楊菊清，田可川，周光瑞，楊開倫，臧長江，張增強，周新華，劉漢民

（1.新疆伊犁職業(yè)技術(shù)學(xué)院，新疆 伊寧 835000；2.新疆維吾爾自治區(qū)畜科院畜牧所，新疆 烏魯木齊 830000；3.新疆維吾爾自治區(qū)畜禽改良總站，新疆 烏魯木齊 830000；4.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)，新疆 烏魯木齊 830052；5.新疆鞏乃斯種羊場，新疆 新源 835808；6.新疆伊寧縣畜牧局，新疆 伊寧 835100）

長期保存綿羊凍精的貯運實踐與體會

楊菊清1，田可川2，周光瑞3，楊開倫4，臧長江4，張增強5，周新華6，劉漢民5

（1.新疆伊犁職業(yè)技術(shù)學(xué)院，新疆 伊寧 835000；2.新疆維吾爾自治區(qū)畜科院畜牧所，新疆 烏魯木齊 830000；3.新疆維吾爾自治區(qū)畜禽改良總站，新疆 烏魯木齊 830000；4.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)，新疆 烏魯木齊 830052；5.新疆鞏乃斯種羊場，新疆 新源 835808；6.新疆伊寧縣畜牧局，新疆 伊寧 835100）

在攻克綿羊凍精長期保存技術(shù)后，我國生產(chǎn)的第一批綿羊顆粒凍精已創(chuàng)造了我國綿羊凍精保存時間最長的紀(jì)錄。本批凍精進(jìn)行的驗證性輸精結(jié)果均表明，凍精的品質(zhì)在長期冷凍保存期里的貯存與轉(zhuǎn)運過程中都得到了有效保護(hù)，對凍精的品質(zhì)沒有產(chǎn)生顯著的不利影響。在我國首批綿羊顆粒凍精保存時間將近40年之際，我們特總結(jié)長期保存期間該批凍精在儲存、運輸方面的成功經(jīng)驗和實踐體會，供同行參考。

綿羊；凍精；貯存；運輸；體會

20世紀(jì)70年代中期(1975年12月-1976年1月)，由新疆鞏乃斯種羊場、新疆畜牧研究所（現(xiàn)為新疆畜牧科學(xué)院畜牧所）、新疆八一農(nóng)學(xué)院（現(xiàn)為新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)）和新疆畜禽改良總站的科研人員，使用國家于1972年首次進(jìn)口的純種澳洲美利奴種公羊凍制了我國在攻克綿羊凍精長期保存技術(shù)后的第一批綿羊顆粒凍精[1,2]。該批凍精制成后，曾分批存放在新疆畜禽改良總站、新疆畜牧研究所、新疆鞏乃斯種羊場和伊犁州畜禽改良總站等單位，用于長期保存或科研使用。為了觀察保存效果，同時也根據(jù)細(xì)毛羊各時期育種計劃和科研的需要[3]，在長期保存期間使用該批凍精先后進(jìn)行了8次綿羊輸精試驗，共解凍凍精顆粒1 291粒，輸精母羊963只，產(chǎn)羔母羊363只，生產(chǎn)羔羊415只，平均受胎率為37.69%、平均產(chǎn)羔率114.33%[4]。試驗結(jié)果還表明，凍精解凍活力評分每提高0.1分，平均受胎率提高9.32%，平均產(chǎn)羔率提高8.33%[5]。目前，該批綿羊顆粒凍精已創(chuàng)造了我國綿羊凍精保存時間最長的紀(jì)錄，在保存時間將近40年之際，我們特此就該批凍精在長期保存期間儲存、運輸方面的成功經(jīng)驗和實踐體會進(jìn)行了總結(jié)。

