王存興,王琛,趙光棟

1.濟(jì)寧高級(jí)職業(yè)學(xué)校,山東濟(jì)寧272100

2.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,山東泰安271018

棉花GhWRKY4a基因的分離及表達(dá)分析

王存興1,王琛2,趙光棟2

1.濟(jì)寧高級(jí)職業(yè)學(xué)校,山東濟(jì)寧272100

2.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,山東泰安271018

WRKY轉(zhuǎn)錄因子是主要存在于植物中的一類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子，在植物的衰老、生長(zhǎng)發(fā)育、生物和非生物脅迫應(yīng)答等過(guò)程中起著重要的調(diào)控作用。本研究通過(guò)電子克隆結(jié)合RT-PCR技術(shù)從陸地棉（Gossypium hirsutum）中分離得到一個(gè)GhWRKY4a基因。序列分析表明，該基因開(kāi)放閱讀框1539 bp，編碼512個(gè)氨基酸，其預(yù)測(cè)蛋白含有一個(gè)WRKY結(jié)構(gòu)域和C2H2型鋅指結(jié)構(gòu)，屬于典型的Ⅱ類(lèi)b族WRKY基因。亞細(xì)胞定位分析顯示，GhWRKY4a特異性的定位在細(xì)胞核中。此外，利用PlantCare數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)該基因啟動(dòng)子含有多個(gè)生物與非生物脅迫響應(yīng)、光應(yīng)答和生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)的順勢(shì)作用元件。利用qRT-PCR方法研究GhWRKY4a基因在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)特性，結(jié)果表明該基因的表達(dá)受到多種生物和非生物脅迫的影響。由此推測(cè)，GhWRKY4a可能參與了復(fù)雜的植物信號(hào)途徑并在植物的抗逆反應(yīng)中發(fā)揮了重要的作用。

棉花;基因克隆;GhWRKY4a;表達(dá)分析

由于植物的固著屬性及自然界的環(huán)境變化，植物時(shí)刻遭受著各種生物和非生物的脅迫，如病蟲(chóng)害、干旱、低溫、高鹽等。為了適應(yīng)多變的環(huán)境條件，植物在進(jìn)化過(guò)程中形成了一系列調(diào)節(jié)機(jī)制。研究結(jié)果表明，轉(zhuǎn)錄因子在這一系列的調(diào)控中具有重要作用[1,2]，有關(guān)高等植物轉(zhuǎn)錄因子編碼基因的結(jié)構(gòu)和功能及其在植物改良中的應(yīng)用研究，已成為植物基因表達(dá)調(diào)控領(lǐng)域的熱門(mén)課題，尤其是擬南芥基因組測(cè)序完成后，對(duì)其轉(zhuǎn)錄因子的研究更為突出[3]。其中WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族是近年來(lái)研究較廣泛的一類(lèi)重要的轉(zhuǎn)錄因子。

WRKY蛋白是主要存在于植物中的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子。自從它的第一個(gè)家族成員在甘薯中被發(fā)現(xiàn)后[4]，WRKY轉(zhuǎn)錄因子逐漸成為人們研究的熱點(diǎn)，在擬南芥（Arabidopsis thaliana）和水稻（Oryza sativa）中分別分離了74和109個(gè)WRKY基因[5]，雷蒙德氏棉（Gossypium raimondii）和陸地棉（Gossypium hirsutum）中分別得到116和103個(gè)WRKY基因[6]。WRKY轉(zhuǎn)錄因子含有一個(gè)或兩個(gè)保守的、約60個(gè)氨基酸的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（被稱(chēng)為WRKY結(jié)構(gòu)域）。WRKY結(jié)構(gòu)域N端為高度保守的氨基酸序列（WRKYGQK），因此命名為WRKY轉(zhuǎn)錄因子；C端為鋅指結(jié)構(gòu)（C-X4-5-C-X22-23-H-X1-H型或C-X7-C-X23-H-X1-C型）[7]。WRKY結(jié)構(gòu)域能夠通過(guò)與核心序列為（T）（T）TGAC（T/C）的W-box順式元件特異結(jié)合而調(diào)節(jié)基因的表達(dá)[8]。根據(jù)WRKY結(jié)構(gòu)域的數(shù)量和鋅指結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)，可將WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族分為三大類(lèi)（Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ）。根據(jù)額外的保守結(jié)構(gòu)，II類(lèi)WRKY轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)一步分為IIa、IIb、IIc、IId和IIe五個(gè)亞族[9]。

