顧地周,楊麗娟,王曼寧,劉宇,趙明明,沈紅梅,朱俊義,周繇

通化師范學院生命科學學院,吉林通化134002

牛皮杜鵑嫩莖段試管內(nèi)高效再生方法

顧地周,楊麗娟,王曼寧,劉宇,趙明明,沈紅梅,朱俊義,周繇

通化師范學院生命科學學院,吉林通化134002

本研究以牛皮杜鵑嫩莖段為外植體，通過均勻設計法對影響牛皮杜鵑腋芽萌發(fā)生長同時生根的各主要因素及其水平的作用進行了實驗探討，旨在探索一種試管內(nèi)牛皮杜鵑高效植株的再生方法。結(jié)果表明，最適合牛皮杜鵑嫩莖段生根同時腋芽萌發(fā)生長的培養(yǎng)基為：基本培養(yǎng)基+KT 0.13～0.14 mg·L-1+IBA 0.05～0.08 mg·L-1+NAA 0.02～0.05 mg·L-1+GA32.70～2.90 mg·L-1，植株再生率為99.2%。以再生植株莖節(jié)為材料進行快繁的結(jié)果表明，在28 d的培養(yǎng)周期內(nèi)，每段平均增殖6倍以上。再生植株的移栽成活率達96.0%以上。成功建立了高效植株再生體系，所建立的高效植株再生體系適合于牛皮杜鵑種苗工廠化生產(chǎn)。

牛皮杜鵑;嫩莖;均勻設計法;植株再生

牛皮杜鵑(Rhododendron chrysanthum Pall.)為杜鵑花科杜鵑花屬常綠灌木，為吉林省重點保護植物，為我國國家三級保護的珍貴稀有植物，全株揮發(fā)油含量較高，油中還有黃酮類強心苷，為精油和藥用植物。其具有抗性極強的特性，是杜鵑花育種的種質(zhì)資源。牛皮杜鵑對水土保持和維持生態(tài)平衡起重要作用，適合應用于我國東北及西北地區(qū)的園林綠化植物。但其在我國分布甚狹，僅在長白山有較大種群分布，其它地區(qū)僅為零星分布，由于人們亂采亂挖，野生資源遭到極大威脅。牛皮杜鵑花種子細小，萌發(fā)率低，萌發(fā)后形成的小苗成活率極低[1,2]；扦插繁殖需要大量的野生杜鵑枝條，對野生資源破壞極大，且生根率和移栽成活率極低，開發(fā)和利用受到極大限制。目前，牛皮杜鵑的離體繁殖報道較多[3-6]，通過愈傷組織再分化芽苗、腋芽叢生和直接再生等途徑具有增殖系數(shù)高等優(yōu)點，但仍存在外植體誘導愈傷組織再分化、腋芽叢生和直接再生周期較長，獲得不定芽再進一步生根速度較慢、步驟復雜、成本高、可操作性差，長期連續(xù)增殖極易發(fā)生退化和變異等缺點。本研究的目的是針對上述不足而探索一種方法可行、步驟簡捷、成本低和繁殖速度快的利用牛皮杜鵑嫩莖段試管內(nèi)高效植株再生方法。

1 材料與方法

1.1 材料及處理

10月下旬，于長白山國家級自然保護區(qū)采牛皮杜鵑枝條，并將枝條用塑料袋包好后放入冰柜內(nèi)低溫休眠，溫度控制在-10～-5℃，60 d后取出并將頂芽去除，在300倍液的赤霉素溶液中水培促其側(cè)芽萌發(fā)生長，待側(cè)芽萌發(fā)長至2.50 cm左右時，將鮮嫩的側(cè)芽剪下，用75%乙醇（體積分數(shù)）涮洗60 s，移至飽和次氯酸鈉溶液中浸泡8 min，無菌水沖洗10次，無菌濾紙吸干表面水分，去除被乙醇和次氯酸鈉毒傷的組織后將莖段切割成小莖段，每個小莖段含1個葉片作為外植體備用。

