)到了反應(yīng)條件的優(yōu)化，確定了ISSR擴(kuò)增反應(yīng)總體積為25 μL,反應(yīng)體系：其中，包括10×buffer 2.5 μL,2.0 mmol/L MgCl22 μL,0.1 mmol/L dNTPs 0.4 μL,0.15 mmol/L ISSR引物1 μL,40 ng基因組DNA,1單位TapDNA聚合酶。以上各種加完后用滅菌三蒸水補(bǔ)齊至25 μL。

擴(kuò)增在PE9600型PCR儀上進(jìn)行。擴(kuò)增程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性5 min,94 ℃變性45 s,54 ℃退火1 min,72 ℃延伸1.5 min,進(jìn)行44個(gè)循環(huán),最后72 ℃補(bǔ)平5 min,4 ℃停止。擴(kuò)增產(chǎn)物用2.8%瓊脂糖凝膠(內(nèi)含溴化乙錠)電泳鑒定，電泳1.5～2.0 h，將凝膠放在自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)下進(jìn)行分析。

1.4 引物篩選

以無(wú)放牧樣地的冰草DNA為材料，對(duì)30個(gè)ISSR引物進(jìn)行篩選，篩選出12個(gè)擴(kuò)增條帶較多、信號(hào)強(qiáng)、背景清晰的引物用于ISSR-PCR反應(yīng)。引物由上海生物工程公司合成(表1)。

表1 ISSR所用引物序列與序號(hào)Table1 Primer sequence and serial number adopted ISSR

1.5 擴(kuò)增產(chǎn)物和差異帶的分析方法

1.5.1 帶的記錄 電泳圖的每一條帶(DNA片段)，均為一個(gè)分子標(biāo)記(Marker)，代表一個(gè)引物的結(jié)合位點(diǎn)。根據(jù)各分子標(biāo)記的遷移率及其有無(wú)統(tǒng)計(jì)所有的二元數(shù)據(jù)；有帶(顯性)記作1，無(wú)帶(隱性)記作0，強(qiáng)帶和弱帶的賦值均為1。

1.5.2 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析法 應(yīng)用POPGEN32軟件對(duì)冰草種間遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，計(jì)算Nei基因多樣性指數(shù)(H)，Shannon表型信息指數(shù)(I)，群體分化系數(shù)(Gst)等；根據(jù)Nei遺傳距離用類平均聚類方法(UPGMA)進(jìn)行系統(tǒng)聚類，分析群體間遺傳分化關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 多態(tài)位點(diǎn)比率

表2列出了在4個(gè)冰草居群中檢測(cè)到的多態(tài)位點(diǎn)數(shù)及百分率。在無(wú)放牧居群中共檢測(cè)到105個(gè)位點(diǎn)，其中，多態(tài)位點(diǎn)82個(gè)，占71.93%；在輕度放牧居群中共檢測(cè)到93個(gè)位點(diǎn)，其中，多態(tài)位點(diǎn)69個(gè)，占60.53%；中度放牧居群中檢測(cè)到106個(gè)位點(diǎn)，其中多態(tài)位點(diǎn)90個(gè)，占78.95%；重度放牧居群中檢測(cè)到98個(gè)位點(diǎn)，其中多態(tài)位點(diǎn)77個(gè)，占67.54%。在冰草種內(nèi)檢測(cè)到114個(gè)位點(diǎn)，多態(tài)位點(diǎn)110個(gè)，占96.49%。多態(tài)位點(diǎn)在居群內(nèi)從大到小的分布是中度放牧>無(wú)放牧>重度放牧>輕度放牧居群。每一個(gè)引物擴(kuò)增出的DNA帶的數(shù)目在2～12，擴(kuò)增出的DNA帶的大小在300～1 500 bp之間。

表2 4個(gè)冰草放牧系列居群的多態(tài)位點(diǎn)比較Table2 Polymorphic loci comparison between 4 grazing series populations of Agroptron cristatum

2.2 遺傳多樣性分析

利用Shannon’s指數(shù)，根據(jù)每個(gè)引物在不同居群擴(kuò)增的ISSR表型結(jié)果的差異和出現(xiàn)的頻率不同，計(jì)算冰草居群遺傳多樣性并列于表3，由表3可以看出，同一引物在不同居群中估計(jì)的遺傳多樣性指數(shù)不同；不同引物在同一居群內(nèi)所估算的數(shù)值也不相同。其中，引物36541在中度放牧居群中故測(cè)的數(shù)值最高為0.608 3，引物31672在輕度放牧居群中故測(cè)的最低為0.062 1，Shannon’s指數(shù)故測(cè)的4個(gè)冰草居群內(nèi)的遺傳多樣性由大到小的順序?yàn)橹卸确拍辆尤?0.455 5)>重度放牧居群(0.388 9)>無(wú)放牧居群(0.382 6)>輕度放牧居群(0.322 6)。

