李新生，焦顯芹，高文明，李雙亮，張秀文，崔保安

(1 河南農(nóng)業(yè)大學 牧醫(yī)工程學院，河南 鄭州 450002；2 河南省出入境檢驗檢疫局，河南 鄭州 450003；3 浙江美保龍生物技術(shù)有限公司，浙江 金華 321017)

蛋雞抗IBV HI抗體效價與攻毒后產(chǎn)蛋性能的相關(guān)性

李新生1，焦顯芹1，高文明1，李雙亮2，張秀文3，崔保安1

(1 河南農(nóng)業(yè)大學 牧醫(yī)工程學院，河南 鄭州 450002；2 河南省出入境檢驗檢疫局，河南 鄭州 450003；3 浙江美保龍生物技術(shù)有限公司，浙江 金華 321017)

【目的】 研究抗呼吸型IBV HI抗體水平與蛋雞產(chǎn)蛋率的對應關(guān)系?！痉椒ā?將180只SPF雞分為4組，第1組和第2組首免用雞傳染性支氣管炎H120活疫苗免疫，1羽份/只，4周后采血，第2組雞同時用3批次的雞新城疫、傳染性支氣管炎、禽流感(H9亞型)三聯(lián)滅活疫苗(La Sota株+M41株+HN6株)分別進行加強免疫，試驗同時設(shè)置攻毒對照第3組和不免疫攻毒對照第4組。滅活疫苗免疫4周后，當產(chǎn)蛋率穩(wěn)定在80%以上時，對試驗雞采血測定抗體，同時使用M41株病毒進行攻毒，記錄攻毒后4周內(nèi)各組雞的產(chǎn)蛋性能，分析抗IBV HI抗體水平與攻毒后產(chǎn)蛋性能的相關(guān)性?！窘Y(jié)果】 弱毒活疫苗和滅活疫苗聯(lián)合免疫組抗IBV HI抗體水平在2-8.2～2-9.3時，免疫雞能夠耐受IBV強毒的攻擊，其產(chǎn)蛋性能不受影響。弱毒活疫苗免疫組抗體為2-4.8，產(chǎn)蛋量下降了12.69%。攻毒對照組抗體水平為2-2.0，攻毒后產(chǎn)蛋量下降45.22%。【結(jié)論】 蛋雞抗IBV HI抗體效價與產(chǎn)蛋率對雞傳染性支氣管炎強毒的攻毒保護之間呈正相關(guān)，可以用HI抗體檢測來評價雞傳染性支氣管炎滅活疫苗對產(chǎn)蛋雞的免疫效果。

IBV；HI抗體效價；攻毒；產(chǎn)蛋性能

傳染性支氣管炎(IB)是由雞傳染性支氣管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)引起的雞的一種急性、高度接觸傳染性、病毒性呼吸道疾病，其特征是氣管啰音、咳嗽和打噴嚏[1-2]。該病可侵害呼吸道、生殖道，造成產(chǎn)蛋雞產(chǎn)蛋數(shù)量和蛋品質(zhì)下降，是危害養(yǎng)雞業(yè)健康發(fā)展的重要疫病之一[3-5]，因此做好IB的防控工作具有重要意義。

目前，在生產(chǎn)實踐中，使用傳染性支氣管炎弱毒疫苗和滅活疫苗免疫接種被認為是預防控制IB流行的有效手段[6]。IB疫苗免疫效果的評價手段較多，如觀察氣管環(huán)纖毛保護情況、經(jīng)雞胚進行病毒分離鑒定[7-8]、攻毒后觀察雞產(chǎn)蛋性能或攻毒后觀察臨床癥狀[8]等。上述方法耗時繁瑣，且因操作條件、試驗動物級別等難以標準化，使檢驗結(jié)果可能會有較大誤差。隨著商品化IBV HI抗原的應用，使得利用血清學方法代替攻毒試驗、病毒分離鑒定等對傳染性支氣管炎疫苗免疫效果的評價成為可能。為了了解雞血清中抗IBV HI抗體效價與攻毒后產(chǎn)蛋性能之間的相關(guān)性，本研究參考文獻[9-11]中的方法，用雞新城疫、傳染性支氣管炎、禽流感(H9亞型)三聯(lián)滅活疫苗(La Sota株+M41株+HN6株)(以下簡稱“三聯(lián)疫苗”)免疫SPF雞，分析抗IBV HI抗體效價與攻毒后產(chǎn)蛋性能的相關(guān)性，以期證實血清學檢驗方法與攻毒試驗之間的平行關(guān)系?，F(xiàn)將研究結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 檢測用抗原 IBV M41HI抗原、標準陽性血清和陰性血清，均購于GD公司。