1.2 牛皮杜鵑莖段生根同時腋芽萌發(fā)生長、高頻植株再生和煉苗移栽

基本培養(yǎng)基成分及含量[7]：87 mg·L-1(NH4)2SO4，375 mg·L-1NH4NO3，180 mg·L-1KNO3，320 mg·L-1CaCl2·2H2O，245 mg·L-1MgSO4·7H2O，436 mg·L-1KH2PO4；18.4 mg·L-1FeSO4·7H2O，24.9 mg·L-1Na2·EDTA·2H2O；12.4 mg·L-1MnSO4·4H2O，7.2 mg·L-1ZnSO4·7H2O，5.7 mg·L-1H3BO3，0.32 mg·L-1KI，0.05 mg·L-1Na2MoO4·2H2O；0.3 mg·L-1鹽酸硫胺素(VB1)，0.25 mg·L-1煙酸，75 mg·L-1肌醇，0.25 mg·L-1甘氨酸。培養(yǎng)基中附加的植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)初步范圍為：激動素KT(0.03～0.10 mg·L-1)、吲哚丁酸IBA(0.10～0.45 mg·L-1)、萘乙酸NAA(0.06～0.13 mg·L-1)和赤霉素GA3(1.40～2.60 mg·L-1)，瓊脂粉7.8 g·L-1，添加蔗糖10.0 g·L-1，調(diào)節(jié)pH值至5.6，牛皮杜鵑嫩莖段在光照周期9 h·d-1、光照強度1000 lx和溫度(23±2)℃條件下培養(yǎng)。

首先將外植體莖段接種到培養(yǎng)基：基本培養(yǎng)基+GA32.50 mg·L-1中進行腋芽萌發(fā)培養(yǎng)，待外植體莖段在試管內(nèi)腋芽萌發(fā)長至2.00 cm左右時（圖1a），將腋芽剪下切割成1葉1段進行莖段生根和腋芽萌發(fā)生長的影響因素篩選。為提高牛皮杜鵑嫩莖段的生根率和腋芽萌發(fā)生長長度，通過均勻設計法設計實驗[8-10]，選用U13(134)和U11(113)均勻表，每個處理接種10個嫩莖段，重復3次，篩選牛皮杜鵑莖段生根和腋芽萌發(fā)生長的激動素、吲哚丁酸、萘乙酸和赤霉素最佳濃度配比。莖段培養(yǎng)28 d統(tǒng)計生根率和腋芽萌發(fā)后生長長度。生根率=（生根的莖段數(shù)/接種的莖段總數(shù)）×100%，莖段腋芽長度為1個培養(yǎng)周期過程中，莖段腋芽萌發(fā)生長后的長度（不包括原莖段長度）。

以再生植株莖節(jié)為材料，采取節(jié)增殖方式開展快繁[11-13]，小植株生長至3.50 cm左右時，在無菌狀態(tài)下打開培養(yǎng)瓶，將小植株留1葉剪下苗干，并切割成1葉1段的小莖段后，再次將小莖段轉(zhuǎn)接到生根同時腋芽萌發(fā)生長培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，計算出每個莖段生根和生長及每瓶的增殖倍數(shù)和周期。

當牛皮杜鵑種苗擴繁到一定數(shù)量后，且小植株長至適宜高度時，將小植株從培養(yǎng)瓶中取出，放在高錳酸鉀溶液中（濃度為10 mg/L）洗凈根上的瓊脂，將小植株栽植到經(jīng)多菌靈溶液消毒過的草炭土、腐爛松針和河砂的混合基質(zhì)中，覆蓋塑料薄膜（透光性好）進行保濕保溫，控制溫度為(18±2)℃，保持相對濕度在70%～75%之間，12 h/d的自然光照，濕度過高或中午溫度升高時，將薄膜打開小口進行換氣通風，濕度降低時，可在早上噴灑適量清水。

