魏清泉, 李運(yùn)濤, 任魯風(fēng), 周曉光, 俞育德

1.中國(guó)科學(xué)院半導(dǎo)體研究所, 集成光電子學(xué)國(guó)家聯(lián)合重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 100083;2.中國(guó)科學(xué)院北京基因組研究所, DNA序列測(cè)定技術(shù)研究開(kāi)發(fā)中心, 北京 100029;3.中國(guó)科學(xué)院半導(dǎo)體研究所/中國(guó)科學(xué)院北京基因組研究所-生物信息獲取與傳感技術(shù)聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室, 北京 100083

零模波導(dǎo)原理、制備及其在單分子熒光檢測(cè)中的應(yīng)用

魏清泉1,3, 李運(yùn)濤1,3, 任魯風(fēng)2,3, 周曉光1,3, 俞育德1,3

1.中國(guó)科學(xué)院半導(dǎo)體研究所, 集成光電子學(xué)國(guó)家聯(lián)合重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 100083;2.中國(guó)科學(xué)院北京基因組研究所, DNA序列測(cè)定技術(shù)研究開(kāi)發(fā)中心, 北京 100029;3.中國(guó)科學(xué)院半導(dǎo)體研究所/中國(guó)科學(xué)院北京基因組研究所-生物信息獲取與傳感技術(shù)聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室, 北京 100083

單分子熒光檢測(cè)作為一種能夠表征分子個(gè)體性質(zhì)及行為的分析方法，有助于揭示利用傳統(tǒng)熒光檢測(cè)方法無(wú)法得到的信息，在近年來(lái)受到人們的廣泛關(guān)注。利用傳統(tǒng)光學(xué)檢測(cè)設(shè)備進(jìn)行單分子熒光檢測(cè)時(shí)，由于受到衍射極限的限制，同時(shí)為了保證在觀測(cè)體積內(nèi)只有單個(gè)熒光分子，僅能采用無(wú)限稀釋溶液的方法實(shí)現(xiàn)單分子熒光檢測(cè)。雖然這種方法可以滿足單分子檢測(cè)的要求，但是由于大部分酶分子正常工作時(shí)底物的生理濃度都非常高，底物濃度的大幅度降低會(huì)對(duì)酶分子的反應(yīng)機(jī)制等方面造成影響。零模波導(dǎo)作為一種新型的單分子檢測(cè)器件，通過(guò)納米微孔結(jié)構(gòu)突破了光學(xué)衍射極限的限制將觀測(cè)體積降至仄升量級(jí)(10-21L)，使得在生理濃度范圍內(nèi)檢測(cè)單分子熒光成為可能，在單分子熒光檢測(cè)領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。因此，就零模波導(dǎo)的原理、制備工藝及其在單分子DNA測(cè)序、生物膜、生物大分子之間的相互作用及單分子反應(yīng)動(dòng)力學(xué)方面的具體應(yīng)用進(jìn)行綜述。

零模波導(dǎo)；單分子；納米微結(jié)構(gòu)器件

20世紀(jì)90年代以來(lái)，物理學(xué)家們發(fā)明了許多新型的觀測(cè)和操控技術(shù)，例如單分子熒光、光鑷、磁鑷等，將分子生物學(xué)與物理學(xué)的交叉領(lǐng)域推進(jìn)到了單分子水平。單分子分析技術(shù)在分子生物學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用可以揭示掩蓋在集群研究方法平均效應(yīng)中的個(gè)體行為，因此在單分子水平研究分子間相互作用、單分子酶動(dòng)力學(xué)，并揭示細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)的分子機(jī)制等具有重要意義[1～3]。

在傳統(tǒng)的單分子熒光研究中，普通的光學(xué)設(shè)備都受到光學(xué)衍射極限的限制，觀測(cè)體積大約為飛升(10-15L)量級(jí)，為了在觀測(cè)體積內(nèi)只有一個(gè)熒光分子,需要將溶液稀釋到納摩爾至皮摩爾每升量級(jí)的濃度[4]。但是在生物體系中，大多數(shù)酶在正常工作時(shí)配體濃度都遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于普通衍射極限光學(xué)設(shè)備能夠檢測(cè)的范圍，一般在微摩爾至毫摩爾每升量級(jí)[5]。當(dāng)配體的濃度低于正常濃度范圍時(shí)，酶的動(dòng)力學(xué)機(jī)制及其催化反應(yīng)過(guò)程可能受到影響[6]。因此，為了保證在正常濃度的生物環(huán)境中觀測(cè)單個(gè)分子，光學(xué)觀測(cè)體積至少要減小3～6個(gè)數(shù)量級(jí)。同時(shí)，觀測(cè)體積的減小可以有效縮短分子在觀測(cè)體積內(nèi)的擴(kuò)散時(shí)間，對(duì)于改善單分子檢測(cè)時(shí)的時(shí)間分辨率具有積極作用[7]。

鑒于減小光學(xué)檢測(cè)設(shè)備觀測(cè)體積的重要性，人們積極開(kāi)發(fā)新的檢測(cè)技術(shù)和方法，并取得了很好的成果，例如，全內(nèi)反射熒光顯微鏡(total internal reflection fluorescence microscopy，TIRFM)通過(guò)入射光全反射后在介質(zhì)表面產(chǎn)生消逝波的特性將觀測(cè)體積減小10倍左右[8]。雖然TIRFM對(duì)總的觀測(cè)體積減小的不是很多，但是由于消逝波的存在將有效觀測(cè)范圍僅限制在觀測(cè)界面約200 nm以下范圍，大大降低了背景光噪聲干擾，由于其便于與其他技術(shù)聯(lián)用進(jìn)一步提高檢測(cè)靈敏度，在單分子檢測(cè)領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用[9～11]；近場(chǎng)光學(xué)掃描顯微鏡(near-field scanning optical microscope， NSOM)利用光通過(guò)變芯徑光纖末端的納米孔將觀測(cè)體積限制在橫向距離50 nm左右，觀測(cè)體積大約為一個(gè)阿升(10-18升)，早在20世紀(jì)90年代初，就有人利用其在支持物表面上實(shí)現(xiàn)了單分子檢測(cè)[12，13]；近些年，利用納米通道(nanochannels)限制光學(xué)觀測(cè)體積實(shí)現(xiàn)單分子檢測(cè)的方法被大量報(bào)道[14～17]，該方法主要是利用微小通道的深度限制了觀測(cè)體積的深度，照射在通道上的光斑形狀限制了觀測(cè)面積，從而形成了三維觀測(cè)體積，據(jù)報(bào)道納米通道的高度最低可達(dá)到5 nm[18,19]，因此觀測(cè)體積非常小，但是這種方法的不足之處是器件制備工藝復(fù)雜，價(jià)格昂貴，較難實(shí)現(xiàn)高通量檢測(cè)。

零模波導(dǎo)(zero-mode waveguides，ZMWs)作為一種新型的單分子檢測(cè)器件，在減小光學(xué)設(shè)備的觀測(cè)體積及提高檢測(cè)通量方面均有極好的效果，并在近些年被人們逐漸用于生物體系的研究當(dāng)中。本文就ZMWs原理、加工技術(shù)及其在單分子檢測(cè)中的應(yīng)用進(jìn)行總結(jié)和分析。

1 ZMWs原理

早在1944年，Bethe[20]發(fā)表了關(guān)于光在微孔中衍射理論的文章，并發(fā)現(xiàn)當(dāng)微孔的直徑小于光的波長(zhǎng)時(shí)，光強(qiáng)會(huì)急劇衰減，這一獨(dú)特的光學(xué)現(xiàn)象奠定了ZMWs的理論基礎(chǔ)。2003年，Levene等[7]采用ZMWs技術(shù)在高濃度溶液中成功檢測(cè)了單分子，開(kāi)創(chuàng)了ZMWs應(yīng)用雛形。ZMWs結(jié)構(gòu)主要是由石英玻璃襯底及表面帶有納米級(jí)別直徑通孔的金屬層構(gòu)成，大量的微孔可以同時(shí)制備在同一個(gè)芯片上有效地提高ZMWs的檢測(cè)通量，如圖1所示。入射光從石英玻璃襯底開(kāi)始照射，由于ZMWs存在一個(gè)截止波長(zhǎng)λc，大于該波長(zhǎng)的光不能在波導(dǎo)中傳輸，而是在微孔入口處產(chǎn)生消逝波。截止波長(zhǎng)與ZMWs結(jié)構(gòu)的形狀及尺寸相關(guān)，對(duì)于給定的圓孔波導(dǎo)結(jié)構(gòu)(孔直徑為 d)，截止波長(zhǎng)可以通過(guò)關(guān)系式λc=1.7d計(jì)算得到。消逝波的能量l(z)隨著消逝波的傳輸深度(z)呈現(xiàn)指數(shù)衰減形式，如公式1所示[7， 21]：

(1)

其中，Λ為衰減指數(shù)，λ是入射光波長(zhǎng)。

在入射光波長(zhǎng)大于λ時(shí)，微孔中沒(méi)有光傳輸模式，因此將這種波導(dǎo)模式稱為“零模波導(dǎo)”(ZMWs)。由于入射光的光斑遠(yuǎn)大于納米微孔直徑，可以近似將入射光在微孔上的照射輪廓視為恒定不變，并且在微孔中軸線方向呈現(xiàn)指數(shù)衰減形式。如果將耦合效率及熒光基團(tuán)的發(fā)光效率視為與入射光在在微孔上的照射輪廓相關(guān)，則在ZMWs結(jié)構(gòu)中的觀測(cè)輪廓可以由公式2計(jì)算得到，有效觀測(cè)體積可由公式3得到[7,22,23]。

S(z)=e-z/l=e-3z/Λ

(2)

(3)

圖1 ZMWs二維及三維結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 Dimensional and three-dimensional structure schematic diagrams of ZMWs.