根據(jù)表4，引物31669估算的居群內(nèi)遺傳多樣性(Hpop)最高(0.459 2)，引物31675估算的居群內(nèi)遺傳多樣性最小，只有0.248 2，12個(gè)引物估算的居群內(nèi)遺傳多樣性平均是0.387 4；對(duì)種內(nèi)總的遺傳多樣性(Hsp)的估算，引物22893估算數(shù)值最高0.587 9，引物31 675估算數(shù)值最低0.333 8，平均值為0.517 5。

由Shannon’s指數(shù)估計(jì)的居群內(nèi)遺傳多樣性在引物31 676中最大為87.73%，引物31674最小為63.23%，居群內(nèi)遺傳多樣性平均值為74.86%，居群間遺傳多樣性從12.27%(引物31676)到36.77%(引物31674)，居群間遺傳分化的平均值為25.14%。說(shuō)明放牧干擾對(duì)冰草居群的分化程度有所影響，但是，由于不同放牧居群所處的地理自然環(huán)境相同，居群之間并未產(chǎn)生隔離，仍存在基因交流，因而沒(méi)有哪個(gè)居群擁有特有的位點(diǎn)或等位基因。但是，并非所有等位基因在不同居群均有分布，有的位點(diǎn)在不同的居群上有丟失現(xiàn)象。

表3 Shannon’s指數(shù)估算的4個(gè)冰草居群內(nèi)的遺傳多樣性Table3 Genetic diversity of 4 Agroptron cristatum populations estimated by Shannon`s index

表4 Shannon’s 多樣性指數(shù)估算的居群內(nèi)、居群間遺傳多樣性及分化Table4 Genetic diversity and differentiation in population and among populations estimated by Shannon`s index

由Nei’s指數(shù)估算的各個(gè)引物在4個(gè)冰草居群內(nèi)的遺傳多樣性(表5)檢測(cè)中，引物36541在中度放牧居群中估測(cè)的數(shù)值最高為0.419 6，引物31672在輕度放牧居群中估測(cè)的數(shù)值最低為0.042 1，遺傳多樣性在中度放牧居群最高(0.311 3)，輕度放牧居群最低(0.217 0)，按遺傳多樣性的大小排列各居群順序?yàn)椋褐卸确拍辆尤?0.311 3)>重度放牧居群(0.263 7)>無(wú)放牧居群(0.255 8)>輕度放牧居群(0.217 0),這與Shannon’s多樣性指數(shù)檢測(cè)的遺傳多樣性指數(shù)一致。

表5 Nei’s指數(shù)估計(jì)的4個(gè)冰草居群內(nèi)的遺傳多樣性Table5 Genetic diversity of 4 Agroptron cristatum populations estimated by Nei’s index

2.3 遺傳結(jié)構(gòu)與基因流

植物的基因型在居群內(nèi)和居群間不隨機(jī)分布，在不同居群之間，同一居群的不同亞居群之間，甚至在同一個(gè)體的不同后代之間都存在顯著的遺傳差異。根據(jù)表6，Nei’s指數(shù)計(jì)算的冰草種內(nèi)總遺傳多樣性的平均值為0.348 9，居群內(nèi)遺傳多樣性平均值為0.261 9，居群間的遺傳分化為21.95%，說(shuō)明有21.95%的遺傳變異存在于居群之間，78.05%的遺傳變異存在于居群內(nèi)。不同引物所占的比例不同，其中，引物36543最高為34.47%，引物31667最低為11.80%，各個(gè)引物的Nm值差異較大，從11.283 4到1.501 8不等，平均值為4.080 8。

表6 Nei’s指數(shù)估算的居群內(nèi)、居群間遺傳多樣性及分化Table6 Genetic diversity and differentiation in population and among populations estimated by Nei’s index

2.4 遺傳距離與遺傳相似度分析

根據(jù)12個(gè)引物ISSR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果，按Nei方法計(jì)算出4個(gè)不同放牧強(qiáng)度冰草居群的遺傳距離和遺傳相似度。輕度放牧居群和重度放牧居群遺傳距離最遠(yuǎn)，為0.221 9，遺傳相似度最小0.801 0，這表明兩者之間的遺傳差異最大；中度放牧居群和無(wú)放牧居群遺傳距離最近0.118 6；遺傳相似度最高0.888 2，說(shuō)明這輛個(gè)居群的遺傳差異最小(表7)。

