許 言， 萬(wàn)宗喆， 方佳楠， 寶力格， 蕭 蕭， 宋 紅， 王 玲， 陳恒利， 彭宏梅， 范麗娟*

(1.東北林業(yè)大學(xué)園林學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150040；2.東北林業(yè)大學(xué)帽兒山實(shí)驗(yàn)林場(chǎng)，黑龍江尚志 150611)

?

不同含水量對(duì)溪蓀鳶尾種子保存效果的影響

許 言1， 萬(wàn)宗喆1， 方佳楠1， 寶力格1， 蕭 蕭1， 宋 紅1， 王 玲1， 陳恒利2， 彭宏梅2， 范麗娟1*

(1.東北林業(yè)大學(xué)園林學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150040；2.東北林業(yè)大學(xué)帽兒山實(shí)驗(yàn)林場(chǎng)，黑龍江尚志 150611)

摘要[目的]研究不同含水量對(duì)溪蓀鳶尾種子保存效果的影響。[方法]以寒地特色野生種溪蓀鳶尾種子為材料，通過(guò)硅膠干燥法獲得不同含水量的種子，在液氮中保存24 h后，采用水浴化凍、自來(lái)水水沖化凍和室溫化凍3種化凍方式，檢測(cè)不同條件下種子發(fā)芽率來(lái)檢驗(yàn)保存效果。[結(jié)果]種子含水量為5.4%～7.2%時(shí)的干燥處理顯著提高了種子發(fā)芽率，但含水量降到3.2%時(shí)會(huì)降低種子發(fā)芽率；種子含水量為7.2%時(shí)超低溫保存后萌發(fā)率會(huì)顯著提高，水浴化凍最適。[結(jié)論]最佳種子含水量為7.2%，保存后萌發(fā)率高達(dá)98.70%。

關(guān)鍵詞溪蓀鳶尾；種子；超低溫保存

超低溫保存(cryopreservation)是將植物種質(zhì)材料經(jīng)過(guò)一定的技術(shù)手段處理后，放置到液氮(-196 ℃)中進(jìn)行保存。在此溫度下，植物材料的物質(zhì)代謝和生命活動(dòng)完全停止，并在需要時(shí)采用一定的技術(shù)方法使材料恢復(fù)活力[1-4]，該技術(shù)是目前將種質(zhì)長(zhǎng)期保存的有效的生物技術(shù)。超低溫保存不受土地、人力等條件的限制，且取材方便、效率高，保證了種質(zhì)的遺傳穩(wěn)定性，已被較多地應(yīng)用于園林植物和農(nóng)作物種質(zhì)長(zhǎng)期保存上[5]。至2010年，全球約740萬(wàn)份(含重復(fù))植物資源采用超低溫保存技術(shù)保存在國(guó)際、國(guó)家、地區(qū)或私人的基因庫(kù)中[6]，其中美國(guó)、印度、日本等國(guó)建立的植物種質(zhì)基因庫(kù)庫(kù)存數(shù)量逐年增多，規(guī)模日益增大。我國(guó)作為園林觀賞植物種質(zhì)資源大國(guó)，更應(yīng)該加大對(duì)觀賞植物種質(zhì)資源的超低溫保存技術(shù)研究與應(yīng)用，尤其對(duì)還沒(méi)得到充分開(kāi)發(fā)和利用卻在數(shù)量上不斷減少或消失的種類(lèi)，采取長(zhǎng)期或永久性保存技術(shù)研究有著特殊意義。通常種子保存材料的含水量對(duì)保存成敗有重要影響。一般認(rèn)為材料含水量越少，受到的超低溫凍害就越少，但不同種子保存材料都具有一個(gè)安全含水量范圍，過(guò)度脫水也會(huì)對(duì)材料造成傷害。所以確定種子適宜的含水量對(duì)超低溫保存效果至關(guān)重要。

溪蓀鳶尾(Irissanguinea)為鳶尾科鳶尾屬多年生宿根花卉，在我國(guó)主要分布于東北地區(qū)，其耐水濕、耐寒，且花型奇特、花色艷麗、株型俊美，有很高的觀賞和應(yīng)用價(jià)值。溪蓀鳶尾是我國(guó)少有的耐寒、水陸兩棲的夏季開(kāi)花的藍(lán)色花種類(lèi)，也是難得的抗寒育種材料。近年來(lái)對(duì)鳶尾屬溪蓀的研究主要集中在種子生物學(xué)[7]、葉表微形態(tài)、葉和根的解剖學(xué)[8]、耐陰性[9]、抗旱性[10-11]、種間雜交親和性[12]和生殖生物學(xué)方面[13]，而對(duì)于種質(zhì)資源超低溫保存的研究鮮有報(bào)道。目前由于生存環(huán)境破壞等原因?qū)е乱吧p鳶尾種質(zhì)資源急劇下降，因此采取適當(dāng)?shù)谋４娲胧┻M(jìn)行資源保護(hù)是十分必要和迫切的。筆者選擇溪蓀鳶尾種子為試驗(yàn)材料，通過(guò)種子干燥法獲得不同含水量的種子，研究不同含水量種子的超低溫保存效果，進(jìn)而獲得溪蓀鳶尾種子超低溫保存適宜條件，并進(jìn)行長(zhǎng)期保存，以期為鳶尾屬植物這類(lèi)觀賞價(jià)值較高的種質(zhì)保存技術(shù)的進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。