在單分子檢測(cè)過(guò)程中，將單個(gè)目標(biāo)分子通過(guò)一定的方式固定在ZMWs微孔底床，然后在含有熒光標(biāo)記的目標(biāo)分子配體溶液中進(jìn)行檢測(cè)，入射光從石英玻璃的底部照射，并從同一側(cè)觀測(cè)發(fā)射熒光，如圖2所示。在熒光信號(hào)檢測(cè)過(guò)程中，由于ZMWs的尺寸非常小，大約在100 nm以內(nèi)，同時(shí)由于消逝波在微孔中的傳播深度有限，限制了有效觀測(cè)體積，減小了在觀測(cè)體積中游離熒光標(biāo)記配體的數(shù)目，從而更加容易區(qū)分目標(biāo)熒光信號(hào)與背景噪聲。以直徑為100 nm的圓形微孔型ZMWs為例，用波長(zhǎng)為488 nm的入射光照射，有效觀測(cè)體積約為125仄升(125×10-21L)，相當(dāng)于濃度為10 μmol/L的溶液中單個(gè)分子占據(jù)的體積，因此ZMWs能夠在生理環(huán)境相關(guān)濃度溶液中觀測(cè)單個(gè)分子。

圖2 ZMWs單分子檢測(cè)裝置示意圖Fig.2 Schematic diagram of ZMWs single molecule detection device.

2 ZMWs器件制備

2003年Levene等[7]提出ZMWs在單分子檢測(cè)中的應(yīng)用后，人們陸續(xù)對(duì)ZMWs器件的制備工藝及結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究和改進(jìn)。ZMWs結(jié)構(gòu)中廣泛采用的金屬層是鋁，這是由于鋁具有短的光學(xué)趨膚深度及高的反射特性。但是鋁的化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定，因此出現(xiàn)了用金代替鋁的研究[24]。金的優(yōu)點(diǎn)是化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定不易氧化，同時(shí)由于金表面自組裝修飾方法發(fā)展非常成熟，金表面修飾化學(xué)更加容易[25,26]。在金屬膜表面上制備幾十至幾百納米級(jí)別的微孔可以通過(guò)電子束曝光，隨后以干法刻蝕的方法[7,23]或直接在金屬層上利用聚焦離子束進(jìn)行微孔制備[27，28]。

人們還提出利用金屬剝離的方法進(jìn)行ZMWs器件制備[29～33]，工藝流程如圖3A所示，在清潔的襯底表面旋涂電子束光刻膠，經(jīng)過(guò)電子束光刻后，在襯底上形成尺度與要制備的ZMWs相當(dāng)?shù)哪z柱，沉積金屬以后再剝離，在膠柱的位置就形成了ZMWs微孔。雖然通過(guò)電子束光刻與金屬剝離相結(jié)合的方法能夠有效預(yù)防金屬碎渣的存在，但是電子束光刻技術(shù)的成本太高，且產(chǎn)出量很低，因此不適合規(guī)模化生產(chǎn)ZMWs器件。2011年，Wada等[34]提出利用紫外納米壓印與金屬剝離相結(jié)合的方法制備ZMWs器件，工藝流程如圖3B所示。與電子束光刻—金屬剝離工藝相比，這種方法利用了一種能夠在紫外光下固化同時(shí)能夠溶解在有機(jī)溶劑四氫呋喃中的膠NIAC707，膠柱的形成過(guò)程省去了價(jià)格昂貴的電子束光刻過(guò)程，只需要在掩模板下較短時(shí)間光照即可形成膠柱，隨后進(jìn)行清洗、金屬蒸鍍及剝離即可形成ZMWs器件，應(yīng)用該方法已成功制備了孔直徑在30～150 nm的ZMWs器件，并通過(guò)實(shí)際的單分子熒光檢測(cè)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了器件的可行性。

最近，Teng等[35]還提出一種相對(duì)廉價(jià)的工藝方法制備零模波導(dǎo)器件(圖4)，主要分為兩步，首先通過(guò)傳統(tǒng)的光刻、金屬沉積及金屬剝離等方法制備微米級(jí)的金屬微孔，然后通過(guò)電鍍的方式將微米級(jí)的微孔縮小至零模波導(dǎo)所要求的尺寸。通過(guò)這種工藝，可將770 nm的微孔通過(guò)電鍍的方式縮小至70 nm，深度為450 nm，并成功實(shí)現(xiàn)了單分子熒光檢測(cè)。這種新工藝將成熟的微光刻與電鍍技術(shù)相結(jié)合達(dá)到了制備納米級(jí)別小孔的目的，與直接利用聚焦離子束或電子束光刻等技術(shù)制備納米級(jí)微孔相比，價(jià)格低廉、制備通量高，但是受到金屬晶粒大小的影響，電鍍后小孔的形狀由電鍍前的圓形變?yōu)闄E圓形，同時(shí)如何精確控制最終縮小后的納米級(jí)小孔的尺寸有待進(jìn)一步考證。

圖3 電子束光刻-金屬剝離(A) [32]及紫外納米壓印-金屬剝離工藝流程圖(B)[34]Fig.3 Process flow diagram of electron beam lithography-metal peeling (A) [32] and UV nanoimprint-metal peeling (B)[34].

圖4 光刻與電鍍技術(shù)相結(jié)合制備零模波導(dǎo)器件工藝示意圖[35]Fig.4 Process scheme of zero-mode waveguide devices preparation by lithography combined with electroplating technology[35].

傳統(tǒng)的ZMWs結(jié)構(gòu)中的微孔只是在襯底表面金屬上形成，這種結(jié)構(gòu)在實(shí)際應(yīng)用中，單分子熒光信號(hào)會(huì)受到溶液中背景信號(hào)的干擾，為了進(jìn)一步提高ZMWs的信噪比，Miyake等[36，37]提出了一種改進(jìn)型ZMWs結(jié)構(gòu)(見(jiàn)圖5)，主要是在傳統(tǒng)ZMWs結(jié)構(gòu)微孔底部的石英玻璃襯底進(jìn)一步刻蝕形成一定深度的微孔。在這種結(jié)構(gòu)中，石英玻璃襯底上的納米孔部分不是近場(chǎng)的有效體積部分，但是屬于觀測(cè)體積部分。由于金屬層的存在，光強(qiáng)在金屬層與石英玻璃的交界面處開(kāi)始消失，同時(shí)由于激發(fā)光的最大強(qiáng)度值位于微孔深度的四分之一波長(zhǎng)處，因此微孔底部的熒光染料分子受到的激發(fā)光和傳統(tǒng)ZMWs相比更強(qiáng)，同時(shí)發(fā)射熒光由于沒(méi)有金屬層的阻擋更加容易傳輸?shù)侥跨R。通過(guò)實(shí)驗(yàn)，Miyake等還證明當(dāng)石英玻璃上的納米微孔刻蝕深度為60 nm時(shí)，熒光強(qiáng)度值大約是傳統(tǒng)ZMWs結(jié)構(gòu)的2倍，2013年該小組通過(guò)理論計(jì)算說(shuō)明這種改進(jìn)型ZMWs信噪比能夠較傳統(tǒng)結(jié)構(gòu)提高6倍，信噪比的提高將有助于增強(qiáng)在生理濃度溶液中單分子熒光成像的時(shí)間分辨率[38]，因此這種改進(jìn)型ZMWs結(jié)構(gòu)對(duì)于提高ZMWs信噪比具有重要意義。

圖5 改進(jìn)型ZMWs結(jié)構(gòu)示意圖Fig.5 Schematic diagram of improved ZMWs.

