周 軍,張 茉,王 杰
(天津市藥品檢驗所,天津 300070)
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藥品質(zhì)量與檢驗
調(diào)經(jīng)益靈片質(zhì)量標準提高研究
周 軍,張 茉,王 杰
(天津市藥品檢驗所,天津 300070)
目的:提高調(diào)經(jīng)益靈片的質(zhì)量標準。方法:采用薄層色譜法對制劑中的當歸、川芎、香附、青蒿進行定性鑒別,采用高效液相色譜法測定了α-香附酮的含量。結(jié)果:薄層色譜中的特征斑點明顯。α-香附酮在0.036 5~2.736 μg線性關(guān)系良好, 平均回收率為97.25 %, RSD為0.59 %(n=6)。結(jié)論:本法專屬性強、準確、快速,可以作為該產(chǎn)品的質(zhì)量控制方法。
調(diào)經(jīng)益靈片,當歸,川芎,香附,青蒿,白芍,牡丹皮,薄層色譜,α-香附酮,高效液相色譜法
調(diào)經(jīng)益靈片是由香附、當歸、川芎、白芍、青蒿、牡丹皮等13味藥材制成的中藥片劑,具有調(diào)經(jīng)養(yǎng)血,開郁舒氣的功效,用于婦人血虛氣滯、腰酸腹痛、月經(jīng)不調(diào)、赤白帶下等各種婦科病。湖南德康制藥股份有限公司生產(chǎn)的樣品質(zhì)量標準為《國家食品藥品監(jiān)督管理局標準(試行)》(YBH05342004),標準中包括顯微鑒別、薄層鑒別(當歸、川芎、香附、青蒿、白芍)及白芍(芍藥苷)的HPLC含量測定;天津市力生制藥股份有限公司生產(chǎn)的樣品質(zhì)量標準為《衛(wèi)生部藥品標準中藥成方制劑第十九冊》(WS3-B-3669-98),標準中包括顯微鑒別、薄層鑒別(當歸、川芎)。調(diào)經(jīng)益靈片法定質(zhì)量標準存在標準不統(tǒng)一,鑒別項提取方法較為煩瑣、重現(xiàn)性差,未對處方中的君藥(香附)進行含量測定的缺點,不能有效控制藥品質(zhì)量。本實驗采用薄層色譜法對制劑中的當歸(川芎)、香附、青蒿進行了鑒別,并采用高效液相色譜法測定處方中的君藥香附中有效成分α-香附酮的含量,結(jié)果表明本法專屬性強、準確、快速,使產(chǎn)品的質(zhì)量得到有效的控制,保證了臨床療效。
1.1 儀器 島津LC-20AD高效液相色譜儀,配有LC-20AD 泵、SIL-20自動進樣器、SPD-20A紫外檢測器、CTO-20AC柱溫箱;LC-solution 色譜工作站;AS20500ADT 超聲波清洗機(360 W,AUTO SCIENCE科技有限公司);AG135 型電子天平(梅特勒-托利多公司);硅膠G 薄層板(青島海洋化工廠)。
1.2 試藥 調(diào)經(jīng)益靈片樣品:湖南德康制藥股份有限公司(批號091001、090201、090601,薄膜衣片),天津市力生制藥股份有限公司(批號0906001,糖衣片)。α-香附酮(批號110748-201111)、芍藥苷(批號110736-201136)、丹皮酚(批號110708-200506)、當歸(批號120927-201014)、川芎(批號120918-201110)、青蒿(批號121016-201004),均由中國食品藥品檢定研究院提供。甲醇為色譜純,乙醚、乙酸乙酯、正丁醇、正己烷、環(huán)己烷、甲苯、冰醋酸、三氯甲烷、甲酸、二硝基苯肼為分析純,水為去離子水。