1.1.2 傳染性支氣管炎弱毒疫苗 雞傳染性支氣管炎弱毒疫苗H120，購自北京市獸醫(yī)生物藥品廠。

1.1.3 攻擊用毒種 IBV M41株，由河南農(nóng)業(yè)大學動物性食品安全重點實驗室保存提供，經(jīng)繁殖后測定病毒含量為每0.1 mL 10-7.5EID50。

1.1.4 試驗用疫苗 分別制備雞新城疫病毒、IBV和低致病性的禽流感病毒，按照規(guī)定的工藝濃縮、乳化制備雞新支流感(H9亞型)三聯(lián)滅活疫苗(La Sota株+M41株+HN6株)3批中試產(chǎn)品，標記為1001、1002、1003。疫苗中含滅活的雞新城疫病毒La Sota株(滅活前的病毒含量為每0.1 mL≥3×10-8.0EID50)、IBV M41株(滅活前的病毒含量為每0.1 mL≥3×10-6.0EID50)和禽流感病毒(H9亞型)HN6株(滅活前的病毒含量為每0.1 mL≥3×10-7.0EID50)。

1.1.5 檢驗用雞 180只SPF白來航雞(70日齡)購自北京梅里亞維通實驗動物有限公司，飼養(yǎng)在河南農(nóng)業(yè)大學實驗動物中心SPF雞正負壓隔離器內(nèi)。

1.2 方 法

1.2.1 試驗分組 參照OIE介紹的雞傳染性支氣管炎滅活疫苗對產(chǎn)蛋雞免疫效能的試驗方法，進行如下試驗。取140日齡SPF蛋雞，第1組30只，僅接種IB H120活疫苗1羽份首免，作為弱毒疫苗基礎(chǔ)免疫對照組；第2組90只，先接種IB H120活疫苗1羽份首免，4周后均分為3個小組，分別用3批新支流感三聯(lián)滅活疫苗加強免疫(二免)，0.5 mL/只；第3組和第4組各30只，不進行任何免疫作為對照組。各組雞都隔離飼養(yǎng)，記錄每組雞的產(chǎn)蛋量，產(chǎn)蛋量穩(wěn)定后(二免后3周左右)，按照文獻[12]的方法，對第1、2、3組試驗雞使用1∶10稀釋的M41株病毒液進行點眼、滴鼻攻毒，0.3 mL/只，第4組30只未免疫試驗雞不攻毒作為空白對照組，統(tǒng)計攻毒后4周內(nèi)產(chǎn)蛋的數(shù)量和質(zhì)量。分別于H120活疫苗免疫前、首免后4周和攻毒試驗前采集各組雞血樣，分離血清，測定抗IBV HI抗體水平。分析HI抗體水平與攻毒后產(chǎn)蛋性能的相關(guān)性。

1.2.2 抗IBV HI抗體水平的測定 按中國獸藥典[13]中有關(guān)雞傳染性支氣管炎HI抗原的使用說明測定抗呼吸型IBV 的HI抗體，具體操作如下。①取96孔V型微量反應板，每孔加25 μL PBS液。②分別吸取25 μL待檢血清，加至每塊板的第一列各孔內(nèi)，并在每塊板上設(shè)標準陽性血清和陰性血清對照，然后2倍系列稀釋。③分別向各孔中加入含4 單位的抗原25 μL，2～8 ℃靜置30 min。④每孔中加入體積分數(shù)1%的雞紅細胞懸液25 μL，輕輕混勻，2～8 ℃靜置40 min。⑤結(jié)果判定。將反應板傾斜，凡血清反應孔與雞紅細胞對照孔中紅細胞以同樣速度從孔底流淌者判為血凝抑制。當陰性血清HI效價≤2-3、陽性血清HI效價與規(guī)定效價相比誤差≤2-1時，則試驗成立。以完全抑制4單位抗原的血清最高稀釋度作為HI效價。