如上所述，大部分ZMWs的掩蓋層都是金屬，金屬層會(huì)對(duì)單分子熒光的壽命造成影響[39]，這可能是由于金屬的導(dǎo)電性導(dǎo)致電子泄露，進(jìn)而對(duì)熒光分子造成非輻射性的損傷，同時(shí)金屬對(duì)光的吸收導(dǎo)致溫度升高也會(huì)對(duì)熒光壽命或信號(hào)質(zhì)量造成影響。為了克服金屬層的不足之處， Ono等[40]嘗試用全氟聚合物Cytop制備了ZMWs器件(見(jiàn)圖6)。這種新型聚合物ZMWs器件有望減少電子泄露及熱效應(yīng)對(duì)單分子檢測(cè)的影響，但是具體應(yīng)用效果有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

圖6 全氟聚合物Cytop制備ZMWs工藝流程示意圖[40]Fig.6 Flow chart of ZMWs preparation using perfluoropolymers Cytop[40].

3 ZMWs在單分子檢測(cè)中的應(yīng)用

3.1 單分子DNA測(cè)序

DNA測(cè)序技術(shù)經(jīng)過(guò)幾十年的發(fā)展，經(jīng)過(guò)了第一代、第二代及目前興起的第三代測(cè)序技術(shù)的發(fā)展歷程[41～43]。第一代測(cè)序技術(shù)即為統(tǒng)治了測(cè)序市場(chǎng)30年之久的特定克隆測(cè)序技術(shù)，由于這種技術(shù)可以對(duì)相對(duì)少量的特定位點(diǎn)、克隆產(chǎn)物和PCR產(chǎn)物的序列進(jìn)行測(cè)定，目前在實(shí)際工作中仍有應(yīng)用。2005年出現(xiàn)的第二代高通量測(cè)序技術(shù)徹底改變了測(cè)序的規(guī)?；M(jìn)程，使得以前遙不可及的基因組測(cè)序工作簡(jiǎn)單到一個(gè)常規(guī)實(shí)驗(yàn)室都可以進(jìn)行，本研究小組也成功自主研制了基于焦磷酸測(cè)序原理的第二代基因測(cè)序儀，并進(jìn)行了Glaciecolamesophilasp. nov.的全基因組測(cè)序和組裝[44]。雖然第二代測(cè)序技術(shù)在廣泛應(yīng)用，但是其本身也有難以克服的技術(shù)瓶頸，例如需要經(jīng)過(guò)模板擴(kuò)增，并且讀長(zhǎng)較短。鑒于二代測(cè)序技術(shù)的不足，不經(jīng)過(guò)擴(kuò)增、讀長(zhǎng)長(zhǎng)及通量高的第三代測(cè)序技術(shù)成為了新的挑戰(zhàn)，基于微納制造技術(shù)的納米微結(jié)構(gòu)器件則是第三代測(cè)序技術(shù)的的核心和技術(shù)難點(diǎn)[45]。

ZMWs作為一種能夠在生理濃度溶液中檢測(cè)單分子熒光的技術(shù)在第三代測(cè)序中受到了廣泛的關(guān)注。將ZMWs首次應(yīng)用于單分子DNA測(cè)序[7]研究前，研究人員比較了在直徑43 nm ZMWs中獲得的熒光信號(hào)與在濃度為4 nmol/L的熒光染料分子溶液中采集的傳統(tǒng)衍射極限熒光相關(guān)光譜，結(jié)果顯示，ZMWs可以接受的溶液濃度大約比傳統(tǒng)衍射極限熒光相關(guān)光譜提高了3個(gè)數(shù)量級(jí)。同時(shí)，ZMWs具有很好的時(shí)間分辨率，在直徑分別為43 nm和66 nm的微孔中，熒光染料分子的滯留時(shí)間僅為幾個(gè)微秒，要比傳統(tǒng)衍射極限熒光相關(guān)光譜檢測(cè)過(guò)程中的滯留時(shí)間縮短了一個(gè)數(shù)量級(jí)，同時(shí)還比大多數(shù)酶反應(yīng)速率快3個(gè)數(shù)量級(jí)，因此在ZMWs檢測(cè)單分子熒光過(guò)程中很容易區(qū)分自由擴(kuò)散至觀測(cè)體積內(nèi)的染料分子與吸附在酶分子上的染料分子所發(fā)出的熒光。因此，在驗(yàn)證了ZMWs可以在高濃度溶液中高時(shí)間分辨率識(shí)別單分子熒光信號(hào)的能力后，Levene等[7]利用ZMWs觀測(cè)了聚合酶合成DNA雙鏈的過(guò)程，首先將單個(gè)T7 DNA聚合酶通過(guò)物理吸附的方式固定在納米孔底部，然后注入能夠保證M13DNA進(jìn)行有效連續(xù)合成反應(yīng)的各種試劑，其中以香豆素-dCTP代替dCTP。隨后單個(gè)ZMWs納米孔中的熒光持續(xù)時(shí)間被觀測(cè)到，全部聚合反應(yīng)時(shí)間大約30 min，每秒鐘大約有1～3次的光閃爍，代表每秒約有1～3個(gè)dCTP結(jié)合至模板上，這一結(jié)果與在本體溶液中的合成速率一致的(每秒約為10～15 bp)，同時(shí)與模板上平均含有約20%的鳥(niǎo)嘌呤的含量是一致的。雖然以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果在實(shí)際測(cè)序過(guò)程中有待進(jìn)一步的優(yōu)化，但是已經(jīng)為ZMWs在單分子DNA測(cè)序的應(yīng)用開(kāi)創(chuàng)了先例。

Pacific Biosiences公司在以上研究成果的基礎(chǔ)上對(duì)ZMWs應(yīng)用于單分子DNA測(cè)序的技術(shù)進(jìn)行了進(jìn)一步研究[46～48]，并推出了商品化單分子DNA測(cè)序儀(single molecule real time，SMRT)。SMRT技術(shù)的具體原理如圖7(彩圖見(jiàn)圖版二)所示：在測(cè)序過(guò)程中，由固定的酶根據(jù)單鏈DNA模板合成雙鏈。每次加入一個(gè)堿基，聚合酶捕獲具有熒光標(biāo)記的dNTP，并將其帶到檢測(cè)區(qū)間，產(chǎn)生熒光光曝，光曝的熒光顏色就揭示了模板上的互補(bǔ)堿基。通過(guò)連續(xù)實(shí)時(shí)監(jiān)控每個(gè)波導(dǎo)孔的熒光光曝，就快速測(cè)定了每一個(gè)孔內(nèi)DNA模板的序列。這種利用ZMW進(jìn)行的單分子實(shí)時(shí)檢測(cè)技術(shù)在高速測(cè)序、長(zhǎng)序列產(chǎn)出和低成本方面有著巨大的潛力。不過(guò)與其他單分子測(cè)序平臺(tái)一樣，實(shí)時(shí)檢測(cè)單個(gè)分子對(duì)于提高原始數(shù)據(jù)準(zhǔn)確率是一個(gè)挑戰(zhàn)，并可能成為一個(gè)障礙，還需要更進(jìn)一步的改進(jìn)。

圖7 Pacific Biosiences公司單分子DNA測(cè)序技術(shù)(SMRT)原理示意圖[47].Fig.7 Schematic diagram of single molecule real time (SMRT) sequencing technology principle from Pacific Biosiences company[47].(彩圖見(jiàn)圖版二)

2014年，Stanford大學(xué)的Chen等[49]聯(lián)合Pacific Biosiences公司對(duì)單分子DNA測(cè)序設(shè)備進(jìn)行了改進(jìn)，主要是進(jìn)行單分子熒光的相關(guān)研究。Pacific Biosiences公司開(kāi)發(fā)的基于ZMWs器件的單分子DNA測(cè)序設(shè)備在測(cè)序過(guò)程中試劑及芯片準(zhǔn)備過(guò)程大約耗時(shí)1.5 h，同時(shí)芯片和激光的對(duì)準(zhǔn)過(guò)程大約需要15 min，其中在圖像獲取之前試劑要暴露在激光照射下大約2 min，這一過(guò)程并不適合單分子熒光研究，因?yàn)? min的激光照射將會(huì)漂白大部分固定在ZMWs底床的單分子熒光，針對(duì)這些問(wèn)題， Chen等將設(shè)備進(jìn)行了改進(jìn)，將單分子熒光的前期準(zhǔn)備過(guò)程由原來(lái)的1.5 h改進(jìn)為60 s，利用新的芯片與激光對(duì)準(zhǔn)方法大大減少了激光對(duì)于熒光基團(tuán)的漂白作用，同時(shí)對(duì)設(shè)備的軟件進(jìn)行了修改，使其更加適合單分子熒光實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的操作和分析。經(jīng)過(guò)以上改進(jìn)，將基于ZMWs的單分子DNA測(cè)序設(shè)備改為能夠廣泛使用的單分子熒光分析系統(tǒng)，具有便于使用、高時(shí)間靈敏度、高光譜分辨率、高信號(hào)靈敏度以及高的熒光染料分子光穩(wěn)定性的特性，能夠進(jìn)行單分子之間的瞬態(tài)結(jié)合及解離過(guò)程表征，能夠長(zhǎng)時(shí)間觀測(cè)微弱熒光能量轉(zhuǎn)移引起的分子構(gòu)象變化等，必將會(huì)有力促進(jìn)高通量研究生物單分子的相關(guān)研究工作進(jìn)展。

