李前，茍春天

（1.甘肅省會(huì)寧縣畜牧獸醫(yī)局，甘肅會(huì)寧 730070；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所，哈爾濱 750001）

雞傳染性支氣管炎的診斷技術(shù)

李前1，茍春天2

（1.甘肅省會(huì)寧縣畜牧獸醫(yī)局，甘肅會(huì)寧 730070；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所，哈爾濱 750001）

雞傳染性支氣管炎（Infectious bronchitis,IB）是由雞傳染性支氣管炎病毒（Infectious bronchitis virus,IBV）引起的一種急性、高度接觸傳染性的禽呼吸道疾病。該病可以發(fā)生于所有日齡的雞，主要侵害呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)和泌尿生殖系統(tǒng)，發(fā)病雞主要變現(xiàn)為咳嗽、噴嚏、氣管音，產(chǎn)蛋量和蛋品質(zhì)下降。雛雞感染此病易產(chǎn)生呼吸道和腎臟病變而造成死亡，本病目前在世界范圍內(nèi)流行，對(duì)養(yǎng)雞業(yè)造成重大經(jīng)濟(jì)損失。由于冠狀病毒特殊的轉(zhuǎn)錄機(jī)制，導(dǎo)致新的變異株和血清型不斷產(chǎn)生，使該病的防制變得十分困難。近年來(lái)，該病的流行呈上升趨勢(shì)，尤其是腎致病型IB，已成為我國(guó)規(guī)?；B(yǎng)雞場(chǎng)的主要傳染病之一，因此對(duì)該病的診斷顯得尤為重要，本文對(duì)IB的診斷方法進(jìn)行簡(jiǎn)要的綜述。

1 臨床診斷

本病可感染不同日齡的雞，感染雛雞常表現(xiàn)為呼吸道癥狀，咳嗽、噴嚏、氣管音，隨病情的發(fā)展逐漸表現(xiàn)為全身性癥狀，出現(xiàn)精神萎靡、羽毛蓬亂、食欲廢絕。產(chǎn)蛋雞出現(xiàn)產(chǎn)蛋量下降，蛋品質(zhì)下降，如蛋清稀薄、軟殼蛋和畸形蛋等。對(duì)病雞進(jìn)行剖檢，?？捎^察到氣管環(huán)出血，腎臟腫大，有尿酸鹽沉積，呈現(xiàn)“花斑腎”，輸卵管、卵泡變形等典型癥狀。臨床上通過(guò)流行病學(xué)調(diào)查結(jié)合臨床癥狀和病理剖檢可對(duì)本病做出初步診斷。

2 病毒分離

病毒的分離鑒定是診斷該病最為經(jīng)典、直觀、可靠的方法。由于IBV感染后最早侵害的部位是氣管，因此，氣管是分離IBV的首選靶器官，此外也可選擇肺、腎臟作為分離IBV的靶器官。無(wú)菌采集病料后，充分研磨，反復(fù)凍融3次后，離心，取上清液過(guò)濾除菌。將濾液通過(guò)尿囊腔接種9～11日齡SPF雞胚，通過(guò)連續(xù)傳代至雞胚出現(xiàn)卷曲、矮小典型病變或死亡。同時(shí)也可將病毒純化后制備負(fù)染樣品置于電鏡下進(jìn)行病毒形態(tài)觀察，進(jìn)行確診。

3 血清學(xué)診斷技術(shù)

目前血清學(xué)診斷是實(shí)際檢測(cè)中的常用技術(shù)，主要包括病毒中和試驗(yàn)（VN）、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）、瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)（AGP）、免疫熒光抗體技術(shù)（FA）等。

3.1 中和試驗(yàn)（VN）

VN試驗(yàn)具有較高的敏感性和特異性，被廣泛用于IBV野毒株的分離鑒定及血清分型。VN試驗(yàn)可以在雞胚、雞胚腎細(xì)胞（CEKC）或氣管環(huán)培養(yǎng)物上進(jìn)行，最常用的是雞胚法。一般采用固定病毒稀釋血清法，將病毒稀釋成每單位劑量含200或100EID50，與等量的2倍系列稀釋的被檢血清混合，置37℃下作用60min，每一稀釋度接種3～6枚9～11日齡SPF雞胚，觀察7d，根據(jù)雞胚死亡率計(jì)算中和效價(jià)。