WRKY基因在植物體內(nèi)并非組成型表達(dá)，而是受生物脅迫、各種環(huán)境因子（干旱、低溫、高溫、高鹽、機(jī)械脅迫等）和信號(hào)分子的誘導(dǎo)表達(dá)。例如，在辣椒（Capsicum annuum）中，CaWRKY27作為一個(gè)正調(diào)節(jié)因子通過(guò)SA、JA/ET介導(dǎo)的信號(hào)途徑提高了轉(zhuǎn)基因煙草對(duì)青枯菌（R.solanacearum）的抗性[10]。煙草用煙草花葉病毒（TMV）或者細(xì)菌進(jìn)行感染，再或者使用真菌誘導(dǎo)、水楊酸（SA）以及H2O2處理后，將強(qiáng)烈誘導(dǎo)WRKY基因的超量表達(dá)[11-13]。在擬南芥中，49/72的被測(cè)試WRKY基因均對(duì)細(xì)菌感染和SA處理做出了快速反應(yīng)[14]。非生物脅迫如創(chuàng)傷、干旱、低溫的適應(yīng)性、熱誘導(dǎo)的驟冷耐受性也會(huì)引發(fā)WRKY基因在植物中的表達(dá)[15-17]。大量研究表明，WRKY類(lèi)家族基因在植物的抗逆性方面起著重要的作用。

WRKY轉(zhuǎn)錄因子作為植物應(yīng)對(duì)外界生物與非生物脅迫中重要的響應(yīng)蛋白，已經(jīng)越來(lái)越多的引起了人們的關(guān)注。因此，闡明WRKY轉(zhuǎn)錄因子在防御網(wǎng)絡(luò)中調(diào)控與作用機(jī)理，對(duì)于培育抗逆作物品種具有重要的理論與實(shí)踐意義。棉花是一種非常重要的纖維和油料作物，其產(chǎn)量和品質(zhì)常常受到各種復(fù)雜環(huán)境的影響，本研究我們從陸地棉（Gossypium hirsutum）中分離出一個(gè)典型的II類(lèi)b族的WRKY基因，命名為GhWRKY4a，并分析了棉花在受到各種生物脅迫和非生物脅迫后GhWRKY4a的響應(yīng)特性。研究發(fā)現(xiàn)，病原菌及多種抗病相關(guān)激素可以影響GhWRKY4a基因的表達(dá)，GhWRKY4a可能參與復(fù)雜的信號(hào)傳導(dǎo)途徑，并在激素介導(dǎo)的植物的抗病反應(yīng)中起重要作用。本實(shí)驗(yàn)為進(jìn)一步研究該基因在棉花抗病反應(yīng)中的作用奠定了理論基礎(chǔ)，并為棉花基因工程育種提供新的基因資源。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 植物材料供試材料陸地棉（Gossypium hirsutum）魯棉22為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 菌株與質(zhì)粒本研究所用的克隆載體pEASY-T1 simple購(gòu)于Transgen公司，大腸桿菌菌種Escherichia coli（DH5α）為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.3 酶及生化試劑RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒為康為世紀(jì)公司產(chǎn)品，cDNA純化試劑盒Wizard DNA Clean-up System購(gòu)自Promega公司，質(zhì)粒提取試劑盒Plasmid Mini Kit購(gòu)自O(shè)MEGA公司，膠回收試劑盒購(gòu)自索萊寶公司。CTAB、DEPC、Tris、β-巰基乙醇等化學(xué)試劑均購(gòu)于Sigma公司。

1.1.4 PCR引物PCR引物（表1）由上海生物工程公司合成。

表1 本實(shí)驗(yàn)所用的引物序列Table 1 The primers used in this study

1.2 棉花材料處理

棉花種子經(jīng)自來(lái)水沖洗后用濕潤(rùn)的紗網(wǎng)包住置于25℃培養(yǎng)箱中避光催芽萌發(fā)，萌發(fā)的棉花種子去殼后擺放到紗網(wǎng)上于光照培養(yǎng)箱中水培，相對(duì)濕度60～75%，光照強(qiáng)度1500 Lux，光照條件為16 h光照/8 h黑暗。對(duì)子葉期幼苗（約萌發(fā)后的第7 d），進(jìn)行如下脅迫處理：

