王 超，金宏麗，王化磊，楊松濤，夏咸柱

西方馬腦炎（western equine encephalitis,WEE）是由西方馬腦炎病毒（western equine encephalitis virus,WEEV）感染引起，經(jīng)蚊蟲(chóng)傳播的急性人獸共患病毒性疾病。該病具有傳染性強(qiáng)、發(fā)病率及病死率高等特點(diǎn)。WEEV于1930年首次從美國(guó)加州默克郡的病馬腦內(nèi)分離，目前WEE主要分布于北美洲的加拿大、美國(guó)以及南美洲的巴西、阿根廷、墨西哥、秘魯、智利和烏拉圭等國(guó)。此病在北美呈地方性流行，以不規(guī)則的間隔時(shí)間在馬和人群中流行[1]。我國(guó)于1990年首次從新疆維吾爾自治區(qū)烏蘇縣的赫坎按蚊和博樂(lè)縣的全溝硬蜱中分離到WEEV[2]。呂新軍等[3]在我國(guó)青海省、甘肅省、黑龍江省、河南省、湖北省、安徽省、湖南省、寧夏回族自治區(qū)及新疆維吾爾自治區(qū)進(jìn)行人體血清調(diào)查，發(fā)現(xiàn)除寧夏回族自治區(qū)、黑龍江省和湖北省未發(fā)現(xiàn)WEEV抗體陽(yáng)性血清外，其余地區(qū)均存在WEEV抗體陽(yáng)性血清，WEEV抗體陽(yáng)性率達(dá)到2.71%。最近幾年我國(guó)多地出現(xiàn)不明原因腦炎病例，疑與WEEV有關(guān)，提示W(wǎng)EEV存在于我國(guó)，且有暴發(fā)流行的可能。

因WEEV感染人和馬后可導(dǎo)致極其嚴(yán)重的負(fù)面影響，受感染的人和馬也存在跨國(guó)傳染的可能性[4]，在全球引起了廣泛關(guān)注，發(fā)生疫情后必須向世界動(dòng)物衛(wèi)生組織申報(bào)[5]。此外，WEEV被視為一種潛在的生物戰(zhàn)劑（生物恐怖劑）[6-7]。目前WEE尚無(wú)獲批疫苗或有效抗病毒藥物，研發(fā)有效疫苗用于相關(guān)人群的免疫預(yù)防顯得尤其重要。本文就疫苗研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 滅活疫苗

目前，基于福爾馬林滅活WEEV制備的滅活疫苗是一種試驗(yàn)中新藥，僅適用于馬和實(shí)驗(yàn)室工作人員的預(yù)防免疫[8]。長(zhǎng)期試驗(yàn)表明：3次免疫后僅有50%的個(gè)體產(chǎn)生了有效免疫應(yīng)答，且免疫后1年僅有20%的個(gè)體仍存在特異性免疫力，因此易感人群須每年進(jìn)行加強(qiáng)免疫[9]。雖然該滅活病毒疫苗免疫效果良好，但是生產(chǎn)過(guò)程中病毒的大量繁殖須在生物安全3級(jí)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，此過(guò)程存在操作人員被WEEV感染的風(fēng)險(xiǎn)，導(dǎo)致疫苗生產(chǎn)成本居高不下，因此該疫苗的應(yīng)用受到限制[5]。

2 減毒活疫苗

目前尚無(wú)減毒活疫苗獲批上市，WEEV弱毒株的篩選處于研究階段。有報(bào)道利用反向遺傳技術(shù)，將WEEV的全長(zhǎng)cDNA進(jìn)行定點(diǎn)突變，拯救獲得了減毒的突變毒株（WE2102和WE2130）。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與母本毒株相比，減毒株在蚊體內(nèi)的復(fù)制和傳播能力明顯降低，免疫1日齡小雞2周后以WEEV強(qiáng)毒株進(jìn)行攻擊，未出現(xiàn)病毒血癥，WE2102和WE2130可作為減毒疫苗候選株[10]。