3.2 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）

ELISA既可以檢測(cè)抗體，也可以檢測(cè)抗原。此方法具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、操作便捷等優(yōu)點(diǎn)。常用的ELISA方法有間接ELISA、阻斷ELISA、抗原捕獲ELISA和單抗夾心ELISA等。目前，國(guó)內(nèi)外已經(jīng)有商品化的ELISA檢測(cè)試劑盒出售。該方法尤其適用于大規(guī)模的檢測(cè)，還可以通過(guò)檢測(cè)IgM水平來(lái)診斷雞群是否存在新的感染。

3.3 瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)（AGP）

AGP的抗原陽(yáng)性率與病毒的致病性、病毒的感染劑量、雞的日齡及感染時(shí)抗體的存在狀態(tài)有關(guān)。瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)具有較高的靈敏性和特異性。同時(shí)具備操作簡(jiǎn)單、資金耗費(fèi)少等優(yōu)點(diǎn)。用1%的瓊脂糖制成平板，用梅花打孔器打出梅花孔，將中心孔中加滿抗原，將外周孔中加滿倍比稀釋的待檢血清，置37℃溫箱中，24～48 h即可觀察結(jié)果。

3.4 免疫熒光抗體技術(shù)（IFA）

IFA可用于IBV抗原抗體檢測(cè)，IFA被廣泛的應(yīng)用于檢測(cè)IBV在組織中的定位，其檢測(cè)結(jié)果具有直觀性。運(yùn)用IFA檢測(cè)抗原組織定位時(shí)，雖然將組織的冰凍切片作為己知抗原效果較好，但由于冰凍切片的制作程序復(fù)雜、耗時(shí)較長(zhǎng)，該方法并不適用于臨床應(yīng)用及雞群抗體的監(jiān)測(cè)。

4 分子生物學(xué)診斷技術(shù)

分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)具有靈敏、快速的優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于IBV的檢測(cè)中。該技術(shù)主要包括逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Q-PCR)、限制性內(nèi)酶切片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析(RFLP)和核酸探針技術(shù)。

4.1 逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)和實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Q-PCR）

RT-PCR是在基因水平上對(duì)IBV進(jìn)行診斷，RT-PCR通過(guò)一對(duì)引物介導(dǎo)，在體外快速擴(kuò)增特定的核酸片段，根據(jù)電泳結(jié)果即可作出初步診斷，測(cè)序后可進(jìn)一步確診。實(shí)時(shí)熒光定量PCR是PCR技術(shù)與熒光技術(shù)的結(jié)合，根據(jù)熒光隨時(shí)間的變化而擴(kuò)增的曲線來(lái)確定是否有相關(guān)病原的存在，同時(shí)可以對(duì)病原進(jìn)行定量測(cè)定，具有極高的靈敏性和特異性。

4.2 限制性內(nèi)切酶片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析（RFLP）

RFLP技術(shù)被廣泛應(yīng)用于遺傳學(xué)研究，可利用病毒基因酶切圖譜對(duì)其進(jìn)行分型。該技術(shù)的原理是通過(guò)RT-PCR方法擴(kuò)增到DNA片段，再用限制性內(nèi)切酶進(jìn)行消化，不同血清型IBV的PCR產(chǎn)物經(jīng)消化后產(chǎn)生數(shù)目不等，長(zhǎng)度不一的DNA片段，與標(biāo)準(zhǔn)毒株對(duì)照即可鑒定血清型。

4.3 核酸探針技術(shù)

核酸探針技術(shù)是用構(gòu)建好的DNA片段，通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)的原理與病原核酸進(jìn)行雜交，從而確定病原的同源序列。該方法具有靈敏性高、特異性強(qiáng)、簡(jiǎn)便、快速等特點(diǎn)。此外，該方法還可對(duì)病原進(jìn)行定位和定量。常用的核酸探針技術(shù)有Northern雜交、斑點(diǎn)雜交、Southern雜交、原位雜交等。

綜上所述，診斷雞傳染性支氣管炎的方法有很多，每種方法都有其優(yōu)缺點(diǎn)，在應(yīng)用時(shí)，要根據(jù)實(shí)際需要來(lái)選擇最合適的方法，有時(shí)甚至需要幾種方法相結(jié)合才能獲得滿意的結(jié)果。

10．3969/J.ISSN．1671-6027．2015．05.100