羅 瑩，周冠宇，馮士彬，王希春，吳金節(jié)

(安徽農(nóng)業(yè)大學 動物科技學院，安徽 合肥 230036)

中藥提取物對奶牛乳腺上皮細胞增殖及總蛋白含量的影響

羅 瑩，周冠宇，馮士彬，王希春，吳金節(jié)

(安徽農(nóng)業(yè)大學 動物科技學院，安徽 合肥 230036)

【目的】 研究中藥復方灌注液及其中的單味中藥提取物對原代培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細胞增殖及總蛋白含量的影響?！痉椒ā?采用原代組織塊貼壁法獲得奶牛乳腺上皮細胞，以質量濃度為5，10，15和20 mg/mL的中藥復方灌注液以及紫花地丁、黃芪、澤蘭、雞血藤、訶子提取物，分別作用于對數(shù)生長期的奶牛乳腺上皮細胞，確定最適宜中藥質量濃度，采用該質量濃度提取物處理對數(shù)生長期的乳腺上皮細胞，并分別在處理的1，3和5 d時取樣，采用四甲基偶氮唑鹽法(MTT法)檢測細胞活性，并測定細胞分泌的總蛋白含量?！窘Y果】 通過組織塊貼壁與胰蛋白酶消化法相結合，得到較純化的奶牛乳腺上皮細胞。澤蘭、雞血藤、復方灌注液在質量濃度為10 mg/mL時能極顯著促進奶牛乳腺上皮細胞增殖(P<0.01)，澤蘭、雞血藤、訶子、復方灌注液在質量濃度為15 mg/mL時能極顯著提高奶牛乳腺上皮細胞總蛋白的含量(P<0.01)。【結論】 適宜質量濃度的中藥作用于奶牛乳腺上皮細胞，可以促進細胞的生長及其總蛋白的分泌。

奶牛乳腺上皮細胞；細胞增殖；中藥提取物；總蛋白

體外培養(yǎng)奶牛乳腺上皮細胞開始于1957年，在此后的幾十年間，國內外學者對其進行了廣泛而深入的研究。2002年，Barash等[1]建立了體外培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細胞系L-1和H-7，并指出L-1細胞能形成乳腺管狀結構，而H-7細胞則可形成球狀結構。2006年，崔立莉[2]從泌乳中后期健康的荷斯坦奶牛的乳汁中也得到了乳腺上皮細胞，并探討了亞油酸和維生素A對乳腺上皮細胞的影響。體外培養(yǎng)乳腺上皮細胞對研究正常乳腺發(fā)育以及體外各種因素對乳腺發(fā)育的影響具有重要意義。

中藥是純天然物質，含有生物堿、萜類、黃酮、皂苷等多種生物活性成分，兼有藥物與營養(yǎng)雙重功能，且資源豐富，價格低廉，具有廣闊的應用前景，日益為國內外專家所關注。目前，有關采用中藥制劑治療奶牛乳房炎的報道較多。王飛等[3]使用“消炎增乳散”對奶牛隱性乳房炎進行治療，發(fā)現(xiàn)其治愈率高達72.2%；周學輝[4]應用“速效乳炎散”治療奶牛乳腺炎，也起到了相當好的療效。本實驗室研制了治療奶牛乳房炎的中藥復方灌注液，取得了較好的臨床效果[5-6]。為進一步探明該中藥復方灌注液治療乳房炎的機制，本試驗以奶牛乳腺上皮細胞為研究對象，將中藥復方灌注液及其單味中藥提取液直接作用于細胞，觀察其對乳腺上皮細胞增殖和總蛋白分泌的影響，現(xiàn)將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 樣本與中藥 奶牛乳腺組織取自安徽省合肥市屠宰場屠宰后的健康經(jīng)產(chǎn)荷斯坦奶牛。中藥紫花地丁、黃芪、澤蘭、雞血藤、訶子，均購自安徽亳州濟人藥業(yè)。治療奶牛乳房炎的中藥復方灌注液(專利號：ZL 2010 1 0132974.7)，組分包括紫花地丁、黃芪、澤蘭、雞血藤、訶子、香附、青皮等。