1材料及方法

1.1供試材料2013年秋季于東北林業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)基地采集溪蓀鳶尾成熟種子，于室內(nèi)自然陰干，并置于4 ℃冰箱內(nèi)貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.2研究方法

1.2.1溪蓀鳶尾種子初始含水量測(cè)定。種子含水量測(cè)定參照通用的《國(guó)際種子檢驗(yàn)規(guī)程》[14]，采用烘干法對(duì)種子含水量進(jìn)行測(cè)定。即將去雜種子放在電子天平上稱(chēng)量試樣4.5～5.0 g，3組重復(fù)，種子重量設(shè)為a。準(zhǔn)備3個(gè)鋁盒，放在烘箱內(nèi)預(yù)先烘干直至恒重。將稱(chēng)好的溪蓀鳶尾種子分別放在3個(gè)鋁盒內(nèi)，稱(chēng)取總重量b，然后放在(105±2) ℃的烘箱內(nèi)烘干(17±2) h后，稱(chēng)重設(shè)為c。種子含水量計(jì)算公式如下：

種子含水量=(b-c)/a×100%

1.2.2溪蓀鳶尾種子干燥處理。采用硅膠干燥法進(jìn)行干燥。在恒溫25 ℃條件下，將種子用尼龍網(wǎng)袋包裝后埋入干燥器的硅膠中進(jìn)行干燥，種子與硅膠重量比為1∶10，干燥器中的硅膠每天需要用經(jīng)105 ℃充分干燥冷卻后的硅膠進(jìn)行更換。根據(jù)種子的含水量和脫水速度，每隔一段時(shí)間對(duì)干燥過(guò)程中的種子進(jìn)行取樣稱(chēng)重，在達(dá)到要求的含水量范圍時(shí)取出。干燥后的種子用鋁箔袋密封包裝備用。成熟種子室內(nèi)自然干燥后的含水量是9.5%(作為對(duì)照)，根據(jù)含水量梯度設(shè)計(jì)需要，取不同含水量的種子作為超低溫保存試驗(yàn)材料，含水量分別是7.2%、5.4%和3.2%。

1.2.3種子超低溫保存及解凍。將經(jīng)過(guò)適度干燥的溪蓀鳶尾種子裝入1. 8 ml的凍存管中，每個(gè)凍存管中裝入的種子量以不超過(guò)凍存管容積的2/3為宜，將瓶蓋擰緊，再將裝有種子的凍存管放在凍存管架上分別標(biāo)記好后投入液氮(-196 ℃)凍存。凍存一段時(shí)間后(視具體需要而定，該試驗(yàn)采用凍存24 h)，將凍存管從液氮中取出，用不同的化凍方法：水浴化凍、自來(lái)水水沖化凍和室溫化凍方法解凍，分別是40 ℃水浴5～6 min化凍；18 ℃左右自來(lái)水沖洗6～7 min化凍；室溫(25±2)℃中靜置約30 min化凍。不同含水量種子液氮保存后經(jīng)3種解凍方式處理，其中水浴化凍的解凍速度最快，屬于快速化凍；室溫化凍的速度最慢，屬于慢速化凍；自來(lái)水沖洗化凍的速度介于兩者之間?；瘍龊髮⒎N子從凍存管中取出，進(jìn)行發(fā)芽率檢測(cè)。