1 凍精長期保存前的準(zhǔn)備工作

綿羊凍精保存年限在10年以上而且盡可能長遠(yuǎn)地保存下去，即可稱之為“長期保存”。通常，具有特殊利用價值種用公羊的精液才具有長期冷凍保存的必要，因此，在做出對某個種公羊精液進(jìn)行長期保存的決定時，對該種公羊的育種價值、科研價值的正確評估就顯得尤為重要。已選擇好種公羊的精液在完成凍制之后，正式進(jìn)入長期保存之前，還需要在貯存間的選址與建設(shè)、貯存容器的選擇與準(zhǔn)備、人員上崗培訓(xùn)等方面做好相應(yīng)的準(zhǔn)備工作。

1.1 貯存間的要求

用于存放凍精的貯存間，首先要求寬敞明亮，具備良好的通風(fēng)、換氣條件，防水防潮，防鼠防蟲；室內(nèi)空氣潔凈無異味，空氣質(zhì)量必須達(dá)到或者超過國家標(biāo)準(zhǔn)（具體可參照室內(nèi)空氣質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)GB50325-2001），如果選擇地下貯存室則要求將通風(fēng)換氣列為首選條件。其次，貯存間要避開熱源、有害氣體源和輻射源：避開熱源可減少液氮揮發(fā)，能有效降低精液儲存成本；揮發(fā)性有機物（VOCs）如油漆、膠粘劑、涂料等裝修材料散發(fā)的有害氣體可能間接地影響到保存質(zhì)量；輻射源發(fā)出的射線可以透過液氮罐罐體，對精子造成直接威脅。凍精貯存間的安全防護(hù)措施主要針對液氮意外外泄的處置來擬定，應(yīng)急預(yù)案及安全防護(hù)措施要在入口處張貼，使所有管理人員都清楚遇到液氮外泄時的正確處理步驟和方法。

1.2 液氮罐選擇與準(zhǔn)備

液氮罐的質(zhì)地優(yōu)劣不僅直接關(guān)系到精液保存的質(zhì)量，甚至還可決定凍精保存的成敗，所以長期使用的液氮罐必須保證質(zhì)量上乘?？筛鶕?jù)凍精數(shù)量多寡選擇不同容量的液氮罐盛放凍精，液氮容量規(guī)格通常以30~35 L為宜；本次保存過程中曾使用過60 L的液氮罐，雖然可以貯放的凍精量更多，但由于罐內(nèi)液氮的水平面大，可能導(dǎo)致?lián)]發(fā)量增大。如條件允許，在貯存間靜置長期保存的凍精可以使用儲存型的液氮貯存罐。液氮罐使用前先做好全面清洗消毒，清洗程序須嚴(yán)格按照液氮容器清洗的相關(guān)要求進(jìn)行操作，為了保證儲藏質(zhì)量，每年還要對正在使用的液氮罐內(nèi)部進(jìn)行清洗1~2次。同時需要多備2~3個液氮罐，隨時準(zhǔn)備替換舊罐或者以防不虞。

1.3 分裝與標(biāo)記

供長期保存的綿羊顆粒凍精最好放置在紗布袋里，可按照100粒/袋進(jìn)行分裝；分裝時必須注意，不同種公羊的凍精必須分開裝袋，不得混裝。分裝同時必須即時做好標(biāo)識，即預(yù)先（裝入凍精后就無法進(jìn)行標(biāo)記）在準(zhǔn)備裝入顆粒凍精的紗布袋上用標(biāo)記筆（油筆）簡單標(biāo)明序號、公羊號、凍制日期和數(shù)量；分裝后，拉緊貫穿整個紗布袋環(huán)口的粗棉線收緊袋口，以防凍精從袋中滑落，留適當(dāng)長度的棉線頭置于液氮罐外固定以防止滑脫，線頭端可縫合白布片，上面記載序號、品種、羊號、生產(chǎn)日期、精子活力及顆粒數(shù)；但須注意，如果罐口掛線太多同樣可能會增加液氮的消耗。分裝好顆粒精液的紗布袋可放入液氮罐配置的提筒內(nèi)進(jìn)行保存，也可以將紗布袋直接浸入液氮之中或者沉入罐底。以上凍精信息及分類存放的位置圖，必須清晰準(zhǔn)確地記載在紙質(zhì)登記簿上備查。

