TFF2、CLDN18、MUC5AC蛋白在胃黏膜病變過程中的表達(dá)變化及其臨床意義*

宋潔郭瑞芳#蘇日拉秦二平王佳林

內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院消化科(010017)

*本課題由內(nèi)蒙古自治區(qū)自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目(20080404Zd26)、內(nèi)蒙古自治區(qū)自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2009MS1154)和內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院院內(nèi)科研項(xiàng)目(20110903)資助

背景：胃癌是我國發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一，胃黏膜病變過程中早期分子標(biāo)記是近年胃癌研究的重點(diǎn)。目的：探討三葉因子2(TFF2)、閉合蛋白18(CLDN18)和黏蛋白5AC(MUC5AC)在不同胃黏膜病變中的表達(dá)情況及其臨床意義。方法：選取2008年12月-2009年5月內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院的胃鏡活檢和手術(shù)標(biāo)本71例，其中正常胃黏膜組織20例，腸化生組織20例，異型增生組織11例，胃癌組織20例，采用免疫組化SP法檢測(cè)TFF2、CLDN18和MUC5AC蛋白表達(dá)情況。結(jié)果：正常胃黏膜組織中TFF2、CLDN18和MUC5AC蛋白均為陽性表達(dá)，表達(dá)率為100%，而腸化生、異型增生以及胃癌組織中，三種蛋白陽性表達(dá)率依次逐漸下降，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)論：TFF2、CLDN18和MUC5AC蛋白表達(dá)水平與胃黏膜組織惡性程度密切相關(guān)，是潛在的預(yù)測(cè)胃癌發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后的重要生物學(xué)標(biāo)記。

關(guān)鍵詞胃腫瘤；癌前狀態(tài)；三葉因子2；閉合蛋白18；黏蛋白5AC

胃癌是我國發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅人們的健康。胃癌普查和癌前疾病的定期隨訪是發(fā)現(xiàn)早期胃癌的重要手段，而簡(jiǎn)單、有效、經(jīng)濟(jì)、實(shí)用的普查方法是腫瘤學(xué)研究的熱點(diǎn)。目前胃癌的診斷主要依靠影像學(xué)和病理學(xué)，但發(fā)現(xiàn)時(shí)多數(shù)患者已處于中晚期，手術(shù)、放化療的5年生存率仍較低。因此，發(fā)現(xiàn)胃黏膜病變過程中早期分子標(biāo)記已成為近年胃癌研究的重點(diǎn)。

本課題的前期研究[1]通過寡基因芯片技術(shù)發(fā)現(xiàn)三葉因子2(TFF2)、閉合蛋白18(CLDN18)和黏蛋白5AC(MUC5AC)在正常胃黏膜、胃癌和癌旁組織中有差異性表達(dá)，經(jīng)生物信息學(xué)功能分析發(fā)現(xiàn)，這三種基因?qū)儆谖葛つて琳虾头置诠δ芟嚓P(guān)基因。但三種蛋白的表達(dá)變化與胃黏膜病變不同過程的關(guān)系尚不明確。本研究通過采用免疫組化法檢測(cè)三種蛋白在正常胃黏膜、腸化生、異型增生和胃癌組織中的表達(dá)情況，旨在初步探討三者在胃癌發(fā)生、發(fā)展過程中的作用。

材料與方法

一、資料來源

選取2008年12月-2009年5月內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院收治的胃鏡活檢和手術(shù)切除標(biāo)本71例，其中正常胃黏膜組織20例，胃黏膜腸化生組織20例，胃上皮異型增生組織11例，胃癌組織20例，不同組織的性別構(gòu)成和年齡見表1。

表1　各組患者性別、年齡

二、研究方法

采用免疫組化SP法檢測(cè)TFF2、CLDN18和MUC5AC蛋白表達(dá)，抗體分別購自美國Proteintech公司和福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司，一抗工作濃度均為1∶50，具體步驟參照試劑盒說明書。

結(jié)果判定：腺體細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色為陽性染色。TFF2和CLDN18評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：在高倍顯微鏡下，每張切片任取5個(gè)視野，每個(gè)視野隨機(jī)計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，計(jì)算陽性細(xì)胞率(%)，取均值。陽性細(xì)胞率≤5%或細(xì)胞無棕色顆粒與背景一致為“-”；陽性細(xì)胞率≤30%為“+”；30%<陽性細(xì)胞率≤60%為“++”；陽性細(xì)胞率>60%為“+++”。MUC5AC評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：陽性細(xì)胞染色強(qiáng)度：無著色為陰性“-”；淡黃色為弱陽性“+”；黃色為陽性“++”；棕黃色為強(qiáng)陽性“+++”。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