1.1.2 主要試劑 DMEM-F12培養(yǎng)液、胎牛血清(FBS)和2.5 g/L胰蛋白酶(1×)溶液(Hyclone公司)，DPBS(Gibco公司)，磷酸鹽緩沖液(PBS)和二甲基亞砜(DMSO)(Solarbio公司)，四甲基偶氮唑鹽(MTT，Sigma公司)，總蛋白試劑盒(長春匯力生物技術有限公司)，瑞氏-吉姆薩染色試劑盒(南京建成生物技術有限公司)。

1.1.3 主要儀器 SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺(蘇州凈化設備有限公司)，BB15型CO2培養(yǎng)箱(Thermo公司)，XDS-1B型倒置顯微鏡(重慶光電儀器有限公司)，GF-D200型半自動生化分析儀(山東高密彩虹分析儀器有限公司)，Multiskan Mk3型酶標儀(Thermo 公司)。

1.2 奶牛乳腺上皮細胞的分離培養(yǎng)與鑒定

1.2.1 乳腺上皮細胞的分離培養(yǎng) 將奶牛乳腺組織用體積分數(shù)75%乙醇沖洗1遍后放入托盤中帶入實驗室內。用手術剪剪取1 cm3大小的組織塊，放入含10×雙抗的DPBS中清洗3次。將組織塊移入2 mL離心管中，加入0.5 mL FBS，用眼科剪將組織盡量剪碎。用1 mL微量移液器吸出剪碎的組織塊均勻平鋪在6 cm的培養(yǎng)皿中，吸去多余液體，將培養(yǎng)皿倒置在CO2培養(yǎng)箱中。12 h后，倒置顯微鏡下觀察組織塊已貼壁后，補加含體積分數(shù)10% FBS的DMEM-F12培養(yǎng)液。此后每隔2 d換液。第8 天觀察細胞已達到95%匯合，用1 mL的2.5 g/L胰蛋白酶37 ℃消化5 min，去除成纖維細胞，重復此步驟3次即可得到較為純化的奶牛乳腺上皮細胞。待純化的奶牛乳腺上皮細胞達到90%匯合時，用1 mL的2.5 g/L胰蛋白酶37 ℃消化10 min，倒置顯微鏡下觀察乳腺上皮細胞已經(jīng)基本消化下來后，加入3 mL含體積分數(shù)10% FBS的DMEM-F12培養(yǎng)液終止消化，離心去上清后，加入3 mL含體積分數(shù)10% FBS的DMEM-F12培養(yǎng)液重懸細胞，將細胞按體積比1∶3傳代。

1.2.2 乳腺上皮細胞的染色 棄去第4代第5 天的乳腺上皮細胞培養(yǎng)基，用DPBS清洗2遍，加入甲醇浸泡固定10 min，再按照瑞氏-吉姆薩染色試劑盒說明對細胞進行染色。

1.2.3 乳腺上皮細胞β-酪蛋白的SDS-PAGE電泳 收集第3代培養(yǎng)5 d的乳腺上皮細胞上清液，對乳腺上皮細胞特異分泌物β-酪蛋白進行SDS-PAGE電泳分析，以奶牛β-酪蛋白標準品為陽性對照。

1.3 中藥提取物對乳腺上皮細胞增殖及總蛋白含量的影響

1.3.1 中藥提取物的制備 中藥提取物的制備均采用溶劑萃取法，在超聲波萃取機中進行。其中紫花地丁、黃芪、澤蘭、雞血藤、訶子用乙醇提取，復方灌注液用純水提取。提取液用旋轉蒸發(fā)儀濃縮，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后加入到細胞培養(yǎng)液中。

1.3.2 奶牛乳腺上皮細胞活力的測定 分別收集用質量濃度為5，10，15，20 mg/mL(以生藥計)的中藥提取物處理1 d的第5代第3天奶牛乳腺上皮細胞，以及用質量濃度為10 mg/mL的中藥提取物處理1，3和5 d的第5代奶牛乳腺上皮細胞，采用MTT法測定奶牛乳腺上皮細胞活力。對照組奶牛均不添加中藥。具體測定方法如下：將奶牛乳腺上皮細胞在37 ℃、體積分數(shù)5% CO2條件下培養(yǎng)1 d后，每孔加入MTT(5 mg/mL PBS配制)20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，終止培養(yǎng)。小心棄去培養(yǎng)液，每孔加入150 μL DMSO，振蕩10 min，選擇492 nm波長，在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各孔吸光值。