1.4 人員與崗位責(zé)任制

長期保存的綿羊顆粒凍精必須要有專人負(fù)責(zé)管理、使用和保養(yǎng)，同時需要制定崗位責(zé)任制，明確職責(zé)。所選人員必須要有高度的責(zé)任心和較好的專業(yè)素養(yǎng)，工作認(rèn)真負(fù)責(zé)，做事細(xì)致可靠。而且上崗前必須進(jìn)行專業(yè)技術(shù)培訓(xùn)，重點使之了解液氮的特質(zhì)特性，熟練掌握使用和保養(yǎng)液氮罐的基礎(chǔ)知識，牢記相關(guān)操作技術(shù)規(guī)程和發(fā)生情況時的應(yīng)急處理。

2 貯存的技術(shù)要求

隨著凍精保存時間的延續(xù)，貯存間溫度的細(xì)微改變、光線照射及微小震動等因素都可能導(dǎo)致凍精品質(zhì)的降低，進(jìn)而影響到解凍后精子的活力和授精能力，嚴(yán)重時可能導(dǎo)致前功盡棄。因此，貯存間的溫度應(yīng)盡可能地保持相對穩(wěn)定，不能大起大落，變化劇烈。本批凍精保存期間經(jīng)歷了數(shù)十個寒暑季節(jié)交替，由于條件所限，貯存間的溫、濕度隨寒暑而變化，室內(nèi)溫度：夏季10℃~20℃、冬季-20℃~5℃；相對濕度：夏季45%~60%，冬季45%~65%；在最近抽檢的19個樣品中，解凍后活力在3分（低于3分者不可用于輸精）的樣品占到89.47%，僅有10.53%的樣品解凍后活力為1分，說明現(xiàn)有的保存環(huán)境條件是基本符合綿羊凍精長期保存要求的。在本批凍精保存期間，我們主要做了以下工作：

2.1 隨時觀察罐體變化

凍精長期保存的關(guān)鍵是使凍精必須始終浸泡在液氮中，所以儲存期液氮罐的擺放狀態(tài)與位置均很重要，要求液氮罐必須始終保持直立狀態(tài)，不得傾斜、橫放、倒置、堆壓、相互撞擊或與其他物件碰撞，操作時也要做到輕拿輕放，嚴(yán)禁暴露在太陽光線下直曬；罐口要用罐塞蓋好，但又不能密閉，以防爆罐。同時管理人員必須隨時對貯存間的所有儲精液氮罐進(jìn)行逐一詳細(xì)檢查，檢查內(nèi)容包括液氮罐的狀態(tài)和液氮的損耗。如發(fā)現(xiàn)液氮罐罐體有出汗、頸口結(jié)霜等異?，F(xiàn)象，都是容器隔熱性能變差的表現(xiàn)，應(yīng)立刻停止使用，速將凍精轉(zhuǎn)入其他性能好的罐內(nèi)。

2.2 定期液氮補充

保存期間，每隔一周（7 d）要檢查一次罐內(nèi)的液氮容量，當(dāng)剩余液氮為液氮罐容量的2/3時，就應(yīng)及時進(jìn)行補充。管理人員可根據(jù)液氮罐的體積編排出液氮補充的周期表，張貼備忘；還可采用稱重法或木條測量的方法推算出罐內(nèi)液氮存量和應(yīng)補充量，稱重法：將液氮罐放在臺秤上測重，如YDS-30型液氮罐的空重為13 kg，滿重為38.5 kg，用滿罐時的重量減去現(xiàn)有秤重，就是應(yīng)補充的的液氮重量，然后按照一立升液氮重0.8 kg計，可以推測出需添補的液氮量；木條測量法簡便實用：用一根細(xì)木棒插入液氮內(nèi)數(shù)秒鐘，將細(xì)棒迅速取出在空氣中搖晃幾下，插入液氮的部份因溫度低而結(jié)成白霜，很易容檢測出罐內(nèi)液氮的存量水平。在補充液氮時，一定要注意防護(hù)，避免凍傷、噴濺、窒息等現(xiàn)象的發(fā)生。