2 結(jié)果與分析

2.1 免疫前后產(chǎn)蛋雞抗IBV HI抗體的變化

由表1可知，免疫前各組試驗雞抗體水平在2-1.0～2-2.0；首免4周后，1、2組試驗雞抗體水平為2-2.0～2-2.9；對第2組的3個小組進行二免，攻毒前其抗IBV HI抗體水平達2-8.2～2-9.3，是首免抗體水平的4.1～4.3倍，而此時第1組蛋雞的抗體僅為2-4.8；第3、4組試驗雞未作任何免疫，在整個采血期內(nèi)抗體變化不顯著，抗IBV HI抗體水平均<2-3.0。

注：1組不進行二免；3組和4組不進行免疫，4組不攻毒。

Note:Chickens in group 1 had no the second vaccination;Chickens in group 3 and group 4 had no vaccination,chickens in group 4 had no challenge.

2.2 產(chǎn)蛋雞抗IBV HI抗體水平與產(chǎn)蛋性能的關(guān)系

產(chǎn)蛋高峰前，監(jiān)測每只雞的產(chǎn)蛋量，新支流感(H9亞型)三聯(lián)滅活疫苗免疫4周后(即28周齡時)，產(chǎn)蛋量達到高峰，產(chǎn)蛋率穩(wěn)定維持在80%以上，此時對試驗雞采血測定二免抗體，即攻毒前抗體，采血后對試驗雞進行攻毒，統(tǒng)計攻毒后4周內(nèi)各組試驗雞的產(chǎn)蛋數(shù)量和質(zhì)量，結(jié)果見表1。由表1可見，對第1組：只用H120弱毒活疫苗進行免疫，攻毒前抗體水平為2-4.8，產(chǎn)蛋率為80.4%，產(chǎn)蛋質(zhì)量正常。攻毒后4周內(nèi)，產(chǎn)蛋率下降至70.2%，較攻毒前下降了12.69%，并且所產(chǎn)蛋的品質(zhì)也有所下降，蛋殼顏色變淺，有少量畸形蛋，約占3%。

對第2組：各滅活疫菌小組攻毒前的抗體水平分別為2-8.6，2-9.3和2-8.2，產(chǎn)蛋率分別為80.3%，80.6%和80.5%，所產(chǎn)蛋質(zhì)量正常。攻毒后4周內(nèi)，產(chǎn)蛋率分別為79.1%，79.3%和79.0%，較攻毒前分別下降了1.49%，1.61%和1.86%，所產(chǎn)蛋的品質(zhì)正常，無畸形蛋和軟殼蛋，產(chǎn)蛋率的下降主要發(fā)生在攻毒后產(chǎn)蛋率統(tǒng)計周期的第1周，隨后受試雞產(chǎn)蛋率就恢復到了正常水平，這種產(chǎn)蛋率的下降可能是由于攻毒時引起的應激造成的。

對第3組：試驗雞未進行任何免疫，攻毒前抗體水平為2-2.0，產(chǎn)蛋率為80.5%，產(chǎn)蛋質(zhì)量正常。攻毒后產(chǎn)蛋率下降為44.1%，較攻毒前下降了45.22%，并且產(chǎn)蛋的品質(zhì)下降，蛋殼顏色變淺，有畸形蛋和軟殼蛋，占5%～8%。

對第4組：試驗雞未進行任何免疫，不攻毒作為空白對照組，整個試驗周期內(nèi)，產(chǎn)蛋率為80.3%～80.4%，無明顯波動，所產(chǎn)蛋的品質(zhì)正常。