1.3.3 乳腺上皮細胞總蛋白含量的測定 分別收集用質量濃度為5，10，15，20 mg/mL的中藥提取物處理的第5代第3天奶牛乳腺上皮細胞的培養(yǎng)液，以及用質量濃度為15 mg/mL的中藥提取物處理1，3和5 d后的第5代奶牛乳腺上皮細胞的培養(yǎng)液，檢測總蛋白含量。對照組奶牛均不添加中藥。具體操作步驟按照總蛋白試劑盒說明書進行。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗數(shù)據(jù)用SPSS 17.0軟件ANOVA方法處理，LSD顯著性檢驗。P<0.05代表差異顯著，P<0.01代表差異極顯著。采用GraphPad Prism 5軟件進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 奶牛乳腺上皮細胞的形態(tài)學觀察與鑒定

奶牛乳腺組織塊貼壁后，到第7 天時細胞慢慢從組織塊中爬出(圖1-A)，匯合度已經(jīng)有50%～60%；純化后的第3代奶牛乳腺上皮細胞培養(yǎng)5 d時，細胞呈鋪路石狀貼壁生長，狀態(tài)良好(圖1-B)。

瑞氏-吉姆薩染色結果(圖2)顯示，奶牛乳腺上皮細胞形態(tài)以圓形為主，胞體肥大，胞漿豐滿。細胞質疏松，著色較淺。細胞核較大，呈藍紫色，多為卵圓形，核仁明顯(圖2-A)。培養(yǎng)至第4代乳腺上皮細胞仍然保持了細胞單層貼壁生長的特性，大多數(shù)細胞有2～4個核仁(圖2-B)。

由圖3可見，奶牛β-酪蛋白標準品的分子質量在26～33 ku，而奶牛乳腺上皮細胞培養(yǎng)液在同樣的位置也出現(xiàn)條帶，證明奶牛乳腺上皮細胞培養(yǎng)的過程中能夠產(chǎn)生β-酪蛋白。

圖3 第3代奶牛乳腺上皮細胞β-酪蛋白的SDS-PAGE檢測結果
A.分子質量14.4～94.0 ku的Marker；B.β-酪蛋白標準品；C.乳腺上皮細胞培養(yǎng)液
Fig.3 SDS-PAGE of bovine mammary epithelial cells’ β-CN
A.14.4-94.0 ku Marker;B.β-CN standard;C.Medium of mammary epithelial cells

2.2 中藥提取物對奶牛乳腺上皮細胞增殖的影響

不同質量濃度中藥提取物對第5代奶牛乳腺上皮細胞增殖的影響見表1。由表1可見，采用不同質量濃度中藥提取物作用奶牛乳腺上皮細胞1 d后，與對照組相比，紫花地丁、黃芪、澤蘭、雞血藤和復方灌注液對細胞增殖的促進作用不明顯(P>0.05)，而訶子在質量濃度為10，15和20 mg/mL時均能極顯著促進細胞增殖(P<0.01)，但由于標準差大，測定結果不可靠。紫花地丁、黃芪、澤蘭、雞血藤和復方灌注液在質量濃度為10 mg/mL時OD492 nm值較大，所以選用質量濃度為10 mg/mL的紫花地丁、黃芪、澤蘭、雞血藤和復方灌注液處理奶牛乳腺上皮細胞，研究不同中藥處理細胞1,3,5 d后對細胞增殖的影響，結果見圖4。

注：表中數(shù)據(jù)為OD492 nm值；數(shù)據(jù)后標注“*”表示與對照組相比差異顯著(P<0.05)，標注“**”表示與對照組相比差異極顯著(P<0.01)。 下表同。

Note:Data in the table represent OD492 nmvalue;“*” represents significant difference atP<0.05 compared with the control group;“**” represents extremely significant difference atP<0.01 compared with the control group.The same below.