曾有一種與WEEV同屬的委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒的減毒疫苗獲批在人和馬中使用，但臨床應(yīng)用結(jié)果表明，盡管該疫苗能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生持久的保護(hù)性免疫，但近40%的疫苗接種者出現(xiàn)不同的不良反應(yīng)。此外，考慮存在神經(jīng)毒性等不安全因素，該減毒疫苗在美國(guó)已停止使用[11]。

3 亞單位疫苗

Das等[12]利用大腸桿菌表達(dá)WEEV的E1蛋白，該重組蛋白免疫小鼠后可產(chǎn)生較強(qiáng)的特異性細(xì)胞免疫和體液免疫應(yīng)答，但同源WEEV攻擊的保護(hù)率僅為25%，且對(duì)異源病毒株的攻擊無(wú)保護(hù)力。此外，該研究組又采用大腸桿菌表達(dá)了WEEV的E2蛋白，盡管E2蛋白免疫小鼠的同源WEEV攻擊保護(hù)力略高于E1蛋白，但整個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果與E1蛋白的結(jié)果無(wú)顯著差異[13]。

近來(lái)，也有研究嘗試采用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)WEEV糖蛋白以制備WEE亞單位疫苗。Toth等[14]分別構(gòu)建了表達(dá)不同WEEV糖蛋白（整個(gè)E1蛋白、E1蛋白結(jié)構(gòu)域、E26KE1多聚蛋白前體和E2-E1嵌合蛋白）的重組桿狀病毒，并同時(shí)研究不同桿狀病毒啟動(dòng)子對(duì)誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果表明，目的蛋白的性質(zhì)和啟動(dòng)子的類型均會(huì)影響重組蛋白表達(dá)的產(chǎn)量和質(zhì)量。采用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)制備的這些重組蛋白的免疫保護(hù)效果尚待動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)行評(píng)價(jià)。

4 嵌合體疫苗

近年來(lái)，辛德畢斯病毒（sindbis virus,SINV）被成功用作表達(dá)高致病性甲病毒屬腦炎病毒結(jié)構(gòu)蛋白的表達(dá)載體。Atasheva等[7]利用SINV載體首先構(gòu)建了第一代嵌合體病毒SIN/CO92，其結(jié)構(gòu)蛋白來(lái)自WEEV CO92-1356株，非結(jié)構(gòu)蛋白均來(lái)自SINV AR339株。嵌合重組病毒可在哺乳動(dòng)物和蚊蟲(chóng)細(xì)胞內(nèi)高效復(fù)制，并對(duì)6周齡小鼠無(wú)致病性。動(dòng)物免疫實(shí)驗(yàn)顯示：高劑量（5 log10PFU）的SIN/CO92嵌合體病毒免疫小鼠能有效抵抗致死劑量的WEEV攻擊，低劑量（≤4.5 log10PFU）嵌合體病毒免疫時(shí)其保護(hù)率為50%～60%。此外，Atasheva等[7]還構(gòu)建了第二代嵌合體病毒IN/SIN/McM和SIN/EEE/McM，其結(jié)構(gòu)蛋白來(lái)自WEEVMcMillan株，但其編碼RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的衣殼蛋白N-末端則分別來(lái)自SINV或東方馬腦炎病毒（eastern equine encephalitis virus,EEEV）FL93-939株，非結(jié)構(gòu)蛋白均來(lái)自 SINV AR339株。安全性和免疫原性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，部分小鼠在SIN/SIN/McM嵌合體病毒免疫后發(fā)病并死亡，提示該嵌合體病毒毒力強(qiáng)；與此相反，SIN/EEE/McM嵌合體病毒則呈現(xiàn)出高免疫原性和弱毒性，而且WEEV攻擊后的免疫小鼠保護(hù)率為100%。

