顧 云，曹曉云

(天津市藥品檢驗所，天津 300070)

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HPLC法測定土霉素二水物的有關(guān)物質(zhì)的方法研究*

顧 云，曹曉云

(天津市藥品檢驗所，天津 300070)

目的：建立HPLC法測定土霉素二水物的有關(guān)物質(zhì)。方法：色譜柱為XDB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相為醋酸銨溶液[0.25 mol/L醋酸銨溶液-0.05 mol/L乙二胺四醋酸二鈉溶液-三乙胺(100∶10∶1)，用醋酸調(diào)節(jié)pH至7.5]-乙腈(88∶12)，流速：1.0 ml/min，紫外檢測波長：280 nm，柱溫：30 ℃，進(jìn)樣量：10 μl。 結(jié)果：土霉素在0.25～15 μg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r=0.999 95)，最低檢出限為 0.1 μg/ml。結(jié)論：本方法專屬性強、靈敏度高、準(zhǔn)確度和重復(fù)性好、方法簡便，可作為土霉素有關(guān)物質(zhì)的檢測方法。

HPLC，有關(guān)物質(zhì)，土霉素二水物

土霉素二水物[1]屬四環(huán)素類抗生素藥，對革蘭陰性菌和革蘭陽性菌均有抑制作用，同時對立克次體、螺旋體及某些原蟲等也具有抑制作用。為更好地控制土霉素二水物的質(zhì)量，采用HPLC法測定土霉素二水物有關(guān)物質(zhì)，該方法專屬性強、靈敏度高、準(zhǔn)確度和重復(fù)性好、方法簡便，可作為土霉素有關(guān)物質(zhì)的檢測方法。

1 儀器與試藥

LC-2010 cLass-vp型高效液相色譜儀(日本島津公司)，AG245型電子天平，PB-10型精密pH計(塞多利斯公司)，恒溫干燥箱DN64(日本Uamato)，紫外線殺菌車DZS3型(上海科凌醫(yī)療器械有限公司)。土霉素樣品(河北圣雪大誠制藥有限公司，批號T3-11314417-3、T3-11301416-3、T3-11319424-3)，土霉素對照品( 批號130487-200302，中國藥品生物制品檢定所提供，88.2%)。4-差向四環(huán)素對照品(批號130401-200209，中國藥品生物制品檢定所提供)。乙腈、甲醇為色譜純，水為凈化水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：XDB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相：醋酸銨溶液[0.25 mol/L醋酸銨溶液-0.05 mol/L乙二胺四醋酸二鈉溶液-三乙胺(100∶10∶1)，用醋酸調(diào)節(jié)pH至7.5]-乙腈(88∶12)，流速：1.0 ml/min，柱溫：30 ℃，紫外檢測波長：280 nm，進(jìn)樣量：10 μl。

2.2 溶液制備

2.2.1 供試品溶液 取本品適量，用0.01 mol/L鹽酸溶解并定量稀釋制成每1 ml中約含0.5 mg的溶液，作為供試品溶液。

2.2.2 對照溶液 精密量取供試品溶液2 ml，置100 ml量瓶中，用0.01 mol/L鹽酸溶解并定量稀釋至刻度，作為對照溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗 取4-差向四環(huán)素對照品適量，加0.01 mol/L鹽酸溶解并定量稀釋制成每1 ml中約含0.5 mg的溶液；取土霉素素對照品適量，加0.01 mol/L鹽酸溶解并定量稀釋制成每1 ml中約含0.5 mg的溶液；取上述兩種溶液(1∶24)混合，作為分離度測試溶液。取該溶液10 μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按4-差向四環(huán)素峰(與土霉素色譜峰相對保留時間約為0.9)、土霉素峰、2-乙酰-2-去酰胺土霉素峰(與土霉素色譜峰相對保留時間約為1.1)的順序出峰。4-差向四環(huán)素與土霉素峰分離度應(yīng)不小于2.0，土霉素峰與2-乙酰-2-去酰胺土霉素峰的分離度應(yīng)不小于2.5[2]。見圖1。

2.4 專屬性試驗 取樣品約25 mg，置50 ml量瓶中，共6份，分別按以下條件操作。①酸破壞：加1 mol/L鹽酸溶液2 ml，于60 ℃水浴中加熱20 min，取出，立即加1 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)pH值至中性；②堿破壞：加1 mol/L氫氧化鈉溶液2 ml，室溫放置20 min，取出，立即加1 mol/L鹽酸溶液調(diào)pH值至中性；③氧化破壞：加30%過氧化氫溶液0.5 ml，室溫放置20 min；④加熱破壞：置105 ℃烤箱中加熱2 h；⑤光照破壞：強光4 000 lx照射48 h(距光源約5 cm高度)；⑥紫外光照破壞：紫外燈(254 nm)照射6 h(距光源約15 cm高度)。取上述樣品依法操作，加0.01 mol/L HCl溶液稀釋至刻度，搖勻，精密量取10 μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖(見圖2)。結(jié)果表明：雜質(zhì)峰之間、雜質(zhì)與主峰之間均能分離良好，本方法專屬性較好。