由圖4可見，與對照組相比，10 mg/mL的紫花地丁、黃芪、澤蘭、雞血藤提取物和復方灌注液處理奶牛乳腺上皮細胞后，紫花地丁和黃芪對奶牛乳腺上皮細胞增殖作用不明顯(P>0.05)；澤蘭和雞血藤從第3 天開始能極顯著促進細胞增殖(P<0.01)，而中藥復方灌注液在第5天時能極顯著促進細胞增殖(P<0.01)。

2.3 中藥提取物對奶牛乳腺上皮細胞總蛋白含量的影響

由表2可見，不同中藥提取物作用乳腺上皮細胞1 d后，與對照組相比，各質量濃度紫花地丁提取物對奶牛乳腺上皮細胞分泌總蛋白無顯著影響(P>0.05)；不同質量濃度的澤蘭、雞血藤、訶子提取物和復方灌注液極顯著促進細胞總蛋白分泌(P<0.01)；黃芪提取物極顯著抑制細胞總蛋白分泌(P<0.01)。在質量濃度為15 mg/mL時，各中藥組奶牛乳腺上皮細胞總蛋白含量最高，所以選用質量濃度為15 mg/mL的紫花地丁、澤蘭、雞血藤、訶子提取物和復方灌注液處理奶牛乳腺上皮細胞，研究不同中藥在處理細胞1，3，5 d對總蛋白含量的促進作用，結果見圖5。

由圖5可見，15 mg/mL的紫花地丁、澤蘭、雞血藤、訶子提取物和復方灌注液處理奶牛乳腺上皮細胞后，與對照組相比，紫花地丁提取物對奶牛乳腺上皮細胞總蛋白含量無顯著影響(P>0.05)；澤蘭、雞血藤提取物和復方灌注液在第1天時對奶牛乳腺上皮細胞總蛋白含量有極顯著影響(P<0.01)，且隨時間增加總蛋白含量增加，差異極顯著(P<0.01)。與對照組相比，訶子提取物在第1天時極顯著促進奶牛乳腺上皮細胞分泌總蛋白(P<0.01)；第3天總蛋白含量與第1 天相比極顯著下降(P<0.01)；第5天總蛋白含量同第3天相比極顯著增加(P<0.01)。

圖5 中藥提取物處理第5代奶牛乳腺上皮細胞總蛋白含量的比較
Fig.5 Comparison of total protein contents of the 5thgeneration bovine mammary epithelial cells after treatment with Chinese herbal extracts

3 討 論

早在1991年，Hansen等[7]證明，山羊乳腺上皮細胞在體外培養(yǎng)的情況下需要胰島素、氫化可的松和催乳素的刺激才能分泌β-酪蛋白。本試驗通過組織塊貼壁法獲得純化的奶牛乳腺上皮細胞，并采用瑞氏-吉姆薩染色和β-酪蛋白SDS-PAGE法進行鑒定[8-9]，證明所獲得細胞為生理機能正常的奶牛乳腺上皮細胞。但筆者在細胞培養(yǎng)過程中并沒有使用Hansen提出的胰島素、氫化可的松和催乳素。

奶牛乳房炎在中獸醫(yī)中屬于奶腫、奶黃、乳癰，該疾病的發(fā)生與胃熱壅滯和肝氣郁結[10]有關，治療奶牛乳房炎應以活血化瘀、清熱解毒、消腫散結、痛經(jīng)下乳為原則[11]。目前，治療奶牛乳房炎的手段很多，最常用的是化學藥物治療，但是長期使用化學藥物容易產(chǎn)生細菌耐藥性以及藥物殘留、污染環(huán)境等問題。近幾年，使用中藥治療奶牛乳房炎取得了很多成功經(jīng)驗。董祿[12]使用中草藥制劑“瓜蔞散加減”來治療奶牛乳房炎，療效比較滿意。本實驗室根據(jù)“辯證施治”的原則，研制的治療奶牛乳房炎中藥復方灌注液臨床使用效果顯著[5-6]。該中藥復方灌注液組方中紫花地丁為主藥，具有清熱解毒、抗菌消炎、涼血消腫、益氣活血、散瘀止痛的作用；雞血藤、黃芪、澤蘭共為輔藥，具有補氣、補血、通經(jīng)活絡、托毒排膿的功能；訶子為使藥，具有養(yǎng)氣養(yǎng)血、清熱解毒、調和諸藥的作用。李定剛[13]的研究表明，紫花地丁中的有效成分七葉內酯、東莨菪內酯、茵陳素對奶牛乳房炎中主要致病菌鏈球菌、大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌等均有很好的抑菌效果，其中七葉內酯的抑菌效果最好；丁月云[14]指出，20 mg/mL的黃芪可以促進乳腺上皮細胞增殖。本試驗結果顯示，澤蘭、雞血藤、復方灌注液在質量濃度為10 mg/mL 時可極顯著促進奶牛乳腺上皮細胞增殖(P<0.01)，澤蘭、雞血藤、訶子、復方灌注液在質量濃度為15 mg/mL時可極顯著提高乳腺上皮細胞總蛋白的含量(P<0.01)，而紫花地丁對奶牛乳腺上皮細胞的增殖和蛋白分泌無顯著作用。訶子對于細胞分泌總蛋白具有顯著的促進作用，但訶子中的某些成分與DMSO發(fā)生反應產(chǎn)生的黑色物質不利于細胞吸光度的測定，故無法判斷訶子是否能夠促進細胞增殖。