3.2 生物膜研究

ZMWs在生物研究體系中的一個(gè)重要應(yīng)用是研究生物膜，例如脂質(zhì)膜與細(xì)胞膜，這兩種膜在活細(xì)胞與其所在環(huán)境的相互作用過(guò)程中扮演著非常重要的角色[50]，其工作機(jī)理的研究和分析對(duì)于人們進(jìn)一步理解細(xì)胞的功能具有重要意義。傳統(tǒng)研究脂質(zhì)膜及細(xì)胞膜的光學(xué)方法是利用熒光相關(guān)光譜[51，52]、全內(nèi)反射熒光顯微鏡[53，54]和熒光光致漂白恢復(fù)[55]等技術(shù)，但是這些技術(shù)都受到光學(xué)衍射極限的限制不能在生理濃度環(huán)境中進(jìn)行單分子水平研究。ZMWs作為一種能夠在生物體系相等濃度的溶液體系中進(jìn)行單分子檢測(cè)的技術(shù)，在提出不久后就被人們用于生物膜的相關(guān)研究工作中。

2005年，Edel等[56]研究了帶有熒光標(biāo)記細(xì)胞膜的大鼠嗜堿性粒細(xì)胞性白血病細(xì)胞(Basophilleukemiacells of rats，RBL)在ZMWs器件表面的擴(kuò)散行為(圖8A)。由于RBL具有很好的黏附性，因此不需要任何外界作用即可黏附在ZMWs結(jié)構(gòu)的金屬層表面，通過(guò)熒光強(qiáng)度的變化發(fā)現(xiàn)，當(dāng)細(xì)胞剛剛進(jìn)入ZMWs微孔時(shí)，20 s內(nèi)只能捕獲到約兩次發(fā)光，1.5 h后20 s內(nèi)發(fā)光次數(shù)增加至22次，這一結(jié)果證明細(xì)胞不僅可以依照Z(yǔ)MWs微孔的形狀進(jìn)入到微孔而且進(jìn)入的深度足以使細(xì)胞膜上的熒光基團(tuán)受到激發(fā)。這一結(jié)果的發(fā)現(xiàn)為進(jìn)一步利用ZMWs研究細(xì)胞膜內(nèi)蛋白質(zhì)的動(dòng)力學(xué)過(guò)程及細(xì)胞內(nèi)的抗體受體結(jié)合過(guò)程等奠定了基礎(chǔ)。2006年，該小組又通過(guò)囊泡融合的方法在ZMWs納米結(jié)構(gòu)上制備了脂質(zhì)膜[29](圖8B)，在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)凝膠態(tài)的脂質(zhì)膜很難進(jìn)入ZMWs納米微孔，而在液相中的脂質(zhì)膜則能夠順利進(jìn)入ZMWs納米微孔的觀測(cè)體積中。隨后他們利用ZMWs在高濃度破傷風(fēng)毒素C碎片的溶液中測(cè)定了破傷風(fēng)毒素C碎片與神經(jīng)節(jié)苷脂GT1b的平衡結(jié)合常數(shù)。傳統(tǒng)的測(cè)定平衡常數(shù)的生化技術(shù)包括離心、平衡滲析及熒光檢測(cè)等步驟，一般需要幾小時(shí)至幾天時(shí)間完成。相比之下，利用ZMW技術(shù)需要的試劑量更少，同時(shí)實(shí)驗(yàn)步驟更加簡(jiǎn)單，幾分鐘之內(nèi)即可完成實(shí)驗(yàn)。這項(xiàng)對(duì)ZMWs結(jié)構(gòu)上形成的脂質(zhì)膜進(jìn)行的系統(tǒng)表征和理論分析的研究對(duì)于利用ZMWs研究生物膜的硬度及抗彎模數(shù)等特征具有重要指導(dǎo)意義，同時(shí)也為在生理濃度中研究單個(gè)膜蛋白分子提供了一種新的思路。

圖8 大鼠嗜堿性粒細(xì)胞性白血病細(xì)胞在ZMWs器件表面的擴(kuò)散行為[29,56]Fig.8 Dispersal behavior of RBL cell on ZMWs device surface[29,56].A.利用ZMWs器件檢測(cè)DiI-C18標(biāo)記大鼠嗜堿性粒細(xì)胞性白血病細(xì)胞(RBL)的結(jié)構(gòu)示意圖，RBL細(xì)胞約為15 μm；B. ZMWs器件表面覆蓋雙脂膜示意圖

幾乎同期，Wenger等[57]也在ZMWs上制備了脂質(zhì)膜，并發(fā)現(xiàn)熒光基團(tuán)的擴(kuò)散時(shí)間與ZMWs結(jié)構(gòu)上納米微孔的面積具有一定的線性關(guān)系，這一結(jié)果表明擴(kuò)散行為主要是在二維空間進(jìn)行的，并受到微孔尺寸的限制。通過(guò)改變ZMWs納米微孔的直徑大小發(fā)現(xiàn)直徑為150 nm的微孔的熒光發(fā)光效率是直徑范圍在250～400 nm的微孔的2倍，這一熒光增加現(xiàn)象與Rigneault等[27]報(bào)道的在150 nm的ZMWs微孔中熒光素羅丹明-6G分子的熒光強(qiáng)度得到了6.5倍的增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象是一致的，脂質(zhì)膜進(jìn)入納米孔可能是造成這一現(xiàn)象的原因。

細(xì)胞質(zhì)膜是一種復(fù)雜溶液的交界面，富含了眾多的脂類物質(zhì)、蛋白質(zhì)等，不僅是細(xì)胞的天然包膜，同時(shí)還是細(xì)胞與外界環(huán)境相互作用的聚集地[50]。因此研究活細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞質(zhì)膜中分子間的相互作用成為了生物學(xué)研究的重大課題。Jose等[58]利用電鏡和ZMWs熒光光譜研究了細(xì)胞質(zhì)膜在ZMWs結(jié)構(gòu)上的擴(kuò)散行為，細(xì)胞質(zhì)膜可能完全凹陷到ZMWs的納米孔中，也可能橫跨在納米孔上方，為了評(píng)估細(xì)胞質(zhì)膜進(jìn)入微孔的概率，他們對(duì)細(xì)胞進(jìn)行熒光標(biāo)記，然后將細(xì)胞黏附在ZMWs器件表面，最后獲取ZMWs芯片的熒光照片，同時(shí)以直徑為500 nm的熒光乳膠微球在ZMWs器件表面進(jìn)行參照實(shí)驗(yàn)，如圖9所示。細(xì)胞對(duì)于芯片的表面覆蓋度約為50%±10%，實(shí)驗(yàn)中發(fā)出熒光的納米孔個(gè)數(shù)比例為20%～25%，結(jié)果說(shuō)明不是所有覆蓋在芯片表面的細(xì)胞都能夠與納米孔底部接觸，細(xì)胞質(zhì)膜進(jìn)入納米孔的幾率大約50%左右。進(jìn)一步研究證明細(xì)胞質(zhì)膜能夠通過(guò)膜的擴(kuò)張作用進(jìn)入到ZMWs微孔中，通過(guò)分析認(rèn)為膜的進(jìn)孔過(guò)程主要是受到細(xì)胞支架成分的驅(qū)動(dòng)，類似于絲狀物質(zhì)的擴(kuò)展過(guò)程。這一結(jié)果為人們認(rèn)識(shí)細(xì)胞之間及細(xì)胞與表面之間的相互作用提供了一種新的思路。同時(shí)還從單分子分辨率水平分析了細(xì)胞膜內(nèi)組分的動(dòng)力學(xué)過(guò)程。

圖9 細(xì)胞質(zhì)膜進(jìn)入ZMWs器件微孔的概率[58]Fig.9 Probability of the cell membrane into the pores of the ZMWs device[58].A. 在實(shí)驗(yàn)中充當(dāng)未進(jìn)入微孔底部的熒光物質(zhì)參照；B. ZMWs器件頂部微球熒光圖片；C. 細(xì)胞膜進(jìn)入ZMWs器件底部示意圖;D. ZMWs器件底部由激發(fā)光消逝場(chǎng)激發(fā)的細(xì)胞膜熒光圖片，該熒光強(qiáng)度是微球在ZMWs器件底部的熒光強(qiáng)度值的100倍。