3 討 論

3.1 弱毒疫苗和滅活疫苗聯(lián)合免疫提高雞抗IBV的HI抗體水平

本研究中，免疫前，各組雞的抗IBV的HI抗體水平均≤2-2.0；使用H120活疫苗免疫后4周，HI抗體水平上升至2-2.0～2-2.9；H120活疫苗免疫后再用新支流感三聯(lián)滅活疫苗加強免疫，4周后抗體水平達到2-8.2～2-9.3，而此時單獨免疫H120活疫苗的HI抗體水平僅為2-4.8，而未免疫組的HI抗體水平仍<2-3.0。從試驗結(jié)果來看，僅使用IB弱毒活疫苗進行免疫，并不能使試驗雞產(chǎn)生較高的HI抗體水平，這可能與活疫苗主要引起機體的細胞免疫反應有關(guān)[14-15]；而在活疫苗進行基礎(chǔ)免疫的情況下，再使用滅活疫苗加強免疫，能夠刺激機體產(chǎn)生較強的免疫應答，HI抗體水平顯著升高，由此可見，使用弱毒疫苗和滅活疫苗進行聯(lián)合免疫能顯著提升雞抗IBV 的HI抗體水平。

3.2 雞抗IBV HI抗體水平與產(chǎn)蛋性能的關(guān)系

為研究SPF雞血清抗體與攻毒后對產(chǎn)蛋性能保護的對應關(guān)系，當試驗雞產(chǎn)蛋量穩(wěn)定在80%以上時，采血測定抗IBV HI抗體，并進行攻毒，統(tǒng)計攻毒后4周內(nèi)各組雞產(chǎn)蛋情況，結(jié)果表明，非免疫對照組抗體<2-3.0，攻毒后的產(chǎn)蛋率較攻毒前下降了45.22%，蛋品質(zhì)也下降；免疫活苗后接種滅活苗的試驗組抗體水平均在2-6.0以上，且二免抗體是首免抗體的4倍以上，攻毒后的產(chǎn)蛋量與攻毒前相比基本沒有下降，與空白對照組的產(chǎn)蛋量基本一致，均維持在79%以上，并且蛋品質(zhì)正常；僅進行弱毒活苗基礎(chǔ)免疫的試驗雞攻毒前HI抗體水平為2-4.8，攻毒后產(chǎn)蛋率下降了12.69%，下降幅度介于以上兩組之間，且蛋品質(zhì)有部分下降。由此可見，雞只的HI抗體水平與攻毒后對產(chǎn)蛋性能的保護力呈密切正相關(guān)，抗體水平越高，對雞只的保護力也就越強。當HI抗體水平≥2-6.0時，攻毒后可保護產(chǎn)蛋雞的產(chǎn)蛋量較穩(wěn)定，當抗體水平<2-6.0時，對產(chǎn)蛋雞的保護力相對較低，抗體水平越低，攻毒后雞只的產(chǎn)蛋量下降也較多。據(jù)英國藥典[16]規(guī)定，合格疫苗的標準應該是，能夠刺激機體產(chǎn)生≥2-6.0的抗體，而在OIE中對用于產(chǎn)蛋雞免疫疫苗的效力評價同樣規(guī)定,免疫SPF雞4周后平均HI效價>2-6.0。本研究結(jié)果與上述標準一致。

