胡 智,劉 單 綜述，戴天陽 審校

(1.瀘州醫(yī)學院附屬醫(yī)院胸心外科 646000；2.瀘州醫(yī)學院 646000)

·綜 述·

微小RNA在食管鱗癌化療耐藥性中的研究現(xiàn)狀

胡 智1,劉 單2綜述，戴天陽1審校

(1.瀘州醫(yī)學院附屬醫(yī)院胸心外科 646000；2.瀘州醫(yī)學院 646000)

微小RNA；食管鱗癌；化療耐藥

食管鱗狀細胞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)是我國常見的消化道惡性腫瘤之一；化療及新輔助化療是ESCC非手術治療的重要手段，但后期腫瘤耐藥性的產(chǎn)生是臨床面臨的難題。近年來表觀遺傳學領域研究顯示：微小RNA(miRNAs)是非編碼單鏈RNA，在腫瘤細胞增殖、轉(zhuǎn)移、凋亡等過程中扮演著重要角色；通過篩查腫瘤耐藥產(chǎn)生過程中miRNAs的變化，尋找相應的靶蛋白及信號通路，將為逆轉(zhuǎn)耐藥性，增加化療藥物敏感性提供幫助。

1 miRNAs的生物角色

miRNAs是新發(fā)現(xiàn)的一類高度進化、保守、非編碼的長度為19～25個核苷酸的非編碼單鏈RNA。相關實驗研究認為,miRNAs在RNA誘導沉默復合物作用下與互補mRNAs結(jié)合,降解靶mRNAs或阻止其轉(zhuǎn)錄后翻譯。人類基因組中有約30%的編碼蛋白基因受其調(diào)控,miRNAs在調(diào)控發(fā)育、分化、增殖及凋亡等基本的生命活動中扮演著重要角色。近年來研究認為，miRNAs調(diào)控基因表達存在復雜的組合模式。miRNAs作為人類基因組中最大的一類調(diào)控因子，參與人類約1/3的編碼蛋白基因的調(diào)控。研究表明，miRNAs可通過腫瘤細胞的關鍵調(diào)控靶標而發(fā)揮基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的作用，影響疾病的發(fā)生發(fā)展過程。miRNAs與ESCC的關系是在2008年由Guo等[1]首次報道：他們采用miRNAs微陣列技術發(fā)現(xiàn)hsa-miR-25,hsa-miR-424，hsa-miR-151在ESCC手術標本中較癌旁組織明顯上調(diào)。

2 腫瘤化療耐藥

無論是對晚期癌癥患者術前誘導緩解還是手術切除后鞏固，腫瘤化療仍是目前提高ESCC患者生存期和生活質(zhì)量的主要手段，然而，腫瘤細胞化療耐藥性的產(chǎn)生是臨床上影響患者療效、預后的障礙[2-3]。根據(jù)腫瘤的耐藥譜可分為原藥耐藥和多藥耐藥(multidrug resistance，MDR)。目前更多的是MDR，更換化療方案或采取聯(lián)合化療的方案可能收益甚微，且?guī)磔^多的藥物不良反應，最終導致化療失敗。

腫瘤耐藥機制包括藥物吸收降低或排出增多、藥物靶點改變、細胞修復功能增強及細胞凋亡減弱等,涉及藥物作用各個環(huán)節(jié)關鍵基因突變可能導致耐藥發(fā)生。腫瘤化療耐藥的主要分子機制是：(1)通過改變控制凋亡相關蛋白質(zhì)的平衡來降低化療敏感性，如p53基因的突變、PTEN基因突變、Bcl-2基因突變、凋亡配體的表達。(2)與藥物轉(zhuǎn)運相關蛋白表達增強，如P-糖蛋白 (P-gp),來源于多藥耐藥相關蛋白和乳腺癌耐藥蛋白。(3)腫瘤細胞損傷后DNA自我修復能力增強，如DNA拓撲異構(gòu)酶、烷基鳥嘌呤DNA烷基轉(zhuǎn)移酶AGT、核酸切除修復增強以及錯配修復缺陷。