2.3 按計劃抽檢品質(zhì)

為了隨時掌握凍精的保存質(zhì)量，有必要制定計劃進(jìn)行定期抽檢?？紤]到本批凍精的珍貴程度和有限數(shù)量，本批凍精每年只抽檢1次，而且采取“一罐一樣”，即不對同一罐中的所有公羊凍精全部抽測，而是隨機取1個樣品（3?；炀┐?。抽查時，應(yīng)先將放置凍精的提筒略微提高，使提筒離開底座，再將提筒平行移至液氮罐的中央部位，順其自然向上提，動作要輕便迅捷，不得使用蠻力，以免扭彎或折斷提筒的把柄，同時還要注意避免提筒擦碰液氮罐的頸管和內(nèi)壁，造成損壞；提筒嚴(yán)禁提出液氮罐外，在罐內(nèi)脫離液氮的時間不得超過10 s。如果是直接沉入罐底的紗布袋，則可將棉線輕輕牽出，用在液氮中浸泡過的長鑷子解開袋口取出精液顆粒，同樣袋口不得離開液氮面10 s。完成抽樣后，提筒手柄要在分度圈內(nèi)放妥，蓋好罐塞以減少液氮蒸發(fā)。

2.4 記錄備案

凍精保存過程中，每次出、入庫過程都有詳細(xì)的登記備忘材料，精液分發(fā)、損耗報廢的冷凍精液數(shù)量、存罐補充液氮的數(shù)量等必須如實記載清楚，并且做到每月結(jié)算。每次品質(zhì)抽檢都要有記錄，記載內(nèi)容包括：抽檢時間、罐號、公羊號、活力評分等內(nèi)容。因工作需要進(jìn)行管理人員更換時，要有交接記錄。

3 凍精轉(zhuǎn)運中應(yīng)注意的事項

本批保存的澳洲美利奴羊凍精彌足珍貴，對我區(qū)乃至我國細(xì)毛羊業(yè)的發(fā)展影響巨大且深遠(yuǎn)。由于中國美利奴羊（新疆型）及其各品系類型（細(xì)毛型、毛密品系、毛質(zhì)好品系等）育種與科學(xué)研究的需要，本批凍精在保存期間，經(jīng)常轉(zhuǎn)運分發(fā)到各羊場或者牧區(qū)配種站進(jìn)行輸精，轉(zhuǎn)運距離動輒數(shù)百千米，期間使用的運輸工具除液氮運輸車外，還有小汽車、小型貨運車、摩托車和犍牛等。其中，1991年9月間，在新疆鞏乃斯種羊場的卡拉干特夏牧場配種站進(jìn)行試驗性輸精時，在陡峭的山路上是使用犍牛馱運的，裝有凍精的液氮罐被綁在犍牛背的鞍韉上馱行了2 h抵達(dá)配種站，輸精結(jié)束（輸精20 d）后，同樣用犍牛馱行從原路返回；2008年8月，在尼勒克縣唐布拉夏牧場配種站試驗性輸精所用凍精，在崎嶇的山路上則是采用摩托車運送的，凍精被運到海拔高程近3 000 m的配種站進(jìn)行輸精；兩次輸精試驗結(jié)束后剩余的精液均在返回基地后繼續(xù)保存。由于轉(zhuǎn)運過程中的強烈震動也會降低凍精的品質(zhì)，因此，一定要認(rèn)真仔細(xì)地做好運輸途中的管理。