同期，Wenger等[59]也利用ZMWs研究了COS-7細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)膜中的熒光脂質(zhì)膜類似物Bodipy-PC、Bodipy-GM1、熒光蛋白GPI-GFP及轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(TfR)的擴(kuò)散行為。通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Bodipy-PC在微孔中的擴(kuò)散時(shí)間與微孔的面積成正比，沒(méi)有受到阻擋，而B(niǎo)odipy-GM1、GPI-GFP及TfR的擴(kuò)散受到了阻擋，對(duì)GPI-GFP及TfR的受阻原因進(jìn)行了分析說(shuō)明，認(rèn)為GPI-GFP的受阻主要是細(xì)胞質(zhì)膜中的膽固醇成分造成，他們將膽固醇轉(zhuǎn)化為膽甾烯酮，之后發(fā)現(xiàn)GPI-GFP的擴(kuò)散時(shí)間與微孔面積成線性關(guān)系，說(shuō)明GPI-GFP的擴(kuò)散行為與細(xì)胞質(zhì)膜中的膽固醇成分有很大關(guān)系，這一結(jié)論在其他論文中也得到了證實(shí)[60～62]。而對(duì)于TfR，主要是由于細(xì)胞質(zhì)膜的細(xì)胞骨架形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)阻礙了其擴(kuò)散過(guò)程。

通過(guò)以上的研究工作，人們已經(jīng)證實(shí)細(xì)胞膜能夠擴(kuò)散至ZMWs微孔中，同時(shí)利用ZMWs可以對(duì)細(xì)胞膜上的蛋白質(zhì)分子的擴(kuò)散行為進(jìn)行研究。在此基礎(chǔ)上，Richards等[62]提出了ZMWs在細(xì)胞膜內(nèi)新的應(yīng)用方向，即在細(xì)胞膜內(nèi)測(cè)定單個(gè)受體分子的化學(xué)計(jì)量比，同時(shí)還可以用來(lái)測(cè)定藥理學(xué)作用對(duì)受體分子化學(xué)計(jì)量比的影響。在實(shí)驗(yàn)中通過(guò)利用ZMWs納米微孔孤立了細(xì)胞膜上的單個(gè)受體分子(圖10)，然后利用一步熒光猝滅法識(shí)別受體分子的熒光分子數(shù)量，并對(duì)乙酰膽堿受體(nicotinic acetylcholine receptors，nAChRs)的化學(xué)計(jì)量比進(jìn)行了分析。nAChRs是其構(gòu)成單元α1～α10與β2～β4的五聚物組合體，Richards等主要對(duì)其中α4與β4的化學(xué)計(jì)量比進(jìn)行了分析，分別對(duì)綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)標(biāo)記的α4與未標(biāo)記的β4形成的組合體α4-(GFP)+β4，及未標(biāo)記的α4與熒光標(biāo)記的β4形成的組合體α4+ β4-(GFP)進(jìn)行熒光檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在α4-(GFP)+β4體系中約80%的受體分子熒光分子是分三步猝滅，代表的化學(xué)計(jì)量比是(α4)3(β4)2，約20%的熒光受體分子是分兩步猝滅，代表的化學(xué)計(jì)量比是(α4)2(β4)3。在α4+ β4-(GFP)體系中，小于30%的熒光是三步猝滅，70%的熒光是兩步猝滅，因此說(shuō)明大部分α4與β4的五聚體化學(xué)計(jì)量比是(α4)3(β4)2，而(α4)2(β4)3大約占20%～30%。在以上兩個(gè)系統(tǒng)中，得到的α4與β4的五聚體的化學(xué)計(jì)量比結(jié)果基本相同，說(shuō)明了利用ZMWs能夠有效測(cè)定部分生物分子的化學(xué)組成。利用ZMWs還分析測(cè)定了藥理作用對(duì)α4β2型nAChRs化學(xué)計(jì)量比的影響，首先對(duì)α4β2型nAChRs的化學(xué)計(jì)量比進(jìn)行了測(cè)定，發(fā)現(xiàn)(α4)2(β2)3和(α4)3(β2)2所占比例幾乎相等，然后將其分別置于濃度為500 nmol/L的尼古丁及金雀花堿溶液中持續(xù)24 h，之后再對(duì)其進(jìn)行化學(xué)計(jì)量比測(cè)定發(fā)現(xiàn)，置于尼古丁溶液中的nAChRs含有60%的(α4)2(β2)3，而置于金雀花堿溶液中的nAChRs只含有38%的(α4)2(β2)3，這一結(jié)果表明不同的溶液環(huán)境對(duì)于細(xì)胞膜中的nAChRs成分含量具有重大影響，同時(shí)也說(shuō)明ZMWs能夠用來(lái)測(cè)定藥理學(xué)作用對(duì)受體分子化學(xué)計(jì)量比的影響。

圖10 細(xì)胞膜上單個(gè)nAChR受體分子進(jìn)入ZMWs器件示意圖[62]Fig.10 Schematic diagram of the single nAChR molecules on cell membrane into the ZMWs device[62].注：整個(gè)細(xì)胞著床在ZMWs器件表面，細(xì)胞膜的一小部分進(jìn)入到ZMWs器件納米孔中。

3.3 生物大分子之間的相互作用

傳統(tǒng)研究生物大分子之間相互作用的方法主要是用到落射熒光顯微鏡、全內(nèi)反射熒光顯微鏡和熒光共振能量轉(zhuǎn)移[2，63，64]，近些年表面等離子體共振傳感器作為一種在單分子層水平分析生物分子之間相互作用的工具也得到了廣泛的應(yīng)用[65～67]。但是以上技術(shù)均無(wú)法有效地在高濃度溶液中觀測(cè)單個(gè)生物分子與其結(jié)合體的相互作用，測(cè)得的結(jié)果是生物分子相互作用的集群效應(yīng)。自從Levene等[7]證實(shí)可以利用ZMWs在高濃度的溶液中觀測(cè)單個(gè)分子的熒光后，對(duì)于ZMWs體系用于生物大分子之間相互作用的研究工作也開(kāi)始進(jìn)行嘗試。為了能夠利用ZMWs高信噪比觀測(cè)單分子蛋白質(zhì)之間的相互作用，Miyake等[36]提出了一種新型的ZMWs結(jié)構(gòu)，如圖4所示，并利用其實(shí)時(shí)觀測(cè)了分子伴侶素GroEL與其輔助分子GroES之間的相互作用。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，首先將分子伴侶素GroEL固定在ZMWs結(jié)構(gòu)微孔底床，通過(guò)分析認(rèn)為固定在微孔中的分子伴侶素GroEL 90%是單個(gè)分子，然后在濃度為5 μmol/L的Cy3標(biāo)記的輔助分子GroES的溶液中，且溶液中混有ATP，進(jìn)行了單分子熒光觀測(cè)，從熒光強(qiáng)度與時(shí)間的曲線圖看出GroES的結(jié)合—釋放過(guò)程能夠得到非常清楚的區(qū)分。通過(guò)分析認(rèn)為GroEL釋放GroES的過(guò)程存在一個(gè)動(dòng)力學(xué)過(guò)渡態(tài)，即整個(gè)釋放過(guò)程應(yīng)該是分兩步進(jìn)行的。為了驗(yàn)證利用ZMWs所獲得的熒光亮暗過(guò)程持續(xù)時(shí)間確實(shí)是代表了GroES的結(jié)合—釋放過(guò)程以及GroEL釋放GroES的過(guò)程是否存在兩個(gè)動(dòng)力學(xué)常數(shù)，在濃度為50 nmol/L的Cy3標(biāo)記的輔助分子GroES的溶液中進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，50 nmol/L的濃度相當(dāng)于單純利用全內(nèi)反射熒光顯微鏡能夠觀測(cè)到單分子GroES熒光信號(hào)的濃度，結(jié)果證明利用全內(nèi)反射熒光顯微鏡與ZMWs得到的結(jié)果得到了很好的吻合。隨后該小組還利用ZMWs詳細(xì)分析了GroEL的C-末端區(qū)對(duì)GroEL功能的作用，及GroEL-GroES結(jié)合體的衰變過(guò)程[37，68]。以上結(jié)果充分說(shuō)明，利用ZMWs可以直接在微摩爾每升量級(jí)濃度的溶液中觀測(cè)和分析單分子蛋白質(zhì)間的相互作用，同時(shí)為在單分子水平分析生物大分子的工作機(jī)制提供了很好的研究思路。

3.4 單分子反應(yīng)動(dòng)力學(xué)