3.3 用HI抗體水平檢測開產(chǎn)雞的免疫力

根據(jù)OIE規(guī)定，在進行含有IBV滅活疫苗免疫效能檢驗(對產(chǎn)蛋雞)時，可進行如下分組：弱毒苗基礎(chǔ)免疫試驗組、弱毒苗基礎(chǔ)免疫和三聯(lián)滅活疫苗聯(lián)合免疫試驗組和不進行任何免疫對照組。本研究在試驗分組時，又增加了空白不攻毒對照組，同時將滅活疫苗加強免疫的時間設(shè)在了產(chǎn)蛋高峰前4周，當免疫后4周采血時產(chǎn)蛋率已達高峰，所檢測的抗體水平即可作為攻毒前抗體水平，避免了多次采血對試驗雞的應激影響。OIE規(guī)定對照組攻毒后產(chǎn)蛋率下降至少67%，而目前國際上對攻毒試驗的判定標準有放寬的趨勢，如歐洲藥典[17]規(guī)定，用麻省型的毒株對非免疫雞群攻毒能引起35%以上的產(chǎn)蛋下降時，疫苗免疫組對產(chǎn)蛋的保護才認為有效。本試驗中，對照組攻毒后產(chǎn)蛋率下降了45.22%，未達到OIE中的規(guī)定，這可能是由于攻擊用M41毒株使用的量以及攻毒株繁殖代次等原因造成的毒力變化所致，也可能是隨SPF雞日齡的增加其抵抗力有所增強造成的。由于影響試驗雞產(chǎn)蛋率的因素較多，試驗過程中必須進行標準的飼養(yǎng)管理，保證試驗雞處在相同的外部環(huán)境中，排除任何可能會影響到試驗結(jié)果的因素。由于受試驗條件的限制，對產(chǎn)蛋雞的攻毒試驗在以往的研究中較少，積累的經(jīng)驗缺乏，有待以后開展更大規(guī)模的研究驗證工作。

[1] Saif Y M,Barnes H J,Glisson J R,et al.Diseases of poultry [M].Ames：Iowa State University Press,2003:139-141.

[2] Jones R C.The isolation and some biological properties of a variant avian infectious bronchitis virus [J].Vet Rec,1976,98(14):278-279.

[3] Cavanagh D.Coronavirus avian infectious bronchitis virus [J].Vet Res,2007,38(2):281-297.

[4] Ignjatovic J,Sapats S.Avian infectious bronchitis virus [J].Rev Sci Tech,2000,19(2):493-508.

[5] Han Z,Sun C,Yan B,et al.A 15-year analysis of molecular epidemiology of avian infectious bronchitis coronavirus in China [J].Infect Genet Evol,2011,11(1):190-200.

[6] 王文秀,顧節(jié)清,沈志強.雞傳染性支氣管炎病毒變異機理及疫苗研究現(xiàn)狀 [J].動物醫(yī)學進展,2010,31(12):116-119.

Wang W X,Gu J Q,Shen Z Q.Research status in michanism of variabi lity and vaccine of avain infectious bronchitis virus [J].Progress in Veterinary Medicine,2010,31(12):116-119.(in Chinese)

[7] Boroomand Z,Asasi K,Mohammadi A.Pathogenesis and tissue distribution of avian infectious bronchitis virus isolate IRFIBV32 (793/B serotype) in experimentally infected broiler chickens [J].Scientific World Journal,2012,2012:402-537.

[8] Dhinakar R G,Jones R C.Protectotypic differentiation of avian infectious bronchitis viruses using aninvitrochallenge model [J].Vet Microbiol,1996,53(3/4):239-252.

[9] 姜北宇,張建偉,李 林,等.雞新城疫 傳染性支氣管炎 減蛋綜合征 傳染性腦脊髓炎四聯(lián)滅活疫苗傳染性支氣管炎部分效力試驗研究 [J].中國獸藥雜志,2009,43(1):17-20.

Jiang B Y,Zhang J W,Li L,et al.Efficacy test of IB part in the tetravalent inactivated vaccine against Newcastle disease,infectious bronchitis,egg drop syndrome and avian encephalomyelitis [J].Chinese Journal of Veterinary Drug,2009,43(1):17-20.(in Chinese)

[10] 世界動物衛(wèi)生組織.哺乳動物、禽、蜜蜂A類和B類疾病診斷試驗和疫苗標準手冊 [M].4版.農(nóng)業(yè)部獸醫(yī)局，中國動物衛(wèi)生與流行病學中心，譯.北京:中國農(nóng)業(yè)出版社，2002:655-664.

The World Organization for Animal Health.Terrestrial animal diagnostic tests and vaccines (mammals,birds and bees) [M].4th ed.Bureau of Ministry of Agriculture,Veterinary China Animal Health and Epidemiology Center.Beijing:China Agriculture Press,2002:655-664.(in Chinese)

[11] Tarpey I,Huggins M B,Orbell S J.The efficacy of an avian metapneumovirus vaccine applied simultaneously with infectious bronchitis and Newcastle disease virus vaccines to specific-pathogen-free chickens [J].Avian Dis,2007,51(2):594-596.