3.1 使用運輸型液氮貯運罐

為了滿足長途運輸?shù)臈l件，運輸型液氮貯運罐作了專門的防震設(shè)計，可承擔(dān)運輸和振動。液氮罐在長途運輸過程中必須套上厚外套，然后裝在木架內(nèi)并墊好軟墊，罐與罐之間要用填充物隔開，防止顛簸撞擊，避免劇烈的碰撞和震動，特別要嚴(yán)防傾倒發(fā)生事故。裝卸車時則要避免液氮罐碰擊，更不能在地上隨意拖拉，以免縮減液氮罐的使用壽命。用車輛輸送和搬運時，液氮由于車輛的振動而跟著振蕩，從而增加消耗速度，因此需要計算好液氮存量，或者做好中途補充的準(zhǔn)備。長途運輸途中，如遇到三級或三級以下的路面，汽車的時速不宜超過30 km/h。

3.2 選擇容積較小的容器運輸

在短時間、短距離內(nèi)轉(zhuǎn)運凍精，可以選擇容積較小的容器運輸，如5~15 L的小型液氮罐即可以用于貯存凍精，必要時還可以運送液氮。前往交通不便的深山牧區(qū)配種站運送凍精，則要計算好液氮的消耗量，提前做好準(zhǔn)備，隨時添注液氮。我們的做法是在距離配種站最近的公路合適處，建立臨時液氮補充點，使得裝有凍精的液氮罐在上山前、下山后，均盡可能得到最快的補充。在不具備交通條件的牧區(qū)轉(zhuǎn)運精液時，建議不要用液氮罐中的提筒貯存精液，而是直接將凍精袋沉入液氮最為安全便捷。

4 討論

4.1 綿羊凍精長期保存是系統(tǒng)工程，沒有國家的大力支持是難以完成的

凍精的長期保存條件要求非常高，期間需要不間斷地投入大量的人力、物力和財力，僅靠保存單位的資金投入是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的。目前，在本批凍精保存的40年里，新疆畜科院畜牧所、新疆畜禽改良總站、新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)、新疆鞏乃斯種羊場、伊犁州畜禽改良站等單位數(shù)以百計的科技人員參與了此項工作，并為之付出了辛勤的勞動，這是無法用金錢計算的；同時在凍精保存上的直接開支也是巨大的，據(jù)初步統(tǒng)計，本批凍精保存期間的液氮損耗總量就達(dá)到了7 000 L。

4.2 綿羊凍精的長期保存在學(xué)術(shù)研究和生產(chǎn)上均有重大意義

綿羊精液冷凍保存，有利于育種和優(yōu)質(zhì)基因的保存，使用上可不受種公羊生命、時間和地域的限制，無論在學(xué)術(shù)研究上，還是在生產(chǎn)上都有重要的意義和價值。如幾次試驗性輸精配種，除順利完成了育種計劃和科學(xué)研究的內(nèi)容外，還對試驗羊場現(xiàn)有的羊群起到了換血的作用，對試驗羊場的生產(chǎn)水平和羊群品質(zhì)提高起到了積極推動作用。盡管綿羊冷凍精液還有許多理論、技術(shù)和方法等問題至今沒有很好的解決，與使用鮮精相比，受胎率還有一定的差距[6]，但對綿羊冷凍精液研究與探索的步伐并沒有停滯。由于本批綿羊凍精的特殊性，缺乏與之進(jìn)行直接比較的參考數(shù)據(jù)，但作為該領(lǐng)域的先行者，收集積累的各種試驗數(shù)據(jù)，可以對今后同類型科研實踐起到指導(dǎo)與借鑒的作用。