從單分子水平研究酶分子反應(yīng)動(dòng)力學(xué)過(guò)程可以獲得單個(gè)酶分子的內(nèi)在行為信息，而不是眾多酶分子行為的平均效應(yīng)，因此對(duì)于人們進(jìn)一步認(rèn)識(shí)和理解酶分子的工作機(jī)理具有重要基礎(chǔ)意義。研究單分子酶動(dòng)力學(xué)過(guò)程中的關(guān)鍵是維持其檢測(cè)環(huán)境濃度與其生理濃度盡量接近，這樣才能有效保證酶分子的動(dòng)力學(xué)機(jī)制不受到破壞，得到的結(jié)果才有可能更接近生物體內(nèi)酶分子的實(shí)際工作機(jī)理。由于ZMWs能夠在高濃度溶液中有效檢測(cè)單分子，因此是研究單分子酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的有力工具。Zhao等[24]利用以金為金屬層的ZMWs對(duì)單分子單體肌氨酸氧化酶(monomeric sarcosine oxidase)的動(dòng)力學(xué)過(guò)程進(jìn)行了研究。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，首先通過(guò)自組裝的方式在納米孔的金表面修飾巰基聚乙二醇，單個(gè)酶分子選擇性地固定在ZMWs的二氧化硅底床上。肌氨酸氧化酶的活性位點(diǎn)含有黃素腺嘌呤二核苷酸輔因子，因此氧化態(tài)酶會(huì)自發(fā)熒光，而還原態(tài)酶則不發(fā)光，隨著黃素在氧化還原過(guò)程中的變化，單分子熒光隨之進(jìn)行明暗交替，每一個(gè)明暗過(guò)程的循環(huán)對(duì)應(yīng)一次酶翻轉(zhuǎn)過(guò)程。基于此原理，分別采用底物肌氨酸和左旋脯氨酸進(jìn)行了酶動(dòng)力學(xué)反應(yīng)過(guò)程，結(jié)果顯示左旋脯氨酸濃度為500 μmol/L時(shí)，熒光平均持續(xù)時(shí)間為0.23 s，與50 μmol/L的肌氨酸相當(dāng)，說(shuō)明酶與兩種底物形成的復(fù)合體結(jié)構(gòu)是不同的，因而造成相同濃度底物時(shí)熒光持續(xù)的時(shí)間不同。對(duì)酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)過(guò)程的的分析顯示， 23個(gè)單體肌氨酸氧化酶的催化反應(yīng)速率常數(shù)之間的差距最大能夠達(dá)到20多倍，協(xié)方差參數(shù)為隨機(jī)分布，因此可以認(rèn)為該酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)過(guò)程具有靜態(tài)異質(zhì)性，存在動(dòng)態(tài)無(wú)序性，原因可能是單個(gè)酶分子在ZMWs微孔中的空間取向分布不同，也可能是酶分子在微孔底床上的固定位置不同造成的。

還有人利用ZMWs對(duì)生物聚合反應(yīng)動(dòng)力學(xué)過(guò)程進(jìn)行了研究，如Samiee等[23]利用熒光相關(guān)光譜在ZMWs中研究了噬菌體λ抑制蛋白質(zhì)CI的動(dòng)力學(xué)過(guò)程。對(duì)于CI的齊聚反應(yīng)動(dòng)力學(xué)過(guò)程在Samiee等之前就有人進(jìn)行了充分的研究[69]，并證明當(dāng)CI濃度為100 nmol/L時(shí)主要是以二聚體的形式存在，當(dāng)濃度高于1 μmol/L時(shí)，四聚體急劇增多，當(dāng)濃度再高時(shí)四聚體迅速變?yōu)榘司垠w。從CI的聚合過(guò)程可以看出，當(dāng)CI四聚體及八聚體出現(xiàn)時(shí)，反應(yīng)液的濃度已經(jīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于單純的熒光相關(guān)光譜能夠檢測(cè)的濃度范圍(一般為納摩爾每升濃度量級(jí))，因此Samiee等利用ZMWs在濃度約為1 μmol/L的溶液中對(duì)CI的齊聚反應(yīng)中決定四聚體形成過(guò)程的結(jié)合常數(shù)KD2進(jìn)行了計(jì)算和分析，并認(rèn)為該常數(shù)與溫度具有一定的關(guān)系，同時(shí)表明CI八聚體形成過(guò)程的速率限定步驟是四聚體的形成。以上結(jié)論與Pray等[67]之前利用傳統(tǒng)工具獲得的結(jié)論是一致的，因此說(shuō)明ZMWs是研究高濃度環(huán)境中生物聚合反應(yīng)過(guò)程的有力手段。

RNA是自然界最忙碌的分子之一，其功能一度被認(rèn)為只是貯存與傳送遺傳信息而已，不過(guò)現(xiàn)在已知它能完成其他多樣化的功能，從調(diào)控基因表達(dá)與其他維系生命所需的細(xì)胞程序到作為一種感應(yīng)器。這個(gè)多才多藝的分子其中一項(xiàng)重要的功能就是蛋白質(zhì)翻譯過(guò)程，自20世紀(jì)以來(lái)，蛋白質(zhì)翻譯過(guò)程就已經(jīng)出現(xiàn)了許多重要的成果，一些已經(jīng)進(jìn)行到了單分子水平[70]。但是由于受限于光學(xué)衍射極限，以往利用單分子熒光研究RNA反應(yīng)動(dòng)力學(xué)過(guò)程都是在熒光標(biāo)記配體濃度為納摩爾每升量級(jí)的環(huán)境中，無(wú)法達(dá)到生理濃度范圍水平。2010年Uemura等[71]成功利用ZMWs在生理濃度水平實(shí)時(shí)觀測(cè)了單個(gè)核糖體將氨基酸串聯(lián)起來(lái)的動(dòng)力學(xué)過(guò)程。這種方法不僅可以解析tRNA在翻譯過(guò)程中的具體結(jié)構(gòu)變化，而且還可以用來(lái)研究藥物對(duì)蛋白翻譯過(guò)程的影響。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中首先將核糖體復(fù)合物固定在ZMWs微孔底床，核糖體復(fù)合物作為70S起始復(fù)合物包含有熒光標(biāo)記的fMet-(Cy3)tRNAfMet，并且還添加了另外兩個(gè)利用不同染料標(biāo)記的tRNA-Phe-(Cy5)tRNAPhe及Lys-(Cy2)tRNALys，這些tRNA與被檢測(cè)的mRNA編碼的氨基酸苯丙氨酸和賴氨酸同源。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，首先通過(guò)檢測(cè)fMet-(Cy3)tRNAfMet確定起始復(fù)合物，隨后通過(guò)特定顏色的熒光信號(hào)實(shí)時(shí)觀測(cè)Phe-(Cy5)tRNAPhe及Lys-(Cy2)tRNALys與核糖體的結(jié)合過(guò)程，這個(gè)過(guò)程受mRNA編碼的4種氨基酸(MFFF或MFKF)調(diào)控。利用這種方法可以在密碼子分辨率水平分析核糖體的翻譯動(dòng)力學(xué)過(guò)程，也可以分析mRNA的基本序列，從而解析依賴于序列的翻譯行為。另外這個(gè)系統(tǒng)也可以被用來(lái)分析系列過(guò)程，從起始到框架轉(zhuǎn)換，以及包括真核生物的核糖體在內(nèi)的不同物種的核糖體。

大部分的ZMWs結(jié)構(gòu)均為圓形納米孔陣列，直徑在100 nm左右，但是這種結(jié)構(gòu)也限制了一些實(shí)驗(yàn)的開(kāi)展，例如分子馬達(dá)的反應(yīng)過(guò)程觀測(cè)。直徑在100 nm左右的圓形納米孔僅僅能夠容納蛋白纖維絲，但是由于空間的限制無(wú)法進(jìn)一步觀測(cè)其運(yùn)動(dòng)狀態(tài)。因此Elting等[72]開(kāi)發(fā)了一種新型線性ZMWs，對(duì)肌球蛋白在蛋白纖維絲上的運(yùn)動(dòng)進(jìn)行了單分子熒光檢測(cè)。線性ZMWs結(jié)構(gòu)就像一個(gè)窄長(zhǎng)形的溝道，長(zhǎng)度大約幾個(gè)微米，以偏振光為激發(fā)光源，仍能將激發(fā)光限制在ZMWs結(jié)構(gòu)底部，如圖11所示。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中首先將肌球蛋白纖維固定在線性ZMWs底床，然后加入熒光標(biāo)記的肌動(dòng)蛋白V和ATP，從熒光圖片上可以看出肌球蛋白的移動(dòng)距離大于1 μm，肌球蛋白的長(zhǎng)度為36 nm，1 μm的距離相當(dāng)于肌球蛋白沿著蛋白纖維移動(dòng)了至少30步。這種新型線性ZMWs結(jié)構(gòu)突破了傳統(tǒng)ZMWs體積對(duì)生物分子的限制，同時(shí)給分子馬達(dá)的研究提供了一種新的思路和方法。

圖11 線性ZMWs結(jié)構(gòu)示意圖，肌球蛋白沿著蛋白纖維在ZMWs線性納米通道移動(dòng)[72]。Fig.11 Diagram of linear ZMWs structure，myosin move along protein fibers in linear ZMWs nanochannel[72].注：由于納米通道的寬度小于激光光波長(zhǎng)，偏振激發(fā)光體積在垂直和通道的長(zhǎng)度方向均受到限制。

4 展望

ZMWs作為一種單分子檢測(cè)工具，通過(guò)納米孔結(jié)構(gòu)將觀測(cè)體積減小至仄升量級(jí)，突破了光學(xué)衍射極限的限制，能夠在生理濃度水平溶液中有效觀測(cè)單分子熒光，可以檢測(cè)的溶液濃度范圍比傳統(tǒng)光學(xué)設(shè)備提高了3～6個(gè)數(shù)量級(jí)。該方法自2003年被提出之后，在短短的9年之內(nèi)，從制備工藝到具體應(yīng)用都受到了人們的極大關(guān)注，并在分子生物學(xué)領(lǐng)域得到了科研工作者的青睞和廣泛使用。目前基于ZMWs原理研發(fā)的單分子測(cè)序系統(tǒng)已經(jīng)進(jìn)入市場(chǎng)，ZMWs在生物膜、生物大分子間相互作用及酶動(dòng)力學(xué)等方面的研究成果表明ZMWs可以應(yīng)用于更多的生物體系研究中。有理由相信ZMWs在日益活躍的單分子研究領(lǐng)域必將發(fā)揮更大的作用，成為人們?cè)趩畏肿铀竭M(jìn)一步研究和認(rèn)識(shí)生物分子工作機(jī)制的有力研究工具。

[1] Xie X S,Trautman J K. Single-molecule optical studies at room temperature[J]. Annu. Rev. Phys. Chem.,1998,49：441-480.