（1）非生物脅迫處理：

200 mM/L NaCl處理0 h，2 h，4 h，6 h，8 h，12 h；用200 mM NaCl的水培幼苗。

15%PEG6000處理0 h，2 h，4 h，6 h，8 h，12 h；用濃度為15%的PEG6000（w/v）水培幼苗。

（2）信號(hào)分子處理：

10 mmol/L SA處理0 h，2 h，4 h，6 h，8 h，12 h；噴灑葉片。

100 μM/L MeJA處理0 h，2 h，4 h，6 h，8 h，12 h；噴灑葉片。

5 mmol/L ET處理0 h，2 h，4 h，6 h，8 h，12 h；噴灑乙烯利于葉片。

10 mmol/L H2O2處理0 h，2 h，4 h，6 h，8 h，12 h；噴灑葉片。

（3）用青枯病菌、立枯病菌的懸浮液滴灌法接種根，處理時(shí)間段為1 d，2 d，3 d，4 d，5 d。清水作對(duì)照。在不同的處理時(shí)間分別取子葉置于液氮中冷凍，-80°C保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 RNA的提取，cDNA的合成和DNA的分離

RNA的提取根據(jù)TaKaRa公司的TRIzol試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，RNA提取物經(jīng)過(guò)不含RNA酶的DNaseI（Promega公司）純化后，用康為世紀(jì)公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。DNA的提取根據(jù)CTAB法進(jìn)行[18]。

1.4 GhWRKY4a CDS全長(zhǎng)的克隆

根據(jù)雷蒙德氏棉基因組數(shù)據(jù)庫(kù)，設(shè)計(jì)特異性引物WRKY-5和WRKY-3，以cDNA為模板進(jìn)行PCR，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果。將獲得的目的片段回收后連接到克隆載體pEASY-T1 simple上，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，在含Amp的LB固體培養(yǎng)基上37℃培養(yǎng)過(guò)夜后，挑取單菌落，于600 μLLB（Amp）液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)3 h后進(jìn)行菌液PCR鑒定。將鑒定好的菌液寄往上海生物工程公司測(cè)序。

1.5 GhWRKY4a基因組全長(zhǎng)及啟動(dòng)子序列的克隆

利用特異性引物WRKY-5和WRKY-3，以棉花DNA為模板進(jìn)行PCR，并將獲得的目的片段回收后連接到克隆載體pEASY-T1 simple上，轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，篩選陽(yáng)性克隆后送上海生物工程公司進(jìn)行測(cè)序，得到GhWRKY4a的基因組全長(zhǎng)序列。

設(shè)計(jì)特異性引物WRKY-Q-5和WRKY-Q-3，以棉花DNA為模板進(jìn)行PCR，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，切下目的條帶后與克隆載體pEASY-T1 simple相連，篩選陽(yáng)性克隆后送上海生物工程公司測(cè)序得到GhWRKY4a的啟動(dòng)子序列。

1.6 亞細(xì)胞定位分析

利用引物WRKY-L-F（含XbaI酶切位點(diǎn)）和WRKY-L-R（含KpnI酶切位點(diǎn)）來(lái)擴(kuò)增GhWRKY4a全長(zhǎng)cDNA片段，并將目的片段與pEASY-T1 simple載體連接，選擇陽(yáng)性克隆送上海生物工程公司測(cè)序。測(cè)序正確后，利用XbaI和KpnI進(jìn)行雙酶切，將目的片段與PBI121-GFP質(zhì)粒連接構(gòu)建重組質(zhì)粒。通過(guò)基因槍注射，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入洋蔥表皮細(xì)胞中，利用熒光顯微鏡觀察綠色熒光并拍照。

1.7 GhWRKY4a基因的表達(dá)模式分析

以GhUBI基因?yàn)閮?nèi)參基因，利用qRT-PCR分析GhWRKY4a基因的表達(dá)模式。RNA的提取和cDNA的合成與上述方法相同。qRT-PCR所用的SYBR Premix Ex Taq購(gòu)自TaRaKa公司，熒光定量PCR儀CFX96TMReal-time Detection System購(gòu)自Bio-Rad公司。

1.8 生物信息學(xué)分析

利用NCBI網(wǎng)站的BLAST(http://www.ncbi.nlm.gov/blast)和DNAman software 5.2.2進(jìn)行同源序列比對(duì)和分析；用MEGA4.1構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)；用PSORT程序進(jìn)行蛋白預(yù)測(cè)。利用PlantCare（bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）數(shù)據(jù)庫(kù)分析啟動(dòng)子序列。