煉苗一段時間后可揭去塑料薄膜，定期于早上噴灑一次清水，并適時噴施適宜濃度的KH2PO4溶液，苗高達到一定高度時，連同根部土塊定植盆中，加強肥水管理。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

通過均勻設計法進行試驗設計，數(shù)據(jù)經(jīng)分析處理后摸索出各主要因素對嫩莖段生根和腋芽萌發(fā)生長的影響，再進一步驗證或補充實驗篩選影響牛皮杜鵑嫩莖段生根和腋芽萌發(fā)生長的主要因素的適宜濃度，確定嫩莖段生根和腋芽萌發(fā)生長的培養(yǎng)基，在此基礎上獲得牛皮杜鵑嫩莖段生根同時腋芽萌發(fā)生長的最佳培養(yǎng)基。均勻設計軟件采用Uniform Design 3.0V。

2 結(jié)果與分析

2.1 影響牛皮杜鵑嫩莖段生根和腋芽萌發(fā)生長的KT、IBA、NAA和GA3及其濃度初步篩選

數(shù)據(jù)(表1)經(jīng)均勻設計軟件分析處理后可得回歸方程為Y1=81.8+221X1－17.5X2－111X3，顯著性水平α＝0.05，復相關系數(shù)R＝0.9536，剩余標準差S＝2.0600，檢驗值Ft＝30.12＞臨界值F(0.05,3,9)＝3.863，回歸方程具有顯著性。通過計算激動素、吲哚丁酸和萘乙酸對生根的貢獻值和貢獻率可知，U1＝256，U1/U＝66.4%；U2＝29.5，U2/U＝7.66%；U3＝48.7，U3/U＝12.6%。

數(shù)據(jù)(表1)經(jīng)均勻設計軟件分析處理后可得回歸方程為Y2=－0.270+13.7X1－1.27X2+0.729X4，顯著性水平α＝0.05，復相關系數(shù)R＝0.8996，剩余標準差S＝0.1860，檢驗值Ft＝12.73＞臨界值F(0.05,3,9)＝3.863，回歸方程具有顯著性。同理，計算激動素、吲哚丁酸和赤霉素對莖段腋芽萌發(fā)生長的貢獻值和貢獻率可知，U1＝0.947，U1/U＝71.5%；U2＝0.193，U2/U＝14.5%；U4＝0.779，U4/U＝58.8%。

表1 影響牛皮杜鵑嫩莖段生根和腋芽萌發(fā)生長主要因素篩選的U13(134)試驗設計與結(jié)果Table1 U13(134)test design and result of effect on the main factors for rooting and axillary bud growing of stems of Rhododendron chrysanthum Pall.

2.2 KT、IBA和NAA濃度交叉配比對牛皮杜鵑嫩莖段生根的影響

由2.1中篩選結(jié)果可知，KT、IBA和NAA對嫩莖段生根影響顯著，GA3對嫩莖段生根影響不顯著。因激動素與生根率呈正相關，而吲哚丁酸和萘乙酸與生根率呈負相關。通過回歸分析推測質(zhì)量濃度高于0.10 mg·L-1的激動素，吲哚丁酸和萘乙酸質(zhì)量濃度分別低于0.10 mg·L-1和0.06 mg·L-1時，生根率可能更高。為驗證此推測的可能性，又以激動素為0.10～0.15 mg·L-1，吲哚丁酸質(zhì)量濃度為0.00～0.10 mg·L-1，萘乙酸質(zhì)量濃度為0.00～0.06 mg·L-1開展11個水平的驗證試驗(表2)，重復3次取平均值。具體操作按1.1和1.2方法，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，激動素質(zhì)量濃度為(0.12～0.14 mg·L-1)、吲哚丁酸質(zhì)量濃度為(0.03～0.08 mg·L-1)和萘乙酸質(zhì)量濃度為(0.02～0.05 mg·L-1)時，牛皮杜鵑嫩莖段生根率提高（圖1b），平均生根率最高可達99.9%，且比表1所列13個處理的生根率高。

表2 影響牛皮杜鵑嫩莖段生根主要激素水平篩選的U11(113)試驗設計與結(jié)果Table2 U11(113)test design and result of effect on the main hormones with levels for stems rooting of Rhododendron chrysanthum Pall.