Schoepp等[15]采用反向遺傳技術(shù)，拯救獲得了重組WEEV和EEEV的嵌合體病毒。該嵌合體病毒基因組5'末端的2/3來(lái)自于WEEV，編碼非結(jié)構(gòu)蛋白；3'末端的1/3來(lái)自于EEEV，編碼結(jié)構(gòu)蛋白。與母本病毒（WEEV和EEEV）相比，該嵌合體病毒的毒力顯著降低，其免疫小鼠后可有效抵抗致死劑量的EEEV攻擊，但不能抵抗致死劑量的WEEV攻擊。

5 重組活載體疫苗

5型人腺病毒（human adenovirus type 5,HAd5）載體也被應(yīng)用于WEE新型疫苗的研究。Wu等[16]利用HAd5載體構(gòu)建了表達(dá)WEEV 71V-1658株E3-E2-6K-E1結(jié)構(gòu)蛋白的重組病毒Ad5-WEEV。小鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：Ad5-WEEV免疫小鼠1次不僅可100%抵抗致死劑量的同源WEEV（71V-1658株）攻擊，還可有效抵抗致死劑量的異源病毒（CBA87）攻擊。此外，1次免疫后13周，免疫小鼠仍具有有效抵抗力。Ad5-WEEV可作為WEE暴發(fā)或WEEV生物襲擊時(shí)的候選應(yīng)急疫苗[6]。然而，作為重組活載體疫苗，人體內(nèi)已經(jīng)存在的腺病毒抗體產(chǎn)生的抗載體免疫以及腺病毒本身的安全性仍須進(jìn)一步評(píng)價(jià)。

6 DNA疫苗

Nagata等[17]制備了表達(dá)WEEV 71V-1658株結(jié)構(gòu)蛋白（C-E3-E2-6K-E1）的DNA疫苗pVHX-6。4次免疫后，同源病毒株攻擊時(shí)免疫小鼠受到100%保護(hù)，然而該疫苗對(duì)異源病毒株的攻擊僅能提供50%～62%的保護(hù)。進(jìn)一步研究表明，該DNA疫苗免疫不能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生高水平中和抗體，但能誘導(dǎo)產(chǎn)生較強(qiáng)的E1和E2抗原特異性T細(xì)胞免疫應(yīng)答。

為進(jìn)一步研究pVHX-6的哪一種編碼蛋白與保護(hù)性免疫相關(guān)，Gauci等[18]構(gòu)建了pE3-E2-6K-E1、pE3-E2和p6K-E1 3種不同的DNA疫苗。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：3次免疫后，p6K-E1、pE3-E2-6K-E1和pVHX-6免疫小鼠抗同源病毒株的保護(hù)率為100%，當(dāng)用異源病毒株CBA87攻擊時(shí)僅部分免疫小鼠受保護(hù)；用異源病毒株Fleming攻擊時(shí)，pE3-E2-6K-E1免疫小鼠的保護(hù)率為100%，pVHX-6免疫小鼠為50%，p6K-E1免疫小鼠為0。此外，pE3-E2免疫小鼠對(duì)WEEV同源病毒株或異源病毒株的攻擊均無(wú)保護(hù)力。其免疫保護(hù)缺失的原因可能是因?yàn)?K基因片段的缺失，而這個(gè)基因片段對(duì)于蛋白的正確折疊起著至關(guān)重要的作用。

7 小 結(jié)

隨著免疫學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，研究者不斷嘗試開(kāi)發(fā)新型WEE疫苗，且許多疫苗已在小鼠模型中被證實(shí)安全有效，在下一步進(jìn)入人體試驗(yàn)前可先用馬模型進(jìn)行評(píng)價(jià)。近年來(lái)，WEE不僅在北美廣泛傳播，而且正在歐洲國(guó)家逐步擴(kuò)散，加之存在的WEE跨國(guó)傳播和我國(guó)存在WEE暴發(fā)流行的可能性，我國(guó)WEE新型疫苗的研究迫在眉睫。

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