2 結(jié)果與分析

2.1 GhWRKY4a基因的分離

利用特異性引物WRKY-5和WRKY-3，以棉花總RNA的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR，擴(kuò)增得到一條約1600 bp的條帶。測(cè)序鑒定后，利用DNAman software 5.2.2對(duì)序列進(jìn)行分析，該序列與雷蒙德氏棉基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中的Cotton-D_gene-10023049基因的同源性為98%，初步證明該P(yáng)CR片段為所要克隆的棉花目的基因，命名為GhWRKY4a。該序列包含1539 bp的開(kāi)放閱讀框，編碼512個(gè)氨基酸殘基，預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量為55.04 kDa（圖1）。

圖1 GhWRKY4a全長(zhǎng)CDS序列及其推導(dǎo)的氨基酸序列WRKYGQK序列、翻譯起始密碼子（ATG）與終止密碼子（TAG）用方框標(biāo)出Fig.1 Nucleotide sequences of CDS and deduced sequence of amino acid residues of GhWRKY4aWRJKYGQK sequence,translation initiation codon(ATG)and termination codon(TAG)were marked in box

圖2 GhWRKY4a與其他WRKY蛋白序列的同源性比較相同的氨基酸用黑色陰影標(biāo)出;60個(gè)氨基酸殘基的WRKY結(jié)構(gòu)域用箭頭標(biāo)出;WRKYGQK序列用方框標(biāo)出Fig.2 Comparison of homology between GhWRKY4a and other WRKYprotein sequenceThe same amino acids were shaded in black. The WRKY structure domains of 60 amino acids were indicated with arrows. WRJKYGQK sequence was marked in box

2.2 GhWRKY4a蛋白序列分析

同源蛋白序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，GhWRKY4a蛋白在284～290位氨基酸殘基為一個(gè)典型的WRKY結(jié)構(gòu)域（圖2），是WRKY的典型特征。該WRKY結(jié)構(gòu)域由60個(gè)氨基酸殘基組成，包含一個(gè)保守的WRKYGQK氨基酸序列和一個(gè)C-X4-5-C-X22-23-H-X1-H型鋅指結(jié)構(gòu)（圖2）。這些結(jié)構(gòu)特征表明所得基因確實(shí)為第II亞族的WRKY成員。通過(guò)雷蒙德氏棉基因組數(shù)據(jù)庫(kù)和TAIR網(wǎng)站查到一些已知分類(lèi)的WRKY基因，利用MEGA4.1軟件對(duì)這些WRKY蛋白進(jìn)行聚類(lèi)分析，構(gòu)建了同源進(jìn)化樹(shù)。聚類(lèi)分析表明WRKY蛋白分為三類(lèi)（第I、II、III族），其中第II族可進(jìn)一步分為五個(gè)亞族（IIa、IIb、IIc、IId和IIe）。GhWRKY4a與IIb亞族的WRKY成員進(jìn)化關(guān)系密切，包括AtWRKY42、GrWRKY4（圖3）。由進(jìn)化樹(shù)可以看出，GhWRKY4a屬于IIb亞族。WRKY類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子在進(jìn)化上的多樣性，也預(yù)示了其功能的多樣性，而且不同物種的同一個(gè)亞族的成員間可能在功能上具有相似性。

圖3 GhWRKY4a蛋白序列與雷蒙德氏棉、擬南芥WRKY蛋白質(zhì)序列的聚類(lèi)分析GhWRKY4a用方框標(biāo)出Fig.3 Dendrogram of cluster analysis on GhWRKY4a protein and Gossypium raimondii and Arabidopsis WRKY proteins sequenceGhWRKY4a was marked in box

2.3 GhWRKY4a基因組序列分析

根據(jù)已獲得的GhWRKY4a基因cDNA全長(zhǎng)序列設(shè)計(jì)了一對(duì)特異性引物（WRKY-Q-F和WRKY-Q-R），以棉花基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到長(zhǎng)度為1888 bp的片段。將GhWRKY4a的DNA序列與CDS序列進(jìn)行比較后，發(fā)現(xiàn)該基因共含有4個(gè)內(nèi)含子（圖4）。并且這4個(gè)內(nèi)含子都具有植物內(nèi)含子的典型特征：富含AT；在5′和3′端的剪切位點(diǎn)均含有保守的5′-GT和AG-3′序列。