2.3 KT、IBA和GA3濃度交叉配比對牛皮杜鵑莖段腋芽萌發(fā)生長的影響

由2.1中篩選結(jié)果可知，KT、IBA和GA3對莖段腋芽萌發(fā)生長影響顯著，NAA對莖段腋芽萌發(fā)生長影響不顯著。因激動素和赤霉素與莖段腋芽萌發(fā)生長呈正相關，而吲哚丁酸與莖段腋芽萌發(fā)生長呈負相關。通過回歸分析預測激動素和赤霉素的質(zhì)量濃度分別高于0.10 mg·L-1和2.60 mg·L-1，以及低于0.10 mg·L-1的吲哚丁酸可能莖段腋芽萌發(fā)生長更好。為驗證此預推測的可能性，又以激動素為0.10～0.15 mg·L-1，吲哚丁酸質(zhì)量濃度為0.00～0.10 mg·L-1，赤霉素為2.60～3.00 mg·L-1開展11個水平的驗證試驗(表3)，重復3次取平均值。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過28 d的培養(yǎng)，激動素質(zhì)量濃度在0.13～0.15 mg·L-1、吲哚丁酸質(zhì)量濃度在0.05～0.09 mg·L-1和赤霉素質(zhì)量濃度在2.70～2.90 mg·L-1范圍內(nèi)，牛皮杜鵑莖段腋芽萌發(fā)生長均較好（圖1c），腋芽萌發(fā)后的平均生長長度最高可達3.06 cm，比表1所列13個處理的腋芽長度均大。

表3 影響牛皮杜鵑嫩莖段腋芽萌發(fā)生長主要激素水平篩選的U11(113)試驗設計與結(jié)果Table3 U11(113)test design and result of effect on the main hormones with levels for axillary bud growing of stems of Rhododendron chrysanthum Pall.

由以上實驗結(jié)果可知，由于影響牛皮杜鵑嫩莖段生根的因素和含量范圍是激動素質(zhì)量濃度為(0.12～0.14 mg·L-1)、吲哚丁酸質(zhì)量濃度為(0.03～0.08 mg·L-1)和萘乙酸質(zhì)量濃度為(0.02～0.05 mg·L-1)；而莖段腋芽萌發(fā)生長的的主要影響因素和含量范圍為激動素(0.13～0.15 mg·L-1)、吲哚丁酸質(zhì)量濃度為(0.05～0.09 mg·L-1)和赤霉素質(zhì)量濃度為(2.70～2.90 mg·L-1)。因此，可以確定牛皮杜鵑莖段生根同時腋芽萌發(fā)生長的培養(yǎng)基為：基本培養(yǎng)基+KT(0.13～0.14 mg·L-1)+IBA(0.05～0.08 mg·L-1)+NAA(0.02～0.05 mg·L-1)+GA3(2.70～2.90 mg·L-1)。生根率最高可達99.9%，腋芽萌發(fā)后的平均生長長度最高可達3.06 cm，植株再生率99.2%以上。

2.4 牛皮杜鵑植株高效再生體系建立

按照1.2中的方法，待莖段生根和腋芽萌發(fā)生長至3.50 cm時，苗干發(fā)出7～9個葉時，在超凈工作臺上打開培養(yǎng)瓶，將小植株留1葉剪下苗干，再將苗干切割成1葉1段后，將小莖段轉(zhuǎn)接到莖段生根同時腋芽萌發(fā)生長培養(yǎng)基中再次培養(yǎng)，26～28 d可完成嫩莖段生根同時腋芽萌發(fā)生長（圖1d）。