1. 4-差向四環(huán)素 2. 土霉素

2.5 最小檢出限 用逐步稀釋法，按信噪比3∶1計算，該方法的最小檢測限為0.1 μg/ml，最小定量限為

0.2 μg/ml。

2.6 線性范圍 取土霉素供試品(批號T3-11314417-3)加0.01 mol/L的鹽酸溶液定量制成每1 ml中含50 μg的溶液，分別精密量取適量，加0.01 mol/L的鹽酸溶液定量制成每1 ml中含0.25、2.5、5、10和15 μg的溶液。依法測定，以峰面積對濃度進(jìn)行線性回歸，回歸方程為：Y=12 444X-494.26(r=0.999 95)，結(jié)果在0.25～15 μg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗 取樣品測定項下供試品溶液(批號T3-11314417-3)分別于室溫放置0、1、2、4、6、8和24 h后進(jìn)行測定，結(jié)果RSD為1.61%，表明供試品溶液室溫放置24 h穩(wěn)定。

2.8 有關(guān)物質(zhì)的相關(guān)性 本方法進(jìn)行了相關(guān)性考查試驗，供試品溶液配制的稱重在25～75 mg時，與有關(guān)物質(zhì)測定之間有良好的相關(guān)性。

2.9 方法的粗放度 本方法用不同型號色譜柱測定同批樣品(批號T3-11314417-3)有關(guān)物質(zhì)，① Agilent XDB-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)、②Ultimate XB-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)、③Syncronis C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，在相同的色譜條件下，測定結(jié)果基本一致，本方法耐用性良好，可以作為控制土霉素質(zhì)量的有效手段。見表1和表2。

1. 4-差向四環(huán)素 2. 土霉素 3. 2-乙酰-2-去酰胺土霉素 4. 四環(huán)素

2.10 有關(guān)物質(zhì)的測定 取“2.2.1”和“2.2.2”項下的供試品溶液和對照溶液、 “2.3” 項下系統(tǒng)適用性試驗溶液。取對照溶液10 μl注入液相色譜儀，其峰能檢出(即信噪比大于10)。再精密量取供試品溶液和對照溶液各10 μl分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖至主成分峰保留時間的4倍，供試品溶液色譜圖中如有雜質(zhì)峰， 2-乙酰-2-去酰胺土霉素雜質(zhì)峰面積不得大于對照溶液主峰面積的1.75倍(3.5%)，其他各雜質(zhì)峰峰面積的和不得大于對照溶液主峰面積(2.0%)。三批樣品測定結(jié)果見表3。

表1 分離度測試溶液

表2 樣品測定

表3 有關(guān)物質(zhì)檢查測定結(jié)果

3 討論

3.1 因土霉素破壞性試驗難以控制，參考國內(nèi)外相關(guān)資料[3]，土霉素的有關(guān)物質(zhì)采用主要雜質(zhì)對照品定位來控制?，F(xiàn)已定位的雜質(zhì)有：4-差向土霉素、4-差向四環(huán)素、四環(huán)素和2-乙酰-2-去酰胺土霉素(土霉素自身含的雜質(zhì)成分)。四環(huán)素和4-差向四環(huán)素的雜質(zhì)對照品均由中國藥品生物制品檢定所提供。4-差向土霉素雜質(zhì)對照品由廠家提供。而2-乙酰-2-去酰胺土霉素的雜質(zhì)，就是土霉素中的最大單一雜質(zhì)(參照《中國藥典》2010版二部鹽酸土霉素標(biāo)準(zhǔn)而定)，2-乙酰-2-去酰胺土霉素與土霉素主峰的相對保留時間約為1.1。未定位的雜質(zhì)有：α和β-阿撲土霉素。因為目前尚無純的α和β-阿撲土霉素雜質(zhì)對照品提供；且以廠家提供的α和β-阿撲土霉素的雜質(zhì)溶液，在分析條件下顯現(xiàn)微量、峰形差且重現(xiàn)性不好而不能確定，既然α和β-阿撲土霉素雜質(zhì)無法定位且微量，因此，如果檢品中出現(xiàn)α和β-阿撲土霉素的雜質(zhì)峰就按一般雜質(zhì)檢查，不另外再做其他研究。

3.2 由相關(guān)資料得出，各雜質(zhì)校正因子為：2-乙酰-2-去酰胺土霉素斜率/鹽酸土霉素=0.92；鹽酸四環(huán)素斜率/鹽酸土霉素=1.01；其校正系數(shù)均在0.8～1.1之間，因此，無需采用雜質(zhì)校正因子。所以，土霉素也采用不加雜質(zhì)校正因子，以自身對照作為有關(guān)物質(zhì)檢查的方法。

3.3 本方法是采用高效液相色譜法來測定有關(guān)物質(zhì)，其結(jié)果可靠，經(jīng)方法學(xué)驗證，此方法專屬性強、靈敏度高、準(zhǔn)確度和重復(fù)性好，可作為土霉素的有關(guān)物質(zhì)的檢測方法。

1 國際藥典[S].2011：1-3

2 中國藥典[S]. 二部.2010:635-636

3 英國藥典[S].2011：1635-1636，3078-3079

2014-09-19

R927.11

A

1006-5687(2015)02-0014-03