1.2.4溪蓀鳶尾種子發(fā)芽率測(cè)定。將保存前的種子(其中經(jīng)過(guò)干燥處理而未經(jīng)液氮保存的種子在浸種前需要放在室內(nèi)條件下回濕24 h)和經(jīng)液氮保存化凍后的種子采用100 μg/g 6-BA浸種24 h，之后用清水沖洗3遍，放入培養(yǎng)皿在光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行萌發(fā)。培養(yǎng)皿內(nèi)要墊上厚度均勻的脫脂棉，其上再墊一層濾紙并用蒸餾水浸透脫脂棉和濾紙，以濾紙表面濕潤(rùn)而無(wú)積水為宜。每個(gè)培養(yǎng)皿均勻放置種子50粒，重復(fù)3次。光照培養(yǎng)箱中發(fā)芽條件為：晝夜變溫處理，即30 ℃(8 h)/20 ℃(16 h)，保持培養(yǎng)皿內(nèi)濾紙的濕潤(rùn)。以后每天查看種子發(fā)芽情況，從有種子萌芽開(kāi)始，記錄種子每天的發(fā)芽個(gè)數(shù)，直至連續(xù)幾天內(nèi)無(wú)再發(fā)芽種子。發(fā)芽率計(jì)算公式如下：

發(fā)芽率=(發(fā)芽的種子數(shù)/供監(jiān)測(cè)的種子數(shù))×100%

2結(jié)果與分析

2.1不同含水量種子發(fā)芽率的比較以自然干燥的種子為對(duì)照，超低溫保存前不同含水量種子的萌發(fā)率有所不同。由表1可知，自然干燥的種子發(fā)芽率是94.70%，含水量為7.2%時(shí)的種子發(fā)芽率最高，達(dá)到97.40%，與對(duì)照差異顯著，與含水量5.4%時(shí)的種子發(fā)芽率(96.70%)接近；含水量為3.2%時(shí)種子發(fā)芽率最低，為88.70%，與對(duì)照差異顯著。由此可見(jiàn)，溪蓀鳶尾種子經(jīng)由適當(dāng)?shù)拿撍欣谔岣甙l(fā)芽率，然而過(guò)度脫水會(huì)導(dǎo)致種子發(fā)芽率降低。

2.2不同解凍方式對(duì)不同含水量種子保存后發(fā)芽率的影響由表2可知，不同含水量種子處理后仍能保持88.70%以上的發(fā)芽率，可見(jiàn)溪蓀鳶尾種子具有較高活力和較強(qiáng)的生命力，種子品質(zhì)比較好。3種解凍方式中水浴化凍對(duì)含水量9.5%、7.2%、5.4%的種子化凍效果較好，相對(duì)室溫化凍、自來(lái)水水沖化凍方式具有較高的發(fā)芽率，說(shuō)明溪蓀鳶尾種子超低溫儲(chǔ)藏后更適合水浴化凍方法解凍。其中，含水量為7.2%的種子經(jīng)水浴化凍后的發(fā)芽率高達(dá)98.70%，與含水量9.5%種子的發(fā)芽率差異不顯著，與含水量5.4%、3.2%種子的發(fā)芽率差異顯著；含水量為9.5%、7.2%時(shí)的種子保存后發(fā)芽率還有所提高；而對(duì)于含水量3.2%的種子來(lái)說(shuō)，保存前后發(fā)芽率沒(méi)有明顯變化，但較其他含水量種子發(fā)芽率較低，并且差異顯著。可見(jiàn)溪蓀鳶尾種子超低溫保存含水量不是越低越好；水浴化凍更適合凍存后種子活力恢復(fù)。

表1　不同含水量對(duì)溪蓀種子發(fā)芽率的影響

注：同列數(shù)據(jù)后小寫(xiě)字母不同表示差異達(dá)顯著水平(P<0.05)。下同。

表2　超低溫保存后不同化凍方式對(duì)溪蓀種子發(fā)芽率的影響

3結(jié)論與討論

(1)通常保存材料的含水量被認(rèn)為對(duì)保存成敗有重要影響，一般認(rèn)為材料含水量越少，受到的超低溫凍害就越少，但不同保存材料都具有一個(gè)安全含水量范圍，過(guò)度脫水也會(huì)對(duì)材料造成傷害。河英虎[15]研究認(rèn)為合歡種子在10%的自然含水量下保存于液氮中發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽指數(shù)最高，而青杄種子需經(jīng)過(guò)干燥脫水至含水量為4%時(shí)超低溫保存種子萌發(fā)力較好。盧玲[16]研究得出高山栲種子脫水至含水量為20．36%是比較好的超低溫保存含水量條件。該研究中干燥處理在超低溫保存前后對(duì)種子的影響不同，含水量在7.2%～9.5%內(nèi)對(duì)種子活力影響不顯著，超低溫保存后活力還會(huì)提升，最佳條件是含水量為7.2%，保存后的發(fā)芽率高達(dá)98.70%。