因此，克服甚至逆轉(zhuǎn)ESCC的多藥耐藥是亟須解決的難題之一，為此，近年來許多科學家試圖從遺傳學及表觀遺傳學的分子途徑尋求突破。在所有病例中尋找更好的方法來界定耐藥，是為克服ESCC耐藥提供可行方案的關鍵步驟[3]。

3 miRNAs與腫瘤化療耐藥

大量實驗和臨床研究表明，腫瘤耐藥細胞中存在miRNA表達異常，其異常往往導致腫瘤耐藥。miRNAs為一類高度保守的非編碼RNAs,通過對各環(huán)節(jié)關鍵基因表達的調(diào)控進而調(diào)節(jié)食管癌細胞對化療藥物的敏感性，但其涉及過程十分復雜：腫瘤細胞miRNAs突變或表達異常,導致miRNAs對靶基因如藥物轉(zhuǎn)運相關基因、細胞損傷后自我修復能力相關基因、細胞凋亡相關基因及腫瘤上皮間質(zhì)化相關基因等表達的異常調(diào)控,導致腫瘤細胞化療耐藥產(chǎn)生。同時,根據(jù)這些miRNAs表達情況可預測腫瘤患者對藥物的反應[4]。

3.1 miRNAs基因多態(tài)性與ESCC耐藥 miRNA基因多態(tài)性包括影響 miRNAs正常功能的各種基因多態(tài)性。在人類基因組中導致miRNAs功能增強或減弱的各種突變可分為影響miRNAs生物合成的基因突變、miRNAs靶基因的突變以及影響 miRNAs基因正常的表觀遺傳學調(diào)節(jié)。Wu等[5]通過對5個基因位點單核苷酸基因多態(tài)性(miR-146a rs2910164,miR-196a2 rs11614913,miR-100 rs1834306,miR-125a rs12976445 和 miR-26a1 rs7372209)進行分析，發(fā)現(xiàn)miR-146a rs2910164與血液毒性有關,miR-196a2 rs11614913和miR-125a rs12976445與生存率有關，miRNAs基因多態(tài)性可預測以鉑類為基礎的ESCC化療藥物的療效。

3.2 miRNAs異常表達與ESCC耐藥 Hummel等[6]在研究新輔助化療(neoadjuvant chemotherapy,NACT)與食管癌細胞miRNAs的表達關系時發(fā)現(xiàn)，選用順鉑(cisplatin，CDDP)和5-氟尿嘧啶(5-fludrouracil，5-flu)對ESCC處理24 h或72 h之后，抽取RNA作基因芯片研究發(fā)現(xiàn)：ESCC在短期或長期暴露后表達miRNAs呈現(xiàn)類似的變化，13個miRNAs在作用24、72 h后(miR-199a-5p,miR-302f,miR-320a,miR-342-3p,miR-425,miR-455-3p,miR-486-3p,miR-519c-5p,miR-548d-5p,miR-617,miR-758,miR-766,miR-1286)的表達均上調(diào)。miRNAs網(wǎng)絡預測功能顯示：miRNAs的靶分子通路與化療后生存時間密切相關，涉及細胞增殖、凋亡過程，DNA復制、重組和修復過程以及藥物代謝的過程。

3.2.1 miRNAs過表達與ESCC耐藥 為了確定miRNAs在食管癌中的表達與患者化療耐藥機制之間的關系，Hamano等[7]收集接受術前化療的食管癌手術患者的標本，選取幾種被認為是參與調(diào)節(jié)干細胞功能的miRNAs(let-7a、 let-7g、miR-21、miR-134、 miR-145、miR-155、miR-200c 、miR-203和miR-296)，并分別進行實時逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測，結(jié)果顯示：在順鉑耐藥的ESCC中，miR-200c表達顯著增加，通過轉(zhuǎn)染抑制miR-200c細胞，其對順鉑敏感性和細胞凋亡率明顯增加；而敲除miR-200c表達將會使蛋白磷酸酶2A的一個亞基(PPP2R1B)含量上升，后者會導致Akt信號通路的激活。