2.1 當歸和川芎的薄層鑒別 取本品20 片,除去包衣,研細,加乙醇50 ml,超聲處理(功率350 W,頻率40 kHz)60 min,濾過,濾液低溫(40~60 ℃)蒸干,殘渣加水20 ml使溶解,用乙醚振搖提取2次,每次20 ml,合并乙醚液(水液備用),低溫蒸干,殘渣加甲醇1 ml使溶解,作為供試品溶液。另取當歸、川芎對照藥材各1 g,分別加乙醚10 ml,超聲處理10 min,濾過,濾液低溫蒸干,殘渣加甲醇1 ml使溶解,作為對照藥材溶液。再按處方配比,取處方藥材適量(當歸、川芎除外)制成陰性樣品,按照供試品溶液的方法提取,作為陰性對照溶液。照薄層色譜法(《中國藥典》2010年版一部附錄Ⅵ B)試驗,吸取上述四種溶液各6~10 μl,分別點于同一硅膠G薄層板上,以正己烷-乙酸乙酯(9∶1)為展開劑,展開,取出,晾干,置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中,在與對照藥材色譜相應的位置上,顯相同顏色的熒光斑點,陰性樣品無干擾。結(jié)果見圖1。
2.2 香附薄層鑒別 取“2.1”項下的供試品溶液,作為供試品溶液。另取α-香附酮對照品,加乙酸乙酯制成每1 ml含1 mg的溶液,作為對照品溶液。再按處方配比,取處方藥材適量(香附除外)制成陰性樣品,按照供試品項下的方法提取,作為陰性對照溶液。照薄層色譜法(《中國藥典》2010年版一部附錄Ⅵ B)[1]試驗,吸取供試品溶液、陰性樣品溶液各6~10 μl及對照品溶液2~4 μl,分別點于同一硅膠G薄層板上,以甲苯-乙酸乙酯-冰醋酸(92∶5∶5)為展開劑,取出,晾干,噴以二硝基苯肼試液。供試品色譜中,在與對照品色譜相應的位置上,顯相同顏色的斑點,陰性樣品無干擾。結(jié)果見圖2。
1.-陰性樣品 2.湖南樣品1 3.湖南樣品2
1.陰性樣品 2.湖南樣品1 3.湖南樣品2
2.3 青蒿薄層鑒別 取“2.1”項下乙醚提取后的水液,加乙酸乙酯提取2 次,每次20 ml,合并乙酸乙酯液(水液備用),蒸干,殘渣加甲醇1 ml使溶解,作為供試品溶液。另取青蒿對照藥材1 g,加甲醇10 ml,超聲處理20 min,濾過,濾液蒸干,殘渣加甲醇1 ml使溶解,作為對照藥材溶液。再按處方配比,取處方藥材適量(青蒿除外)制成陰性樣品,按照供試品項下的方法提取,作為陰性對照溶液。照薄層色譜法(《中國藥典》2010年版一部附錄Ⅵ B)試驗,吸取上述三種溶液各6~10 μl,分別點于同一高效硅膠G薄層板上,以環(huán)己烷-三氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸(6∶6∶7∶1.2)為展開劑,展開,取出,晾干,噴以10%硫酸乙醇,在105 ℃加熱10 min,置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中,在與對照藥材色譜相應的位置上,顯相同顏色的熒光斑點,陰性樣品無干擾。結(jié)果見圖3。
1.陰性樣品 2.湖南樣品1 3.湖南樣品2
2.4 白芍薄層鑒別 取“2.3”項下乙酸乙酯提取后的水液,加水飽和的正丁醇提取2 次,每次20 ml,合并正丁醇液,加氨試液洗滌2 次,每次20 ml,棄去氨試液,正丁醇液蒸干,殘渣加甲醇1 ml使溶解,作為供試品溶液。另取芍藥苷對照品,加甲醇制成每1 ml含1 mg的溶液,作為對照品溶液。再按處方配比,取處方藥材適量(白芍除外)制成陰性樣品,按照供試品項下的方法提取,作為陰性對照溶液。照薄層色譜法(《中國藥典》2010年版一部附錄Ⅵ B)試驗,吸取上述三種溶液各6~10 μl,分別點于同一高效硅膠G薄層板上,以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(40∶5∶10∶0.2)為展開劑,展開,取出,晾干,噴以5%香草醛硫酸溶液,在105 ℃加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜中,在與對照品色譜相應的位置上,顯相同顏色的斑點,陰性樣品無干擾[2]。結(jié)果見圖4。