(2)理論上認(rèn)為，超低溫保存后的化凍過(guò)程中細(xì)胞內(nèi)的次生結(jié)冰會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生機(jī)械損傷，從而降低超低溫保存的成功率[17]。但該研究發(fā)現(xiàn)溪蓀鳶尾種子在含水量為9.5%、7.2%時(shí)，超低溫保存后發(fā)芽率有所升高，尤其含水量在7.2%時(shí)，發(fā)芽率高達(dá)98.70%，這一結(jié)果可能與溪蓀鳶尾種子自身的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)有關(guān)。溪蓀鳶尾主要分布在東亞的北溫帶乃至寒帶，所處地區(qū)冬季極其嚴(yán)寒，溫度可達(dá)-40 ℃左右，而-30～-50 ℃被認(rèn)為是冰晶生長(zhǎng)和形成的“危險(xiǎn)溫度區(qū)”。一般溫度達(dá)到-30 ℃附近時(shí)，細(xì)胞內(nèi)水分發(fā)生“同核結(jié)冰”，即水分子以自身為結(jié)晶核形成冰晶，使細(xì)胞中水分進(jìn)入過(guò)冷卻狀態(tài)，細(xì)胞質(zhì)濃度越高，過(guò)冷卻點(diǎn)越低，而溪蓀鳶尾成熟種子自然含水量就較低，細(xì)胞質(zhì)濃度相對(duì)很高，所以對(duì)溪蓀鳶尾種子來(lái)說(shuō)，含水量為9.5%、7.2%直接進(jìn)行超低溫保存效果較好。

(3)化凍方式是影響超低溫保存的關(guān)鍵因素之一[18-19]。不同化凍方式處理，在溪蓀鳶尾種子超低溫保存后對(duì)其發(fā)芽率有著顯著影響。通過(guò)對(duì)不同化凍方式的比較分析可以知道，種子的低溫水浴化凍最佳，室溫化凍次之，自來(lái)水水沖化凍最次。其中水浴化凍種子萌發(fā)率有所提高，高達(dá)98.70%。超低溫保存后的化凍過(guò)程中細(xì)胞內(nèi)的次生結(jié)冰對(duì)細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生機(jī)械損傷，從而降低超低溫保存的成功率。一般認(rèn)為快速化凍對(duì)種子發(fā)芽率的影響優(yōu)于慢速化凍，化凍速度由快到慢的化凍方法依次是水浴化凍、自來(lái)水水沖化凍、室溫化凍。而溪蓀鳶尾種子在最快化凍速度下(水浴化凍)和最慢化凍速度下(室溫化凍)的發(fā)芽率均優(yōu)于自來(lái)水水沖的發(fā)芽率，其原因有待進(jìn)一步驗(yàn)證分析。

(4)對(duì)溪蓀鳶尾不同含水量種子超低溫保存后不同化凍方式的發(fā)芽率情況的分析可知，溪蓀鳶尾種子超低溫保存條件為溪蓀鳶尾種子在含水量為7.2%～9.5%可直接超低溫保存，保存后萌發(fā)率會(huì)有所提高；低溫水浴化凍最佳，含水量為9.5%、7.2%時(shí)種子萌發(fā)率分別高達(dá)96.60% 、98.70%。超低溫保存技術(shù)目前被認(rèn)為是保存植物材料最有效最理想的方法，在液氮的環(huán)境下，植物材料所有的生命代謝活動(dòng)幾乎是停止的[20-21]，可以實(shí)現(xiàn)永久保持組織培養(yǎng)植物形態(tài)發(fā)生的能力，利于植物種質(zhì)永續(xù)利用和便于不同地區(qū)間的種質(zhì)交換。該研究確定了溪蓀鳶尾種子液氮有效長(zhǎng)期保存的條件，也為鳶尾屬植物其他種質(zhì)保存提供了借鑒。

參考文獻(xiàn)

[1] 程金水.園林植物遺傳育種學(xué)[M].北京：中國(guó)林業(yè)出版社，2000.

[2] KARTHA K K，ENGELMANN F． Cryopreservation and germplasm storage[M]//VASIL I K，THORPE T A． Plant cell and tissue culture．Dordrecht: Kluwer Academic Publishers，1994: 195-230.

[3] OZUDOGRU E A，PREVIATII A，LAMBARDI M．In vitro conservation and cryopreservation of ornamental plants[M]//JAIN S M,OCHAR S J． Protocols for in vitro propagation of ornamental plants． UK: Humana Press，2010: 303-324.

[4] BANRABAS B，RAJKJ E.Fertility of deep-frozen maize(ZeamaysL.)pollen[J].Annals of botnay,1981,48:861.

[5] 劉燕,周慧,方標(biāo).園林花卉種子超低溫保存研究[J].北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2001(4):39-44.