3.2.2 miRNAs低表達與ESCC耐藥 miRNAs并非都是一致性影響化療耐藥，Hummel等[4]培育了對CDDP、5-flu耐藥的ESCC發(fā)現(xiàn)：70%的細胞株miR-148a上調(diào)顯著增加CDDP敏感性，表現(xiàn)為：CDDP作用后細胞活力減少22.6%±7.9%至50.5%±10.6%，5-flu作用后細胞活力減少6.0%±0.8%至15.0%±4.1%，上述過程可能與CDC25B、Bcl-2相關。但5-flu耐藥ESCC細胞株暴露于5-flu沒有相應的作用。Mayne等[8]認為，術前對食管癌患者的誘導放化療所取得的臨床效果的差異性，與患者體內(nèi)miRNAs的表達差異有關，他通過對大量臨床樣本的篩查，發(fā)現(xiàn)miR-135b、miR-145在癌組織中的表達減少，提高了誘導放化療后無瘤生存期。

3.3 miRNA調(diào)控ESCC耐藥的分子機制

3.3.1 miRNAs調(diào)控細胞凋亡相關基因表達 (1)p53基因是重要的抑癌基因，化療使腫瘤細胞DNA損傷，其損傷過程將啟動 p53基因促使細胞進入G1期，進而抑制其生長并誘導凋亡；若 p53基因表達異常會影響該凋亡過程，使細胞對化療不敏感。Yuan等[9]認為：睪丸特異性基因10(testis specific 10，TSGA10)具有與miR-577相同的結(jié)合位點，miR-577/TSGA10軸將影響ESCC的G1～S期過渡，miR-577/TSGA10軸激活總是伴隨著p53通路或RB通路失活。(2) PTEN基因亦具有強大的抑癌作用，通過抑制PI3K-Akt信號通路的激活介導細胞凋亡。Li等[10]證實：敲除miR-21顯著增加PTEN蛋白的表達，增強ESCC在化療中的細胞敏感性。(3)腫瘤壞死因子凋亡誘導配體(TNF-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL)廣泛存在于食管癌中，同時也存在于正常細胞，為了提高TRAIL作用的特異性，Zhou等[11]利用由腺病毒組裝的miR-143、miR-122應答元件(Ad-TRAIL-143-122)去限制在ESCC中TRAIL表達的調(diào)控，提高了化療的療效。

3.3.2 miRNAs調(diào)控藥物外排作用相關的蛋白 P-gP是一種相對分子質(zhì)量為170×103的跨膜糖蛋白(P170)，具備能量依賴性“藥泵”功能：P-gP能將細胞內(nèi)藥物泵出細胞外，減低了細胞內(nèi)的藥物濃度使細胞產(chǎn)生耐藥性。Zhou等[12]對104例食管癌及癌旁組織進行實時定量PCR分析，發(fā)現(xiàn)在ESCC中miR-483和miR-214的表達明顯上調(diào)，與總體生存期呈負相關；術后化療臨床觀察顯示：二者的高表達可能預測化療效果不佳。miR-483和miR-214下調(diào)可以賦予P-gP相關藥物對食管癌細胞的敏感性，將增加細胞內(nèi)個阿霉素(ADR)積累和減少ADR釋放指數(shù)，表明miR-483和miR-214可能直接或間接影響細胞內(nèi)藥物的泵出。另外，下調(diào)miR-296[13]、miR-27a[14]可以增加ADR的細胞濃度，同時促進ADR介導的ESCC凋亡；另外還可以明顯減少P-gP、Bcl-2的表達以及MDR1的轉(zhuǎn)錄。

3.3.3 miRNAs調(diào)控細胞損傷后自我修復能力相關基因表達 聚腺苷酸二磷酸核糖基聚合酶1〔poly(ADP-ribose)pdymerase-1,PARP1)是存在于食管上皮的基因，在外界損傷刺激下，PARP1易被受損的DNA激活，進而引起細胞炎性反應甚至凋亡。Seki[15]認為在ESCC中miR-141通過YAP1(DNA損傷修復的重要基因)表達調(diào)控順鉑化療耐藥性；Imanaka等[16]通過實驗證明：miR-141在順鉑耐藥ESCC株中高表達，它通過調(diào)控YAP1 3′-非編碼區(qū)降低其表達從而調(diào)節(jié)順鉑耐藥性。