TFF2、CLDN18、MUC5AC在正常胃黏膜組織中的陽性表達(dá)率均為100%；隨著胃黏膜病變程度不斷加重，腸化生組織中的TFF2蛋白陽性表達(dá)率為35.0%，CLDN18為70.0%，MUC5AC為30.0%；在異型增生組織中，TFF2蛋白陽性表達(dá)率為27.3%，CLDN18為45.5%，MUC5AC為36.4%；在胃癌組織中，TFF2蛋白陽性表達(dá)率為25.0%，CLDN18為40.0%，MUC5AC為15.0%，表達(dá)強(qiáng)度逐漸減弱(圖1)。正常胃黏膜、腸化生、異型增生和胃癌組織中的TFF2、CLDN18和MUC5AC蛋白陽性表達(dá)率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=29.064，P<0.01；χ2=18.591，P<0.01；χ2=33.633，P<0.01)。

討論

胃黏膜屏障是由胃黏膜上皮細(xì)胞頂部以及細(xì)胞與細(xì)胞之間的緊密連接構(gòu)成，包括胃表面活性磷脂形成的疏水層和黏液凝膠層的完整性和連續(xù)性，以及調(diào)節(jié)上述結(jié)構(gòu)和成分的一系列生理、化學(xué)、生物和免疫因素和活性介質(zhì)[2]。胃黏膜在損傷因子的持續(xù)刺激下，屏障功能受損，導(dǎo)致相關(guān)疾病的發(fā)生。胃癌的發(fā)生是多因素、多階段、多基因參與的復(fù)雜過程，其中胃黏膜屏障功能的破壞是重要因素之一[3-4]。胃黏膜屏障功能由多種因素介導(dǎo)，包括TFF、氧自由基、幽門螺桿菌、胃泌素、CLDN18、生長抑素、MUC以及一氧化氮等，這些因素相互協(xié)調(diào)，有著密切交聯(lián)的網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)方式[5]。

TFF是胃黏膜上的一種小肽分子，二級(jí)結(jié)構(gòu)中具有“三葉草”形狀的結(jié)構(gòu)域，具有較強(qiáng)的抗酸、耐熱以及抗蛋白酶水解能力，因而具有維持胃黏膜完整性和修復(fù)上皮損傷的功能。TFF有3個(gè)亞型，分別為TFF1、TFF2和TFF3，TFF1和TFF2主要表達(dá)于胃組織和胃黏膜，TFF3主要表達(dá)于小腸、直腸以及肺部組織。TFF2又稱解痙多肽，生理狀態(tài)下主要表達(dá)于潰瘍易發(fā)部位，如胃體、胃竇的黏液頸細(xì)胞和十二指腸，而病理狀態(tài)下主要表達(dá)于消化性潰瘍、炎癥性腸病等胃腸道黏膜損傷部位[6-7]。TFF2保護(hù)胃黏膜的機(jī)制可能為[8-9]：在胃黏膜表面形成凝膠層，減少刺激因子的進(jìn)一步損傷；通過與受體結(jié)合，促進(jìn)上皮細(xì)胞向損傷位點(diǎn)轉(zhuǎn)移，從而起臨時(shí)的保護(hù)作用；通過抑制胃酸分泌減少對(duì)胃黏膜的刺激。本研究發(fā)現(xiàn)，TFF2在正常胃黏膜、腸化生、異型增生和胃癌組織中的陽性表達(dá)率依次降低，且組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義， 表明TFF2蛋白表達(dá)水平與胃黏膜病變程度相關(guān)，具有抑制胃癌發(fā)生、發(fā)展的作用，可作為判斷胃癌預(yù)后的分子生物學(xué)標(biāo)記。此外，Schmidt等[10]和Jiang等[11]的研究發(fā)現(xiàn)，TFF2不僅與胃癌發(fā)生關(guān)系密切，而且與胃癌的組織分化程度相關(guān)，分化程度越低，其表達(dá)水平越弱。

TFF2A：正常黏膜組織；B：腸化生；C：異型增生；D：胃癌；CLDN18E：正常黏膜組織；F：腸化生；G：異型增生；H：胃癌；MUC5ACI：正常黏膜組織；J：腸化生；K：異型增生；L：胃癌

圖1不同病變黏膜組織中TFF2、CLDN18和MUC5AC蛋白表達(dá)(免疫組化SP法，×400)

、

CLDN18屬于Claudins多基因家族，是新近發(fā)現(xiàn)的緊密連接結(jié)構(gòu)的重要組成分子[12]。該跨膜蛋白具有2個(gè)亞型，分別為CLDN18a1和CLDN18a2，其中CLDN18a2多表達(dá)于胃部和肺部，屬于胃黏膜上皮細(xì)胞的特異性標(biāo)記物。Claudins蛋白異常表達(dá)可引起上皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，導(dǎo)致細(xì)胞功能受到損傷，特別在心血管疾病、代謝類疾病和消化系統(tǒng)疾病中發(fā)揮重要作用。Claudins在癌組織中常表達(dá)降低，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)異常的緊密連接，降低分化和細(xì)胞極性，使腫瘤細(xì)胞更易脫離原發(fā)部位進(jìn)入脈管轉(zhuǎn)移至遠(yuǎn)隔部位[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，CLDN18在正常胃黏膜、腸化生、異型增生和胃癌組織中的陽性表達(dá)率依次降低，且組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明CLDN18蛋白表達(dá)水平與胃黏膜病變程度相關(guān)，可作為早期檢測(cè)胃癌發(fā)生的分子生物學(xué)標(biāo)記。胃黏膜病變過程中的CLDN18蛋白表達(dá)下調(diào)可能與轉(zhuǎn)錄因子Sox2和Cdx2的調(diào)節(jié)有關(guān)[14]。