[6] 王述民,張宗文. 世界糧食和農(nóng)業(yè)植物遺傳資源保護(hù)與利用現(xiàn)狀[J]. 植物遺傳資源學(xué)報(bào),2011(3):325-338.

[7] 黃蘇珍，韓玉林，謝明云，等. 中國(guó)鳶尾屬觀賞植物資源的研究與利用[J].中國(guó)野生植物資源，2003，22(1)：4-7.

[8] 孫穎. 東北野生鳶尾屬6種植物種子生物學(xué)及種苗發(fā)育過(guò)程的研究 [D].哈爾濱：東北林業(yè)大學(xué)，2004.

[9] 王玲，仲鐵，卓麗環(huán)，等. 鳶尾屬部分種葉表微形態(tài)及其分類(lèi)學(xué)意義[J]. 北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2010,32(6): 95-100.

[10] 劉國(guó)華.幾種鳶尾屬植物耐蔭性的研究[D].南京：南京林業(yè)大學(xué),2008.

[11] 趙燕燕．鳶尾屬幾種植物的抗旱性研究[D]．南京：南京林業(yè)大學(xué)，2007．

[12] 王子風(fēng)．鳶尾屬6種植物對(duì)干旱脅迫的響應(yīng)[D]．南京：南京林業(yè)大學(xué)，2009．

[13] 畢曉穎，婁琦，鄭洋．馬藺與溪蓀種間雜交親和性研究[J]．園藝學(xué)報(bào)，2011，38(5)：977-984．

[14] 尚方劍，王玲. 溪蓀開(kāi)花及傳粉生物學(xué)特性[J].草業(yè)科學(xué),2014,31(5):892-897.

[15] 河英虎，傅伊倩，劉燕.合歡和青杄種子超低溫保存研究[J].種子,2013,32(3):33-35.

[16] 盧玲，王海英，圖雅，等.高山栲種子的超低溫保存[J].東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2013(7):6-8.

[17] 顏啟傳, 畢辛華. 國(guó)際種子檢驗(yàn)規(guī)程[M].北京：農(nóng)業(yè)出版社,1985.

[18] 王越, 劉燕. 觀賞植物種質(zhì)資源的超低溫保存[J]. 植物生理學(xué)通訊, 2006, 42(3): 559-566.

[19] 劉燕，張亞利．梅花花粉的超低溫保存研究[J]．北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，26(S1)：22-25．

[20] NIINO T,TANAKA D,TANTELY R R,et al．Cryopreservation of basal stem buds of in vitro-grown mat rush(Juncusspp．) by vitrification[J]． Cryo letters，2007， 28(3):197-206.

[21] TOWILL L E,WATERS C.Cryopreservation of pollen[C]//ENGELMANN F,TAKAGI H.Cryopreservation of tropical plant germplasm.Rome:International Plant Genetic Resources Institute,2000:115-120.

Effects of Different Water Content on Preservation ofIrissanguineaSeed

XU Yan，WAN Zong-zhe，F(xiàn)ANG Jia-nan，F(xiàn)AN Li-juan*et al( The College of Landscape，Northeast Forestry University, Harbin， Heilongjiang 150040)

Abstract[Objective] To study the effects of different water content on preservation ofIrissanguineaseed.[Method] There is no denying that liquid nitrogen cryopreservation is an ideal way to preserve germplasm for a long time. When using seeds as saving materials, the optimal moisture contents and thawed are very important to the effect of cryopreservation. This study uses the wildIrissanguineaseeds for the experimental materials which are grow in cold places. We get the seeds of different water contents with the method of drying by silica gel, and then seeds were preserved in liquid nitrogen for 24 hours. Using three kinds of defrost modes to test the seed germination rate under different conditions to test effect.[Result]The results showed that seed moisture content was 5.4%-7.2% of dry treatment had significant effect on seed germination rate, but will reduce the seed germination rate under 3.2% moisture content. Seed germination rate can significantly improve after cryopreservation when the moisture content was 7.2%.[Conclusion]The germination rate is as high as 98.70% when the optimum water content is 7.2%.

Key wordsIrissanguinea；Seeds；Cryopreservation

收稿日期2015-11-30

作者簡(jiǎn)介許言(1993- )，男，黑龍江哈爾濱人，本科生，專(zhuān)業(yè)：園林。*通訊作者，講師，碩士，從事園林植物種質(zhì)資源研究。

基金項(xiàng)目大學(xué)生國(guó)家級(jí)創(chuàng)新項(xiàng)目(201410225050)；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專(zhuān)項(xiàng)(2572015BA07)。

中圖分類(lèi)號(hào)S 722.1+7

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A

文章編號(hào)0517-6611(2015)36-230-02