1.陰性樣品 2.湖南樣品1 3.湖南樣品2 4.湖南樣品3 5.天津樣品 6.芍藥苷對照品
2.5 牡丹皮薄層鑒別 取本品適量,除去包衣,研細,取10 g,置圓底燒瓶中,加水100 ml,連接揮發(fā)油提取器,自測定器上端加水使充滿刻度,再加入石油醚(60~90 ℃)1 ml,緩緩加熱至沸,并保持微沸1 h,放冷,取石油醚液作為供試品溶液。另取丹皮酚對照品,加乙酸乙酯制成每1 ml含1 mg的溶液,作為對照品溶液。再按處方配比,取處方藥材適量(牡丹皮除外)制成陰性樣品,按照供試品項下的方法提取,作為陰性對照溶液。照薄層色譜法(《中國藥典》2010年版一部附錄Ⅵ B)試驗,吸取上述三種溶液各6~10 μl,分別點于同一高效硅膠G薄層板上,以環(huán)己烷-乙酸乙酯-冰醋酸(4∶1∶0.1)為展開劑,展開,取出,晾干,噴以5%三氯化鋁乙醇溶液,置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中,在與對照品色譜相應的位置上,顯相同顏色的熒光斑點,陰性樣品無干擾。結(jié)果見圖5。
1.陰性溶液 2.湖南樣品1 3.湖南樣品2 4.湖南樣品3 5.天津樣品 6.丹皮酚對照品
3.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗 資生堂 SPOLAR-C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)色譜柱;流動相:甲醇-水(75∶25);柱溫:40 ℃;流速:1.0 ml/min;檢測波長:250 nm。理論板數(shù)按α-香附酮峰計算應不低于5 000[3-5]。
3.2 溶液制備
3.2.1 對照品溶液的制備 取α-香附酮對照品適量,精密稱定,加甲醇制成每1 ml中含α-香附酮28 μg的溶液,即得。
3.2.2 供試品溶液的制備 取同一批號(091001)樣品適量,研細,取0.5 g,精密稱定,精密加入80%甲醇25 ml,稱定重量,超聲提取60 min,放冷,再稱定重量,用80%甲醇補足減失的重量,搖勻,用0.45 μm微孔濾膜濾過,進樣,測定,即得。
3.2.3 陰性樣品溶液的制備 按處方取除香附的各味藥材,按【制法】制得樣品,再按“3.2.2”項下供試品溶液制備方法,制得陰性樣品溶液。分別精密吸取對照品、供試品和陽性樣品溶液10 μl,依“3.1”項下色譜條件進樣,記錄色譜圖,陰性樣品無干擾,見圖1。
1.α-香附酮
3.3 標準曲線的制備 取α-香附酮對照品適量,精密稱定,加80%甲醇制成濃度為每1 ml中含α-香附酮3.648、7.296、18.24、36.48、91.20和273.60 μg的對照品溶液,分別精密吸取10 μl,注入液相色譜儀,按“3.1”項下色譜條件分析,分別測定各自峰面積,以對照品進樣量(μg)為橫坐標,峰面積值為縱坐標,得回歸方程:Y=-2 024.26+1 816 990.05X(r=0.999 9)。結(jié)果表明α-香附酮在0.036 5~2.736 μg范圍內(nèi)線性良好。
3.4 精密度試驗 取同一批(批號091001)適量,研細,取0.5 g,精密稱定,精密加入80%甲醇25 ml,按照“3.2.2”項下供試品溶液制備操作,按“3.1”項下色譜條件分析,連續(xù)進樣6次,測定α-香附酮峰面積,RSD為0.36%,符合要求。