3.3.4 miRNAs調(diào)控腫瘤上皮間質(zhì)化(epithelial-mesenchymal trnasition,EMT)相關基因表達 EMT在胚胎發(fā)育、創(chuàng)傷修復與組織再生、上皮來源腫瘤轉(zhuǎn)移與侵襲過程和耐藥中均發(fā)揮著重要作用。Zhang等[17]在 EC9706細胞株中發(fā)現(xiàn)：上調(diào)的miR-21可以促進EMT依賴因子——轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor beta，TGF-β)表達。Yokobori等[18]將 TE-8種植到小鼠上發(fā)現(xiàn)，miR-150可以通過降解EMT誘導因子ZEB1降低其致瘤性。

3.4 miRNAs預測ESCC對藥物的療效 無論是術前輔助還是術后化療，早期患者對抗腫瘤藥物的敏感性高，但是隨著治療時間的延長患者對抗腫瘤藥物產(chǎn)生了耐受性。因而尋找可預測的生物標志輔助臨床實驗方案，以達到在篩選食管癌患者進行確切、對癥的藥物治療；近年來研究發(fā)現(xiàn)，miRNAs在食管癌的侵襲、分化、術后生存期等方面扮演了重要角色[19]。Tanaka等[20]認為：miR-200c水平預測化療反應和行食管癌NACT患者的預后，miR-200c的高表達與無進展生存期縮短有關，多變量分析確定miR200c表達水平是接受NACT食管癌患者最有價值的預后因子。Odenthal等[21]對患者接受NACT后進行手術切除和病理學評價，同時從治療前ESCC組織中和相應的手術標本中分離miRNAs，通過對NACT前后768個miRNAs分析發(fā)現(xiàn)：接受NACT后miR-192、miR-194和miR-622明顯下調(diào)，更重要的是接受NACT之前miR-192和miR-194與聯(lián)合治療后的病理評價相關，可作為參照指標。Motoori等[22]選取25例鉑類為基礎的ESCC NACT患者，利用寡核苷酸微陣列探針對其內(nèi)鏡活檢標本進行綜合基因表達譜(comprehensive gene expression profiling，GEP)基因采樣，然后利用CT掃描患者腫瘤區(qū)變化，腫瘤區(qū)面積通過NACT后減少大于50%為有效，反之小于或等于50%為無效。Motoori等構(gòu)建了包含199個基因的基因表達譜用于預測、篩選食管癌NACT對象，其準確率達到了82%。Sugimura等[23]認為可以將let7用來預測以順鉑為基礎的化療效果指標，同時let7通過調(diào)控IL-6/STAT3通路調(diào)節(jié)順鉑藥物敏感性。

4 總 結(jié)

近年來隨著研究的深入，越來越多的miRNAs及其相關通路在ESCC化療中的作用得到揭示，然而，以miRNAs為基礎調(diào)控化療效用還有不足之處，需要解決如：如何篩選特異性的miRNAs并構(gòu)建miRNAs載體；如何減少載體植入后的排異及毒性反應等問題。另外，耐藥性涉及多種因素，而miRNAs作為上游調(diào)控位點具備多靶位綜合調(diào)控，如何與化療藥物聯(lián)合，針對不同耐藥途徑中主要通路及相關基因、蛋白的表達來增強藥物的敏感性，從而實現(xiàn)對臨床個體化治療策略，有待進一步研究。

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:10.3969/j.issn.1671-8348.2015.15.041

瀘州市科技局科技創(chuàng)新苗子項目[2013-R-51(9/18)]。

胡智(1985-)，碩士，住院醫(yī)師，主要從事胸部腫瘤基礎及臨床研究。

R655.4

A

1671-8348(2015)15-2124-03

2014-09-28

2015-02-18)