根據(jù)1.2中的方法計算，增殖周期為28 d，按每瓶接種8個莖段，每個莖段在一個周期內(nèi)可切割成6～7段計算，每年有n個周期（牛皮杜鵑每年12個周期）進行擴繁，年生產(chǎn)試管苗數(shù)為：∑年產(chǎn)成活種苗=8×612株，可見本方法可以滿足牛皮杜鵑工廠化育苗的需要。

2.5 牛皮杜鵑小植株的煉苗和移栽

根據(jù)1.2中的方法，當牛皮杜鵑種苗擴繁到一定數(shù)量后，且小植株長至2.00 cm時，將小植株從培養(yǎng)瓶中取出，放在高錳酸鉀溶液（濃度為10 mg·L-1）中洗凈根上的瓊脂，將小植株栽植到經(jīng)多菌靈（50倍液）消毒過的草炭土、腐爛松針和河砂(2:3:1)的基質(zhì)中，覆蓋塑料薄膜（透性好）進行保濕保溫，控制溫度為(18±2)℃，保持相對濕度在70%～75%之間，12 h/d的自然光照，濕度過高或中午溫度升高時，將薄膜打開小口進行換氣通風，濕度降低時，可在早上噴灑適量清水。20 d后可揭去塑料薄膜，此時小植株平均高度達4～5 cm（圖1e），煉苗成活率可達到97.6%以上，每隔15 d噴灌1次1/20基本培養(yǎng)基的營養(yǎng)液。

50 d后，待小植株生長至10 cm時（圖1f），連同根部土塊定植于盆中（圖1g，h），每隔10 d給葉片噴施一次0.5%的KH2PO4溶液，同時每隔15 d噴灌1次1/20基本培養(yǎng)基的營養(yǎng)液，75 d后苗高可達20 cm以上（圖1i），加強肥水管理，移栽成活率可達96.0%以上。

3 結(jié)論與討論

結(jié)果表明，基本培養(yǎng)基+KT(0.13～0.14 mg·L-1)+IBA(0.05～0.08 mg·L-1)+NAA(0.02～0.05 mg·L-1)+GA3(2.70～2.90 mg·L-1)適合于牛皮杜鵑嫩莖段生根和腋芽萌發(fā)生長。生根率最高可達99.9%，腋芽萌發(fā)后的平均生長長度最高可達3.06 cm，植株再生率99.2%以上。當激動素、吲哚丁酸、萘乙酸和赤霉素分別低于0.13、0.05、0.02和2.70 mg·L-1或分別高于0.14、0.08、0.05和2.90 mg·L-1時，牛皮杜鵑嫩莖段生根和腋芽萌發(fā)生長均出現(xiàn)逐漸降低趨勢，說明過低的植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)不足以誘導牛皮杜鵑嫩莖段試管內(nèi)的生根和腋芽萌發(fā)生長，而過高的植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)對牛皮杜鵑嫩莖段試管內(nèi)的生根和腋芽萌發(fā)生長起抑制作用。激動素、吲哚丁酸和萘乙酸在培養(yǎng)基中的作用主要是促進牛皮杜鵑嫩莖段的生根，聯(lián)合使用效果較好，但對生根的貢獻有所不同，通過激動素、吲哚丁酸、萘乙酸和赤霉素對牛皮杜鵑莖段生根的顯著性檢驗可知，激動素、吲哚丁酸和萘乙酸三個因素對生根率有顯著影響，而赤霉素對生根率影響不顯著，激動素、吲哚丁酸和萘乙酸對生根貢獻率分別為66.4%、7.66%和12.6%，表明激動素對嫩莖段的生根貢獻遠大于吲哚丁酸和萘乙酸，這不僅證實了牛皮杜鵑試管苗的生根對激素及其水平具有不同程度的選擇性[15]，原因在于不同植物的基因型不同，而基因型決定了細胞分裂、分化和器官重建所依賴的激素種類及水平不同。而且也說明在牛皮杜鵑試管苗生根培養(yǎng)基中添加適宜濃度的細胞分裂素（激動素）有利于細胞向根器官功能分化。當激素濃度過高時，可誘導莖段基部形成愈傷組織，繼續(xù)培養(yǎng)根從愈傷組織中發(fā)出，導致苗干和根中的疏導組織連接錯位，在煉苗或移栽時，根隨愈傷組織從苗干脫落，造成成活率下降，Danielle等[14]在1985年也報道了這一現(xiàn)象；其次激動素和吲哚丁酸與赤霉素聯(lián)用對牛皮杜鵑嫩莖段腋芽的萌發(fā)生長具有顯著促進作用，赤霉素主要起到抑制牛皮杜鵑腋芽休眠的作用，可防止腋芽因休眠導致種苗繁殖周期增長，吲哚丁酸對萌發(fā)后的腋芽的生長其關鍵作用，激動素主要起到協(xié)調(diào)和器官分化作用，萘乙酸對牛皮杜鵑嫩莖段腋芽的萌發(fā)生長貢獻不顯著，通過激動素、吲哚丁酸和赤霉素對牛皮杜鵑嫩莖段腋芽萌發(fā)生長的顯著性檢驗可知，激動素、吲哚丁酸和赤霉素對莖段腋芽萌發(fā)生長的貢獻率分別為71.5%、14.5%和58.8%，這也同時說明了激動素、吲哚丁酸和赤霉素在莖段腋芽萌發(fā)生長中的作用和地位。