3.5 重現(xiàn)性試驗 取同一批(批號091001)樣品適量,研細,取0.5 g,精密稱定,共6 份,分別精密加入80%甲醇25 ml,按照“3.2.2”項下供試品溶液制備操作,按“3.1”項下色譜條件分析,測定,樣品中α-香附酮的含量為1.359 6 mg/g,RSD為0.11%,符合要求。
3.6 穩(wěn)定性試驗 取同一批(批號091001)樣品適量,研細,取0.5 g,精密稱定,精密加入80%甲醇25 ml,按照“3.2.2”項下供試品溶液制備操作,按“3.1”項下色譜條件分別在0、2、4、8、12、16和24 h進樣測定,RSD為1.61%,符合要求。
3.7 回收率試驗 取同一批(批號091001)樣品適量,研細,取0.25 g,精密稱定,共6 份,分別精密加入每1 ml中含α-香附酮0.014 59 mg/ml的80%甲醇對照品溶液25 ml,按照“3.2.2”項下供試品溶液制備操作,制得供回收率用供試品溶液,按“3.1”項下色譜條件分析。計算回收率,結(jié)果α-香附酮平均回收率為97.25%,RSD為0.59%,結(jié)果見表1。
表1 α-香附酮回收率試驗結(jié)果
3.8 樣品測定 取兩個廠家4個不同批號的樣品,按照“3.2.2”項下供試品溶液制備操作,按“3.1”項下色譜條件分析,測定,計算樣品中α-香附酮的含量,見表2。
表2 樣品測定結(jié)果
4.1 在TLC鑒別試驗中根據(jù)被測定藥材中相應成分的性質(zhì)對提取方法進行科學合理的安排:①采用乙醇提取出主要成分后,先用乙醚提取低極性的成分(當歸、川芎、香附),再用乙酸乙酯提取極性相對較大的成分(青蒿),最后用正丁醇提取極性更大的成分(白芍);②牡丹皮的處方量較小,并且直接用乙醚提取部分作為供試品溶液,展開后樣品中存在其他雜質(zhì)嚴重干擾的情況;根據(jù)丹皮酚具有揮發(fā)性的特點,采用提取揮發(fā)油的方式進行提取,結(jié)果滿意。本文建立的薄層鑒別方法具有簡便、雜質(zhì)干擾小、重現(xiàn)性好的優(yōu)點。
4.2 在本實驗中建立的TLC鑒別方法,在不同品牌(青島、煙臺、默克)薄層板、室溫條件、低溫(≤10 ℃)、高濕(≥75 %)等影響因素下進行了耐用性試驗。結(jié)果顯示,上述因素對薄層鑒別效果均無顯著影響,表明本實驗建立的TLC方法可靠、穩(wěn)定。
4.3 HPLC分析中分別采用甲醇-水(70∶30)、甲醇-水(75∶25)與乙腈-水(70∶30)為流動相進行試驗[1-4]。結(jié)果,采用甲醇-水(75∶25)為流動相,供試品色譜中α-香附酮色譜峰與其他雜質(zhì)峰分離較好,且峰形對稱,故采用甲醇-水(75∶25)為流動相。
4.4 考查采用甲醇、90%甲醇、80%甲醇三種不同的提取溶劑[5-7],分別采用加熱回流提取及超聲提取,最后確定以80%甲醇為溶劑超聲處理提取較完全;經(jīng)考查不同的提取時間,結(jié)果超聲提取60 min樣品中α-香附酮的量最高。
4.5 經(jīng)測定兩個廠家的4批樣品,α-香附酮測定結(jié)果分別為0.417 9、0.032 3、0.173 5和0.312 0 mg/片,由測定值可以看出不同廠家和批號樣品中α-香附酮的量相差極大,因此增加α-香附酮的測定對控制調(diào)經(jīng)益靈片藥品的質(zhì)量有重要的意義。
4.6 文獻報道[8],測定調(diào)經(jīng)益靈片中α-香附酮的方法是采用揮發(fā)油提取器提取后再進行測定,提取方法煩瑣、費時,本文采用的方法專屬性強、準確、快速,使產(chǎn)品的質(zhì)量得到有效的控制,保證了臨床療效。
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2014-10-23
R927.11
A
1006-5687(2015)02-0010-04