[2] Tinnefeld P,Sauer M. Branching out of single-molecule fluorescence spectroscopy：Challenges for chemistry and influence on biology[J].Angew. Chem. Int. Ed. Engl.,2005,44：2642-2671.

[3] Verena R,Markus A,Stefan W. What can we learn from single molecule trajectories[J]? Curr.Protein Pept.Sci.,2011,12(8)：714-724.

[4] Meyer-Almes F J,Auer M. Enzyme inhibition assays using fluorescence correlation spectroscopy： A new algorithm for the derivation of kcat/KM and Ki values at substrate concentrations much lower than the michaelis constant[J].Biochemistry, 2000,39(43)： 13261-13268.

[5] Schomburg D,Schomburg I. Springer Handbook of Enzymes[M]. (2nd edn). New York： Springer,2001.

[6] Lerch H P,Mikhailov A S,Hess B. Conformational-relaxation models of single enzyme kinetics[J]. Proc. Natl. Acad. Sci. USA,2002, 99：15410-15415.

[7] Levene M J,Korlach J,Turner S W,etal.. Zero-mode waveguides for single-molecule analysis at high concentrations[J]. Science,2003,299：682-686.

[8] Starr T E,Thompson N L. Total internal reflection with fluorescence correlation spectroscopy：Combined surface reaction and solution diffusion[J]. Biophys. J.,2001,80：1575-1584.

[9] Mashanov G I,Tacon D, Knight A E,etal.. Visualizing single molecules inside living cells using total internal reflection fluorescence microscopy[J]. Methods,2003,29：142-152.

[10] Chan H M,Chan L S,Wong R N S. Direct quantification of single-molecules of microRNA by total internal reflection fluorescence microscopy[J]. Anal. Chem., 2010,82(16)：6911-6918.

[11] Satomi M,Yukihiro M,Toshio Y. Single-molecule imaging of stochastic signaling events in living cells[J]. Cold Spring Harb. Protoc.,2012,(3)：267-278.

[12] Betzig E,Chichester R J. Single molecules observed by near-field scanning optical microscopy[J]. Science,1993,262：1422-1425.

[13] Trautman J K,Macklin J J,Brus L E,etal.. Near-field spectroscopy of single molecules at room temperature[J]. Nature,1994,369：40-42.

[14] Hoang H T,Segers-Nolten I M,Berenschot J W,etal.. Fabrication and interfacing of nanochannel devices for single-molecule studies[J]. J. Micromech. Microeng.,2009,19：065017.

[15] Mannion J T,Reccius C H,Cross J D,etal.. Conformational analysis of single DNA molecules undergoing entropically induced motion in nanochannels[J]. Biophys. J., 2006, 90：4538-4545.

[16] Stavis S M,Edel J B,Li Y G,etal.. Detection and identification of nucleic acid engineered fluorescent labels in submicrometre fluidic channels[J]. Nanotechnology,2005,16： S314-S323.

[17] Stavis S M,Edel J B,Samiee K T,etal.. Single molecule studies of quantum dot conjugates in a submicrometer fluidic channel[J]. Lab Chip,2005,5(3)：337-343.

[18] Persson F,Thamdrup L H,Mikkelsen M B L,etal.. Double thermal oxidation scheme for the fabrication of SiO2nanochannels[J]. Nanotechnology,2007,18：245301.

[19] Haneveld J,Tas N R,Brunets N,etal.. Capillary filling of sub-10 nm nanochannels[J]. J. Appl. Phys.,2008,104：014309.

[20] Bethe H A. Theory of diffraction by small holes[J]. Phys. Rev., 1944, 66：163-182.

[21] Jackson J D. Classical Electrodynamics[M]. (3rd edn). New York：John Wiley &Sons,Inc.,1999.

[22] Moran-Mirabal J M,Craighead H G. Zero-mode waveguides：Sub-wavelength nanostructures for single molecule studies at high concentrations[J]. Methods,2008,46：11-17.

[23] Samiee K T,Foquet M,Guo L,etal.. λ-Repressor oligomerization kinetics at high concentrations using fluorescence correlation spectroscopy in zero-mode waveguides[J]. Biophys. J.,2005,88：2145-2153.

[24] Zhao J,Branagan S P,Bohn P W. Single-molecule enzyme dynamics of monomeric sarcosine oxidase in a gold-based zero-mode waveguide[J]. Appl. Spectrosc.,2012,66(2)：163-169.

[25] Castner D G,Ratner B D. Biomedical surface science：Foundations to frontiers[J]. Surf. Sci.,2002,500：28-60.

[26] Peterlinz K A,Georgiadis R.Insitukinetics of self-assembly by surface plasmon resonance spectroscopy[J]. Langmuir,1996,12：4731-4740.

[27] Rigneault H,Capoulade J,Dintinger J,etal.. Enhancement of single-molecule fluorescence detection in subwavelength apertures[J]. Phys. Rev. Lett.,2005, 95：117401-117404.

[28] Fore S,Yuen Y,Hesselink L,etal.. Pulsed-interleaved excitation FRET measurements on single duplex DNA molecules inside C-shaped nanoapertures[J]. Nano Lett.,2007,7(6)：1749-1756.

[29] Samiee K T,Moran-Mirabal J M,Cheung Y K,etal.. Zero mode waveguides for single-molecule spectroscopy on lipid membranes[J]. Biophys. J.,2006,90：3288-3299.

[30] Perentes A,Utke I,Dwir B,etal.. Fabrication of arrays of sub-wavelength nano-apertures in an optically thick gold layer on glass slides for optical studies[J]. Nanotechnology, 2005,16：S273-S277.

[31] Leutenegger M,Gosch M,Perentes A,etal.. Confining the sampling volume for fluorescence correlation spectroscopy using a sub-wavelength sized aperture[J]. Opt. Express,2006,14：956-969.

[32] Foquet M,Samiee K T,Kong X,etal.. Improved fabrication of zero-mode waveguides for single-molecule detection[J]. J. Appl. Phys.,2008,103：034301.

[33] Hsieh C F,Lai S C,Chen C T. Improved fabrication of zero-mode waveguides for monitoring specific molecular dynamics in living cells[A]. In：Cartwright A N,Nicolau D V. Nanoscale Imaging,Sensing,and Actuation for Biomedical Applications VIII[C]. San Francisco,USA,Proc. SPIE 8231,2012.

[34] Wada J,Ryu S,Asano Y,etal.. Fabrication of zero-mode waveguide by ultraviolet nanoimprint lithography lift-off process[J]. Jpn. J. Appl. Phys., 2011,50：06GK07.

[35] Teng C H,Lionberger T A,Zhang J,etal.. Fabrication of nanoscale zero-mode waveguides using microlithography for single molecule sensing[J]. Nanotechnology,2012,23：455301.

[36] Miyake T,Tanii T,Sonobe H,etal.. Real-time imaging of single-molecule fluorescence with a zero-mode waveguide for the analysis of protein-protein interaction[J]. Anal. Chem.,2008,80：6018-6022.

[37] Suzuki M,Ueno T,Iizuka R,etal.. Effect of the c-terminal truncation on the functional cycle of chaperonin groel[J]. J. Biol. Chem.,2008, 283 (35)： 23931-23939.

[38] Tanii T,Akahori R,Higano S,etal.. Improving zero-mode waveguide structure for enhancing signal-to-noise ratio of real-time single-molecule fluorescence imaging：A computational study[J]. Phys. Rev.,2013,E88：012727.

[39] Ambrose W P,Goodwin P M,Keller R A. Alterations of single molecule fluorescence lifetimes in near-field optical microscopy[J]. Science,1994,265：364-367.

[40] Ono T,Iizuka R,Akagi T,etal.. Nanofabrication of polymeric aperture array for localized illumination beyond diffraction limit[A]. In:Landers J.Proceedings of 15th International Conference on Miniaturized Systems for Chemistry and Life Sciences[C]. Seattle: Chemical and Biological Microsystems Society,2011, 1801-1803.