表7 4個(gè)放牧系列冰草的遺傳相似度及遺傳距離Table7 Genetic similarity and genetic distance between 4 grazing series populations of Agroptron cristatum

注:星號(hào)為對(duì)角線

圖1是根據(jù)遺傳距離所構(gòu)建的UPGMA聚類圖，圖中無(wú)放牧居群和中度放牧居群首先聚為一類，其次，輕度放牧居群和無(wú)放牧居群、中度放牧居群聚為一類，最后，重度放牧居群和其他3個(gè)居群聚為一類，這說(shuō)明無(wú)放牧居群和中度放牧居群遺傳差異最小，中度放牧居群和其他3個(gè)居群的遺傳差異大一些(圖2)。

圖1 不同放牧強(qiáng)度冰草居群ISSR分析的UPGMA聚類圖Fig.1 UPGMA dendrogram of Agroptron cristatum population ISSR analysis under different grazing intensities

3 討論

植物居群遺傳變異水平和遺傳結(jié)構(gòu)與其適應(yīng)性和進(jìn)化潛力密切相關(guān)。個(gè)體的遺傳變異、居群的遺傳分化保證了植物對(duì)異質(zhì)環(huán)境的適應(yīng)，利于居群的生存繁衍。

張紅梅[8]在研究未放牧利用的居群和長(zhǎng)期放牧后又圍封的居群中發(fā)現(xiàn)，放牧壓力使大針茅居群的少數(shù)位點(diǎn)缺失、突變，同時(shí)有新的位點(diǎn)出現(xiàn)，但居群間的遺傳差異很小，放牧未使大針茅產(chǎn)生遺傳分化。試驗(yàn)通過(guò)ISSR分子標(biāo)記分析結(jié)果也表明不同放牧壓力下，冰草居群的Nei’s指數(shù)和Shannon’s指數(shù)的估算都顯示出大量的分子變異存在于冰草居群內(nèi)部，少量存在于居群間，說(shuō)明不同放牧壓力下的4個(gè)居群具有很相似的基因頻率，由于不同放牧居群之間并未產(chǎn)生生境隔離，居群之間仍存在基因交流，因而居群間未產(chǎn)生明顯的分化。但是，并非所有等位基因在不同居群均有分布，有的位點(diǎn)在不同的居群上有丟失現(xiàn)象。ISSR的結(jié)果分析中，由Shannon’s多樣性指數(shù)估計(jì)的各個(gè)引物在4個(gè)冰草居群內(nèi)的遺傳多樣性的大小排列順序?yàn)椋褐卸确拍翗拥?重度放牧樣地>無(wú)放牧樣地>輕度放牧樣地,這與Nei’s指數(shù)檢測(cè)的遺傳多樣性順序一致，這也許說(shuō)明適度放牧利用對(duì)冰草遺傳多樣性有促進(jìn)作用。

圖2 冰草居群ISSR擴(kuò)增圖Fig. 2 ISSR amplified map of Agroptron cristatum

注：A.引物W31673在無(wú)放牧居群擴(kuò)增譜帶；B.引物W31673在輕度放牧居群擴(kuò)增譜帶；C.引物W31673在中度放牧居群擴(kuò)增譜帶；D.引物W31673在重度放牧居群擴(kuò)增譜帶

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Study on ISSR ofAgroptroncristatumat different grazing gradients

Xiuhua

(InstituteofPrataculturalScience,TibetAcademyofAgricultureandAnimalHusandryScience,Lhasa850009,China)

The genetic diversity ofAgropyroncristatumunder different grazing intensity was studied with ISSR molecular marker technology. The results showed that although some polymorphic loci were missed due to grazing, the whole wheatgrass population still exhibited the rich polymorphism. Polymorphicbands ratio detected with ISSR was 96.46%, the genetic differences among populations was small, grazing did not produce genetic differentiation. Genetic diversity of each prime in 4 wheatgrass populations estimated by Shannon’s and Nei’s diversity index was: moderate grazing>severe grazing>banning grazing>light grazing.

Agropyroncristatum; ISSR;grazing;genetic diversity

2014-11-29；

2015-01-05

西藏牧區(qū)“生產(chǎn)、生態(tài)、生活”保障技術(shù)集成與示范項(xiàng)目(2012BAD13B04)資助

秀花(1977-)，女，內(nèi)蒙古人，助理研究員，碩士，從事草地生態(tài)和管理工作。 E-mail：xiuhua621@163.com

Q 786

A

1009-5500(2015)01-0009-07