[12] De Wit J J,Boelm G J,van Gerwe T J,et al.The required sample size in vaccination-challenge experiments with infectious bronchitis virus,a meta-analysis [J].Avian Pathol,2013,42(1):9-16.

[13] 中國獸藥典委員會.中華人民共和國獸藥典 [M].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,2005.

Chinese Veterinary Pharmacopoeia Committee.The People’s Republic of China veterinary pharmacopoeia [M].Beijing:China Agriculture Press,2005.(in Chinese)

[14] Okino C H,Alessi A C,Montassier M F,et al.Humoral and cell-mediated immune responses to different doses of attenuated vaccine against avian infectious bronchitis virus [J].Viral Immunol,2013,26(4):259-267.

[15] Emmott E,Munday D,Bickerton E,et al.The cellular interactome of the coronavirus infectious bronchitis virus nucleocapsid protein and functional implications for virus biology [J].J Virol,2013,87(17):9486-9500.

[16] British Pharmacopoeia.Avian infectious bronchitis vaccine (ina-ctivated) [M].London:Cambridge University Press,2013:205-206.

[17] European Pharmocopoeia.Avian infectious bronchitis vaccine (inactivated),strasbourg [M].Paris:EDQM,2012:3881-3882.

Relationship between HI antibody titers against infectious bronchitis virus and egg production rate

LI Xin-sheng1,JIAO Xian-qin1,GAO Wen-ming1,LI Shuang-liang2, ZHANG Xiu-wen3,CUI Bao-an1

(1CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine,HenanAgriculturalUniversity,Zhengzhou,Henan450002,China; 2HenanEntry-ExitInspectionandQuarantineBureau,Zhengzhou,Henan450003,China;3ZhejiangMeibaolongBiotechnologyLtd,Jinhua,Zhejiang321017,China)

【Objective】 This paper studied the relationship between HI antibody titers against infectious bronchitis virus strain and egg production rate.【Method】 180 SPF chickens were divided into 4 groups.Chickens in the first and second groups were immunized with H120live vaccine.4 weeks later,the second group chickens were vaccinated with Newcastle disease,infectious bronchitis,and avian influenza virus (H9subtype) triple inactivated vaccine (La Sota+M41+HN6 strain).Group 3 and Group 4 had no immunization.4 weeks after vaccine was inoculated,the antibody in blood of tested chickens was determined when the egg production rate was stably over 80%.Then,the first three groups were challenged by virulent infectious bronchitis virus M41strain,and chicken laying performance and egg quality were recorded in the following 4 weeks.Then the relationship between HI antibody titers against infectious bronchitis virus strain and egg production performance was analyzed.【Result】 Chicken egg laying performance was not affected by virulent infectious bronchitis virus when their HI antibody titers against virulent infectious virus were 2-8.2-2-9.3.The first group which was only immunized by live attenuated vaccine had the HI titers of 2-4.8,and the egg production rate decreased by 12.69%.The HI tiers of control group were 2-2.0,and egg production rate decreased by 45.22%.【Conclusion】 HI antibody titers and egg production performance were positively related.HI antibody detection can be used to evaluate the immune efficacy of inactivated vaccines with infectious bronchitis virus.

IBV;HI antibody titer;challenge;egg production

2013-09-20

河南省科技創(chuàng)新人才計劃項目(144100510009)；鄭州市前沿技術(shù)研究開發(fā)項目(141PQYJS566)

李新生(1969-)，男，河南滎陽人，副教授，博士，碩士生導師，主要從事分子病原學研究。 E-mail：harmony69@126.com

崔保安(1948-)，男，河南滎陽人，教授，學士，博士生導師，主要從事分子病原學研究。E-mail：baoancui@gmail.com

時間:2014-12-12 09:30

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.01.029

S852.4

A

1671-9387(2015)01-0026-05

網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20141212.0930.029.html