圖4 GhWRKY4aDNA結(jié)構(gòu)示意圖灰色方塊代表外顯子，直線(xiàn)代表內(nèi)含子Fig.4 Schematic representation of the DNA structure of GhWRKY4aGrey boxes indicated exons,and lines indicated introns

2.4 GhWRKY4a基因的啟動(dòng)子序列分析

利用雷蒙德氏棉基因組數(shù)據(jù)庫(kù)，設(shè)計(jì)特異性引物WRKY-Q-F和WRKY-Q-R，克隆得到1098 bp的啟動(dòng)子序列。用PlantCare軟件分析預(yù)測(cè)后發(fā)現(xiàn)，在該啟動(dòng)子中，包含多種脅迫相關(guān)的應(yīng)答元件，部分預(yù)測(cè)的順式作用原件序列及位置如圖5。該序列中存在典型的TATA-box和CAAT-box。除此之外，這該區(qū)域中還存在非生物脅迫應(yīng)答元件（如CGTCA-motif（響應(yīng)信號(hào)分子MeJA），ERE（響應(yīng)信號(hào)分子ethylene），TC-rich repeats（脅迫和防御反應(yīng)元件），以及與干旱脅迫有關(guān)的MBS元件等），生物脅迫應(yīng)答元件，光響應(yīng)元件及生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)的元件。預(yù)測(cè)結(jié)果表明，GhWRKY4a可能與植物的生物和非生物脅迫應(yīng)答和生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)。

圖5 GhWRKY4a啟動(dòng)子部分作用元件Fig.5 Functional partial elements of the promoter of GhWRKY4a

2.5 亞細(xì)胞定位分析

運(yùn)用在線(xiàn)分析軟件PSORT，預(yù)測(cè)GhWRKY4a蛋白定位在細(xì)胞核。為了進(jìn)一步確認(rèn)GhWRKY4a蛋白在細(xì)胞內(nèi)的亞細(xì)胞定位，將CaMV35S啟動(dòng)子與GhWRKY4a連接構(gòu)建了pBI121-GhWRKY4a-GFP表達(dá)載體，35S::GFP作對(duì)照（圖6-A）。然后用基因槍法將重組質(zhì)粒和空載體轉(zhuǎn)化入洋蔥表皮細(xì)胞使其瞬時(shí)表達(dá)，經(jīng)DAPI染色觀察細(xì)胞核后，利用GFP發(fā)射的熒光觀察GhWRKY4a的定位。如圖6-B所示，含有GhWRKY4a-GFP融合蛋白在洋蔥表皮中瞬時(shí)表達(dá)定位在細(xì)胞核，對(duì)照35S-GFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)化洋蔥表皮后起GFP熒光信號(hào)在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中都有表達(dá)，通過(guò)此結(jié)果可以推斷GhWRKY4a定位于細(xì)胞核內(nèi)。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果與軟件預(yù)測(cè)一致。

圖6 GhWRKY4a::GFP融合蛋白的亞細(xì)胞定位（A）35S-GhWRKY4a::GFP和35S-GFP載體構(gòu)建圖;（B）35S-GFP和35S-GhWRKY4a::GFP在洋蔥表皮中的瞬時(shí)表達(dá)?；驑屴Z擊洋蔥表皮后12 h通過(guò)熒光顯微鏡進(jìn)行觀察Fig.6 Subcellular localization of GhWRKY4a::GFPfusion protein(A) Schematic representation of 35S-GhWRKY4a::GFP fusion construct and 35S-GFP construct. (B) Transient expression of the 35S-GhWRKY4a::GFP and 35S-GFPconstructs in onion epidermal cells. The cells were viewed by confocal laser scanning microscope at 12 h after particle bombardment.

2.6 GhWRKY4a基因的表達(dá)模式分析

通過(guò)對(duì)GhWRKY4a啟動(dòng)子序列的預(yù)測(cè)分析，可以推測(cè)GhWRKY4a可能參與到植物的脅迫應(yīng)答過(guò)程中。為進(jìn)一步研究GhWRKY4a的功能，我們通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法，檢測(cè)了GhWRKY4a在生物脅迫、非生物脅迫及外源植物激素的作用下的表達(dá)特性。越來(lái)越多的研究證明WRKY家族參與植物的非生物脅迫應(yīng)答反應(yīng)，為了探究GhWRKY4a是否參與了非生物脅迫應(yīng)答，我們對(duì)棉花進(jìn)行了干旱（PEG），高鹽（NaCl）處理。由圖7-B可以看出，干旱處理后，GhWRKY4a的表達(dá)量從2 h開(kāi)始增加，8 h達(dá)到最大值。而NaCl處理后，該基因的表達(dá)沒(méi)有明顯的變化（圖7-A）。