[41] Zhou X G,Ren L F,Meng Q S,etal.. The next-generation sequencing technology and application[J]. Protein Cell,2010,1(6)：520-536.

[42] Zhou X G,Ren L F,Li Y T,etal.. The next-generation sequencing technology：A technology review and future perspective[J]. Sci. China Life Sci.,2010, 53：44-47.

[43] 任魯風(fēng),于 軍. 解讀生命密碼的基本手段——DNA測(cè)序技術(shù)的前世今生[J]. 生命科學(xué). 2012,24(12)：1-6.

[44] Yuan L N,Ren L F,Li Y T,etal.. A complete genome assembly ofGlaciecolamesophilasp. nov. sequenced by BIGIS-4 sequencer system[J]. Sci. China Life Sci., 2011,54(9)：835-840.

[45] 李運(yùn)濤,任魯風(fēng),周曉光,等. 應(yīng)用于單分子測(cè)序的納米微結(jié)構(gòu)器件[J]. 物理, 2012,41(7)：467-471.

[46] Korlach J,Marks P J,Cicero R L,etal.. Selective aluminum passivation for targeted immobilization of single DNA polymerase molecules in zero-mode waveguide nanostructures[J]. Proc. Natl. Acad. Sci. USA,2008,105：1176-1181.

[47] Eid J,Fehr A,Gray J,etal.. Real-Time DNA sequencing from single polymerase molecules[J]. Science,2009,323：133-138.

[48] Flusberg B A,Webster D R,Lee J H,etal.. Direct detection of DNA methylation during single-molecule, real-time sequencing[J]. Nat. Methods,2010,7(6)：461-467.

[49] Chen J,Dalal R V,Petrov A N,etal.. High-throughput platform for real-time monitoring of biological processes by multicolor single-molecule fluorescence[J]. Proc. Natl. Acad. Sci. USA,2014,111(2)：664-669.

[50] McMahon H T,Gallop J L. Membrane curvature and mechanisms of dynamic cell membrane remodeling[J]. Nature,2005,438：590-596.

[51] Larson D R,Gosse J A,Holowka D A,etal.. Temporally resolved interactions between antigen-stimulated IgE receptors and Lyn kinase on living cells[J]. J. Cell Biol., 2005,171：527-536.

[52] Kahya N. Targeting membrane proteins to liquid-ordered phases：Molecular self-organization explored by fluorescence correlation spectroscopy[J]. Chem. Phys. Lipids,2006,141：158-168.

[53] Moran-Mirabal J M,Edel J B,Meyer G D,etal.. Micrometer-sized supported lipid bilayer arrays for bacterial toxin binding studies through total internal reflection fluorescence microscopy[J]. Biophys. J.,2005,89：296-305.

[54] Pero J K,Haas E M,Thompson N L. Size dependence of protein diffusion very close to membrane surfaces：Measurement by total internal reflection with fluorescence correlation spectroscopy[J]. J. Phys. Chem. B,2006,110： 10910-10918.

[55] Tocanne J F,Dupoucezanne L,Lopez A. Lateral diffusion of lipids in model and natural membranes[J]. Prog. Lipid Res.,1994,33：203-237.

[56] Edel J B,Wu M,Baird B,etal.. High spatial resolution observation of single-molecule dynamics in living cell membranes[J]. Biophys. J.,2005,88：L43-L45.

[57] Wenger J,Rigneault H,Dintinger J,etal.. Single-fluorophore diffusion in a lipid membrane over a subwavelength aperture[J]. J. Biol. Phys.,2006,32：SN1-SN4.

[58] Moran-Mirabal J M,Torres A J,Samiee K T,etal.. Cell investigation of nanostructures：Zero-mode waveguides for plasma membrane studies with single molecule resolution[J]. Nanotechnology,2007,18：195101.

[59] Wenger J,Conchonaud F,Dintinger J,etal.. Diffusion analysis within single nanometric apertures reveals the ultrafine cell membrane organization[J]. Biophys. J.,2007,92：913-919.

[60] Lenne P F,Wawrezinieck L F,Conchonaud O W,etal.. Dynamic molecular confinement in the plasma membrane by microdomains and the cytoskeleton meshwork[J]. EMBO J.,2006,25：3245-3256.

[61] Brown D A,London E. Functions of lipid rafts in biological membranes[J]. Annu. Rev. Cell Dev. Biol.,1998,14：111-136.

[62] Richards C I,Luong K,Srinivasan R,etal.. Live-cell imaging of single receptor composition using zero-mode waveguide nanostructures[J]. Nano Lett.,2012,12(7)： 3690-3694.

[63] Mehta A D,Rief M,Spudich J A,etal.. Single-molecule biomechanics with optical methods[J]. Science,1999,283：1689-1695.

[64] Masi A,Riccardo C,Adolfo C. Optical methods in the study of protein-protein interactions[A]. In: Becchetti A, Arcangeli A. Integrins and ion channels：Molecular complexes and signaling[M]. NewYork: Springer, 2010,674：33-42.

[65] Jung S O,Ro H S,Kho B H,etal.. Surface plasmon resonance imaging-based protein arrays for high-throughput screening of protein-protein interaction inhibitors[J]. Proteomics,2005, 5(17)：4427-4431.

[66] Karlsson R. SPR for molecular interaction analysis：A review of emerging application areas[J]. J. Mol. Recognit.,2004,17：151-161.

[67] Jeon S D,Lee J E,Kim S J,etal.. Analysis of selective,high protein-protein binding interaction of cohesin-dockerin complex using biosensing methods[J]. Biosens. Bioelectron.,2012,35：382-389.

[68] Sameshima T,Iizuka R,Ueno T,etal.. Single-molecule study on the decay process of the football-shaped groel-groes complex using zero-mode waveguides[J]. J. Biol. Chem.,2010,285(30)：23159-23164.

[69] Pray T R,Burz D S,Ackers G K. Cooperative non-specific DNA binding by octamerizing lambda cI repressors：A site-specific thermodynamic analysis[J]. J. Mol. Biol.,1998,282：947-958.

[70] Marshall R A,Aitken C E,Dorywalska M,etal.. Translation at the single-molecule level[J]. Annu. Rev. Biochem.,2008,77：177-203.

[71] Uemura S,Aitken C E,Korlach J,etal.. Real-time tRNA transit on single translating ribosomes at codon resolution[J]. Nature,2010,464(7291)：1012-1018.

[72] Elting M W,Leslie S R,ChurchmanL S,etal.. Single-molecule fluorescence imaging of processive myosin with enhanced background suppression using linear zero-mode waveguides (ZMWs) and convex lens induced confinement (CLIC)[J]. Opt. Express,2014,21(1)：1189-1202.

Zero-Mode Waveguides: the Principle, Fabrication and Application in Detection of Single Fluorescent Molecules

WEI Qing-quan1,3, LI Yun-tao1,3, REN Lu-feng2,3, ZHOU Xiao-guang1,3, YU Yu-de1,3

1.StatekeylaboratoryofIntegratedOptoelectronics,InstituteofSemiconductors,ChineseAcademyofSciences,Beijing100083,China;2.TheDNASequencingTechnologiesR&Dcenter,BeijingInstituteofGenomics,ChineseAcademyofSciences,Beijing100029,China;3.TheJointLaboratoryofBioinformationAcquisitionandSensingTechnology,InstituteofSemiconductors,BeijingInstituteofGenomics,ChineseAcademyofSciences,Beijing100083,China

Techniques for single fluorescent molecules detection have garnered a great amount of interests from science community in recent years largely due to their ability to reveal the individual molecular properties and behaviors which were often obscured by techniques based on ensemble average. In order to overcome diffraction-limit of optical observation, fluorescent molecules must be diluted to a very low concentration-way below normal physiological concentration. However, this may adversely impact the kinetics for the chemical or biochemical reaction under study. Zero-mode waveguides(ZMWs), as a new kind of single fluorescent molecule detection device, effectively reduce the observation volume to the level of zeptoliter (10-21L), which is much lower than optical diffraction-limited volume, by utilizing of a nanoaperture structure. The zeptoliter-observation volume provides an environment where a single fluorescent molecule can be observed at normal physiological concentration. The ZMWs have been extensively used in the field of single fluorescent molecule detection due to its outstanding performance than diffraction-limited optics.Therefore we provided an overview of ZMWs, including discussions on its principle, fabrication techniques, and applications in DNA sequencing, biomembrane structure elucidation, biomacromolecule interaction studies and kinetics study of single-molecule reaction.

zero-mode waveguides；single molecule；nano microstructure devices

2014-11-25; 接受日期：2014-12-04

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31200643，61275064)資助。

魏清泉，副研究員，博士，主要從事基因測(cè)序、單分子熒光檢測(cè)及生物傳感器研究。Tel:010-82304482;E-mail：qingquanwei@semi.ac.cn

10.3969/j.issn.2095-2341.2015.01.02