MUC5AC屬于黏蛋白家族，由上皮細(xì)胞分泌，主要作用是保持空腔臟器，如胃腸道、呼吸道管腔的潤滑。此外，黏蛋白可調(diào)節(jié)整合素和鈣黏素，從而影響細(xì)胞粘附和遷移功能[15-16]。MUC5AC蛋白在正常胃黏膜組織呈高表達(dá)，隨著黏膜組織病變的加重，其硫基化、糖基化水平降低，蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，導(dǎo)致保護(hù)功能減弱，促進(jìn)病變進(jìn)展，甚至發(fā)生胃癌。研究[17]表明，MUC5AC蛋白表達(dá)水平與腫瘤的病理類型和發(fā)生部位關(guān)系密切。Wang等[18]發(fā)現(xiàn)，胃癌中MUC5AC蛋白表達(dá)與組織病理學(xué)分級(jí)和腫瘤TNM分期有關(guān)，其表達(dá)是合理的預(yù)測(cè)因素。本研究發(fā)現(xiàn)MUC5AC在正常胃黏膜、腸化生、異型增生和胃癌組織中的表達(dá)水平依次降低，且組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，進(jìn)一步證實(shí)該蛋白在胃癌發(fā)生、發(fā)展過程中的重要性。

總之，TFF2、CLDN18和MUC5AC蛋白表達(dá)水平隨著胃黏膜病變進(jìn)展呈逐漸下降趨勢(shì)。本研究進(jìn)一步證實(shí)了胃癌的發(fā)生、發(fā)展是多因素、多基因參與的過程，不同的基因表達(dá)組成了復(fù)雜的胃癌抑制或促進(jìn)網(wǎng)絡(luò)，任一蛋白的表達(dá)水平發(fā)生變化，均有可能使病變惡化。TFF2、CLDN18和MUC5AC三種蛋白的動(dòng)態(tài)表達(dá)特點(diǎn)，使其有可能成為潛在的預(yù)測(cè)胃癌發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后的重要生物學(xué)標(biāo)記。

本研究20例胃癌組織分型、分期并不一致，可能會(huì)對(duì)研究結(jié)果有一定影響，后續(xù)應(yīng)收集相同病理類型的標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，明確在不同類型胃癌中的蛋白表達(dá)情況。此外，本研究的樣本數(shù)較少，尤其是異型增生標(biāo)本，導(dǎo)致蛋白表達(dá)弱陽性，表明組織提取操作可能存在問題，下一步應(yīng)擴(kuò)大樣本進(jìn)行研究。

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(2014-12-22收稿；2015-03-16修回)

Expressions and Significance of TFF2, CLDN18 and MUC5AC Protein in Gastric Mucosal LesionsSONGJie,GUORuifang,SURila,QINErping,WANGJialin.DepartmentofGastroenterology,InnerMongoliaPeople’sHospital,Huhhot(010017)

Correspondence to: GUO Ruifang, Email: grf_6872@163.com

Background: Gastric cancer is one of the malignant tumors with highest morbidity and mortality, and the early change of molecular marker in gastric mucosal lesion is the hot spot of gastric cancer study. Aims: To investigate the expressions and clinical significance of trefoil factor 2 (TFF2), claudin 18 (CLDN18), mucin 5AC (MUC5AC) in gastric mucosal lesions. Methods: Gastroscopy biopsies and surgery specimens from Dec. 2008 to May 2009 at Inner Mongolia People’s Hospital were collected, including 20 normal gastric mucosal tissues, 20 intestinal metaplasia tissues, 11 dysplasia tissues and 20 gastric cancer tissues. The protein expressions of TFF2, CLDN18, MUC5AC were determined by immunohistochemical SP method. Results: The positive expression rates of TFF2, CLDN18 and MUC5AC in normal gastric mucosal tissues were all 100%, and were gradually decreased in the order of intestinal metaplasia, dysplasia and gastric cancer tissue, the differences were statistically significant (P<0.01). Conclusions: Expressions of TFF2, CLDN18 and MUC5AC protein are closely related to the degree of malignancy of gastric mucosal lesions, and can be considered as a potential biological marker for predicting the development and prognosis of gastric cancer.

Key wordsStomach Neoplasms;Precancerous Conditions;Trefoil Factor 2;Claudin 18;Mucin 5AC

通信作者#本文，Email: grf6872@163.com

DOI:10.3969/j.issn.1008-7125.2015.07.003