為了探討GhWRKY4a在棉花應(yīng)對(duì)生物脅迫中的作用，我們給棉花幼苗接種了棉立枯（R.solani）和青枯勞爾氏菌（R.solanacearum）。結(jié)果如圖7-G所示，在接種棉立枯后，GhWRKY4a表達(dá)明顯受到抑制，接種第二天開(kāi)始基因表達(dá)量明顯提高但都低于對(duì)照組。在接種青枯勞爾氏菌后，GhWRKY4a的表達(dá)量同樣顯著下降（圖7-H）。因此，我們推測(cè)GhWRKY4a可能參與病原信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。

植物激素以信號(hào)分子的形式參與到植物復(fù)雜的信號(hào)途徑中，SA、JA、ET和H2O2等作為重要的信號(hào)分子在調(diào)解下游防衛(wèi)基因和植物應(yīng)對(duì)生物和非生物脅迫的應(yīng)答反應(yīng)中發(fā)揮著不可或缺的作用[19-20]。為了研究GhWRKY4a在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用，我們檢測(cè)了該基因在SA，ET，MeJA和H2O2誘導(dǎo)條件下的表達(dá)特性。由圖7可以看出，SA，ET，MeJA和H2O2均能顯著抑制該基因的表達(dá)。根據(jù)這些結(jié)果推斷GhWRKY4a可能參與復(fù)雜的信號(hào)傳導(dǎo)途徑，并在激素介導(dǎo)的植物的抗病反應(yīng)中起重要作用。

圖6 GhWRKY4a在不同處理?xiàng)l件的表達(dá)模式分析Fig.6 Expression patterns analysis of GhWRKY4a under different treated conditions

3 討論

隨著基因分子生物學(xué)研究的不斷深入，越來(lái)越多的WRKY家族轉(zhuǎn)錄因子被克隆。WRKY轉(zhuǎn)錄因子作為植物應(yīng)對(duì)外界生物與非生物脅迫中重要的響應(yīng)蛋白已經(jīng)引起人們?cè)絹?lái)越多的關(guān)注。WRKY基因家族除了在植物抗逆信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)方面發(fā)揮著重要作用以外，在調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育方面也具有非常重要的作用，包括葉片的衰老、種子形成、休眠、萌發(fā)、果實(shí)的成熟、根毛發(fā)育、胚胎形成等過(guò)程。目前WRKY轉(zhuǎn)錄因子在植物體內(nèi)尤其是在模式植物水稻和擬南芥中的生物學(xué)功能得到了廣泛的研究和闡明，但是關(guān)于棉花WRKY基因的結(jié)構(gòu)和功能研究非常少。棉花是一種重要的經(jīng)濟(jì)作物，其產(chǎn)量常常受到各種復(fù)雜環(huán)境的影響，為探究棉花WRKY轉(zhuǎn)錄因子的功能，我們以棉花為研究對(duì)象，分離了一個(gè)IIb亞族WRKY基因，命名為GhWRKY4a，并對(duì)其表達(dá)特性及生物學(xué)功能進(jìn)行了初步探討。

蛋白序列分析及聚類(lèi)分析發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子GhWRKY4a具有典型的WRKY結(jié)構(gòu)域，是WRKY基因Ⅱ類(lèi)b族的成員之一。亞細(xì)胞定位進(jìn)一步證明了GhWRKY4a定位于細(xì)胞核內(nèi)，這就意味著GhWRKY4a與其他的WRKY轉(zhuǎn)錄因子一樣是在細(xì)胞核中發(fā)揮作用的。這與轉(zhuǎn)錄因子主要在細(xì)胞核中行使其功能的特征一致。