4.3 新疆在綿羊凍精長期保存這方面的研究探索處于國內(nèi)領(lǐng)先地位

理論上，凍精是可以無限期地進(jìn)行保存的，但冷凍精液的保存期限到底有多長，在醫(yī)學(xué)界曾引起巨大爭議，至今尚無定論。迄今國內(nèi)的相關(guān)文獻(xiàn)報道中，以本批綿羊凍精保存的期限最為長久，而國外（澳大利亞）只是報道了使用冷凍保存16年綿羊精液進(jìn)行的人工授精試驗（其受胎率達(dá)58%~66%）[7]，但此以后再未見類似的文獻(xiàn)報道。本批凍精進(jìn)行的系列驗證性輸精的結(jié)果多次證明，綿羊精液確實是可以長期保存，使用經(jīng)過長期冷凍保存的精液輸精也不會增大產(chǎn)生畸形羔羊的比例[8]；試驗結(jié)果還表明，本批綿羊精液在長期冷凍保存過程中的正常貯、運活動對凍精的品質(zhì)均沒有產(chǎn)生顯著的不利影響。

[1]胡連志，楊菊清，郭文惠，等.腹腔境綿羊?qū)m內(nèi)輸精初試[J].中國畜牧雜志,1989, 25(5):22.

[2]胡連志，徐佩賢，段長存，等.冷凍保存十五年的綿羊精液受胎效果[J].草食家畜,1993,(3):20.

[3]田可川,阿扎提,史梅英,等．保存20年的美利奴羊凍精腹腔鏡輸精試驗[J].中國畜牧雜志,1999,(1):33.

[4]楊菊清,張增強,周光瑞,等.綿羊凍精不同保存年限的受胎效果連續(xù)觀察[J].草食家畜,2009,（3）:40-43.

[5]楊菊清,楊風(fēng)云,張增強,等.長期保存綿羊凍精的解凍活力與受胎效果觀察[J].中國草食動物科學(xué), 2013, 33(1):26-29.

[6]趙有璋.中國養(yǎng)羊?qū)W[M].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社.2013.

[7]福井豐,王鳳瑞.綿羊凍精的長期保存[J].草食家畜,1986,(02): 10.

[8]周光瑞,楊菊清,等．長期保存的綿羊凍精輸精受胎效果觀察[J].2010年新疆畜牧獸醫(yī)學(xué)會年會論文集,新疆畜牧獸醫(yī)學(xué)會內(nèi)部資料,2010:1-3．

Storage and Transport of Long-term Preservation of Sheep Frozen-semen

YANG Ju-qing1,TIAN Ke-chuan2, ZHOU Guang-rui3，YANG Kai-lun4，ZANG Chang-jiang4，ZHANG Zeng-qiang5, ZHOU Xing-hua6，LIU Han-min5

（1.Yili Vocational Technolgy College，Yining 835000，China; 2．Animal Science Academy of Xinjiang Uygur Autonomous Region，Urumqi 830000，China; 3．Animal Breeding & Improving Station of Xinjiang Uygur Autonomous Region，Urumqi 830000，China; 4．Xinjiang Agricultural University，Urumqi 830052，China; 5．Xinjiang Gongnaisi Stud Farm，Xinyuan Xinjiang 835808，China; 6. Animal Husbandry Bureau of Yining County，Yining 835808，China）

With the development of preservation technology of sheep frozen-semen, the first batch of sheep frozen-semen recorded the longest storage time period in China. Testing results showed that the quality of sheep frozen-semen was effectively protected during storage and transport. Moreover, it also showed that we have led the world in the research of long-term preservation of sheep frozen-semen. After reaching a 40-year storage record of the first sheep frozen-semen, we summarized the successful experience in sheep frozensemen storage and transport during the long -term preservation in order to provide references for semen preservation.

sheep；frozen-semen；storage；transport

S826

B

1003－6377（2015）04－0026-05

國家絨毛用羊現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)項目(CARS-40-43）

楊菊清（1964-），男，博士，農(nóng)業(yè)推廣研究員，長期從事綿羊科研、育種、生產(chǎn)與教學(xué)工作。E-mail：497210459@qq.com

2015-04-11，

2015-04-23