牛皮杜鵑高效植株再生方式，縮短了牛皮杜鵑種苗繁殖周期，王雯雯等[16]對大字杜鵑快繁研究也確定了此方法的簡捷和可行性。

目前，國內(nèi)外有許多杜鵑花品種已通過人工繁殖并規(guī)模化栽培。我國野生杜鵑花品種眾多，但野生常綠抗寒品種人工繁殖和開發(fā)利用極少。牛皮杜鵑是我國珍貴的野生觀賞植物資源，至今得到推廣應用。本結(jié)果建立了牛皮杜鵑高效植株再生體系，可為牛皮杜鵑的開發(fā)利用和工廠化育苗奠定基礎和提供方法。

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An Efficient Plant Regeneration Method of Rhododendron chrysanthum Pall.Tender Stem Segments in Vitro

GU Di-zhou,YANG Li-juan,WANG Man-ning,LIU Yu,ZHAO Ming-ming, SHEN Hong-mei,ZHU Jun-yi,ZHOU You
College of Life Sciensce/Tonghua Normal University,Tonghua 134002,China

In this study,the young stems of Rhododendron chrysanthum were used as explants,the main factors with different levels of axillary sprouting,shoots growth and shoots rooting were investigated through uniform design experiments. To explore a method of efficient plantlet regeneration in vitro.The results showed that the basic medium+KT 0.13～0.14 mg·L-1+IBA 0.05～0.08 mg·L-1+NAA 0.02～0.05 mg·L-1+GA32.70～2.90 mg·L-1was the most suitable for axillary sprouting,shoots growth and shoots rooting,the rate of plantlet regeneration was 99.2%.Stems each with one node were cut from regenerated shoots and cultured for propagation,and a 6-fold proliferation rate was achieved within 28 days.The survival rate of regenerated plants was more than 96.0%.Efficient plantlet regeneration system of Rhododendron chrysanthum have been successfully established,which is suitable to industrialized seedling for Rhododendron chrysanthum.

Rhododendron chrysanthum Pall.;tender stem segments;uniform design method;plantlet regeneration

圖1 牛皮杜鵑高效育苗各階段的形態(tài)Fig.1 Morphostructure of highly efficient seedlings for Rhododendron chrysanthum Pall.in different stages

Q813.1+2

A

1000-2324(2015)05-0676-06

2013-10-20

2013-11-05

吉林省科技發(fā)展計劃資助項目(20130206060NY;20121705;20150307010NY)

顧地周(1973-),男,吉林通化人,講師,主要從事珍稀瀕危、經(jīng)濟、觀賞和藥用植物研究.E-mail:gudizhou@163.com