為了深入了解GhWRKY4a的功能，我們克隆了這個(gè)基因的部分啟動(dòng)子序列并對(duì)該序列進(jìn)行了預(yù)測(cè)分析，發(fā)現(xiàn)該啟動(dòng)子序列中除了含有啟動(dòng)子的核心序列TATA-box，CAAT-box，還發(fā)現(xiàn)了信號(hào)分子應(yīng)答元件、光應(yīng)答元件、非生物脅迫應(yīng)答元件、胚乳發(fā)育相關(guān)的元件等。對(duì)啟動(dòng)子序列的分析將有助于更進(jìn)一步的了解基因的功能。GhWRKY4a基因在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)特性分析進(jìn)一步表明，該基因的表達(dá)受到多種生物和非生物脅迫的影響。推測(cè)GhWRKY4a可能參與復(fù)雜的信號(hào)傳導(dǎo)途徑，并在植物的抗逆反應(yīng)中起重要作用。

在抗病應(yīng)答過(guò)程中，植物激活體內(nèi)一系列的信號(hào)途徑，這些信號(hào)途徑中許多抗病相關(guān)基因能夠被激活表達(dá)。SA、JA、ET是抗病反應(yīng)中關(guān)鍵的信號(hào)分子。SA介導(dǎo)的信號(hào)途徑一般與活體營(yíng)養(yǎng)型病菌激發(fā)的抗病反應(yīng)相關(guān)；而JA/ET介導(dǎo)的信號(hào)途徑一般與壞死營(yíng)養(yǎng)型病菌或者昆蟲(chóng)侵染激發(fā)的抗病反應(yīng)相關(guān)[21]。這兩種信號(hào)途徑通過(guò)相互拮抗或者協(xié)同作用共同影響著植物抗病反應(yīng)的結(jié)果。SA和H2O2是植物防衛(wèi)反應(yīng)中兩種非常重要的信號(hào)分子，植物本身系統(tǒng)獲得性抗性（System acquired resistance,SAR）就是SA介導(dǎo)的。H2O2作為第二信使能夠自由穿越細(xì)胞膜直接行使胞間信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能，在植物的防衛(wèi)反應(yīng)中起重要作用。另外，當(dāng)植物受到環(huán)境脅迫時(shí)，體內(nèi)活性氧（ROS）會(huì)迅速增加，從而激活相關(guān)基因的表達(dá)，H2O2是ROS的組分之一。對(duì)GhWRKY4a在多種信號(hào)分子脅迫下的表達(dá)特性進(jìn)行了分析，結(jié)果表明，GhWRKY4a的表達(dá)可以被SA、MeJA、ET和H2O2所抑制。由此推測(cè)GhWRKY4a可能參與SA信號(hào)途徑及JA/ET介導(dǎo)的抗病信號(hào)途徑。

綜上所述，GhWRKY4a應(yīng)答于多種信號(hào)分子、非生物脅迫和病原菌脅迫，由此我們推測(cè)，該基因可能參與棉花的抗病反應(yīng)，本研究為進(jìn)一步探明該基因在棉花防衛(wèi)反應(yīng)中的作用奠定了基礎(chǔ)。

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IsolationandExpressionAnalysisofGhWRKY4afromGossypiumhirsutum

WANG Cun-xing1,WANG Chen2,ZHAO Guang-dong2
1.Jining Senior Vocational School,Jining 272100,China
2.College of Life Science/Shandong Agricultural University,Taian 271018,China

WRKY transcription factors are a kind of transcription factors mainly existing in plants.It plays an important role in regulating plant senescence,growth,development and responses to various abiotic and biotic stresses.In this study,we isolated and characterized GhWRKY4a from cotton(Gossypium hirsutum)through the in silico cloning and RT-PCR.Sequence analysis revealed that the GhWRKY4a contained a complete open reading frame(ORF)of 1539 bp,which encoded 512 amino acids.The predicted protein contains a WRKY domain and a C2H2-type zinc finger motif,which belongs to typicalⅡb family.Subcellular localization analysis revealed that GhWRKY4a protein localized to the nucleus.In addition,various putative cis-acting elements involved in abiotic and biotic stress responses,light responses and development were predicted by the database search programs PlantCare.We analyzed the expression pattern at the level of transcription of GhWRKY4a by quantitative real-time PCR.The result showed that the expression of GhWRKY4a was influenced by various abiotic and biotic stresses.According to the results, we deduced that GhWRKY4a is regulated by an intricate network of signaling cascades and may play an important role in cotton defense responses.

Cotton;gene cloning;GhWRKY4a;expression analysis

S642.4

A

1000-2324(2015)05-0658-08

2014-04-11

2014-05-02

王存興(1959-),男,學(xué)士,高級(jí)講師,主要從事植物生物學(xué)教學(xué)與研究.E-mail:wangcx7818@sina.com