[1] Barash,Itamar German,Tania.Characterization of an epithelial cell line from bovine mammary gland [J].In vitro Cellular & Developmental Biology-Animal,2002,38(5):282-292.

[2] 崔立莉．奶牛乳腺上皮細胞體外培養(yǎng)體系的建立及其應用 [D].烏魯木齊：新疆農(nóng)業(yè)大學，2006.

Cui L L.Establishment and application of theinvitroculture system of bovine mammary epithelial cells (BMEC) [D].Urumqi:Xinjiang Agricultural University,2006.(in Chinese)

[3] 王 飛，金光明，葛建偉.中草藥對奶牛隱性乳房炎的治療效果觀察 [J].安徽技術師范學院學報，2005，19(2)：8-10.

Wang F,Jin G M,Ge J W.Observation on effect of Chinese herbal medicine on mastitis of cows [J].Journal of Anhui Agrotechnical Teachers College,2005,19(2):8-10.(in Chinese)

[4] 周學輝.純中藥劑“速效乳炎散”對奶牛乳腺炎療效的研究 [J].奶牛養(yǎng)殖，2006(6)：26-27.

Zhou X H.Study the efficacy of new preparations “Suxiao Ruyansan” to dairy cow mastitis [J].Dairy Cow Husbandry,2006(6)：26-27.(in Chinese)

[5] 孟慶娟，馮士彬，李志明，等.中草藥及其復方提取物對奶牛乳房炎致病菌的體外抑菌效果 [J].江蘇農(nóng)業(yè)科學，2011，39(4)：257-259.

Meng Q J,Feng S B,Li Z M,et al.The antibacterial effect of Chinese herbs extracts and their compound to the mastitis pathogensinvitro[J].Jiangsu Agricultural Sciences,2011,39(4):257-259.(in Chinese)

[6] 孟慶娟，馮士彬，李志明，等.中藥復方灌注劑治療奶牛乳房炎的藥效與應用安全性研究 [J].湖北農(nóng)業(yè)科學，2011，50(9)：1846-1850.

Meng Q J,Feng S B,Li Z M,et al.The efficacy and safety of Chinese medicinal herbs compound filler for cattle with mastitis [J].Hubei Agricultural Sciences,2011,50(9):1846-1850.(in Chinese)

[7] Hansen H,Knudsen.Lactation goat mammary gland cells in cu-lture [J].J Comp Biochem Physiol,1991,99:129-135.

[8] 王希春，周 凡，馮士彬，等.中草藥提取物對小鼠乳腺上皮細胞增殖的影響 [J].西北農(nóng)林科技大學學報：自然科學版，2011，39(7)：16-20.

Wang X C,Zhou F,Feng S B,et al.The effects of herbal extracts of mouse mammary epithelial cell proliferation [J].Journal of Northwest A&F University:Natural Science Edition,2011,39(7):16-20.(in Chinese)

[9] 劉 瑋，董雅娟，王文明，等.奶牛乳腺上皮細胞的分離培養(yǎng)及分子生物學鑒定 [J].安徽農(nóng)業(yè)科學，2010，38(6)：2877-2879.

Liu W,Dong Y J,Wang W M,et al.Mammary epithelial cell culture and molecular identification [J].Journal of Anhui Agricultural Sciences,2010,38(6):2877-2879.(in Chinese)

[10] 王 新，張秀英.中藥治療奶牛乳房炎的研究現(xiàn)狀與展望 [J].中國獸藥雜志，2004，38(2)：43-46.

Wang X,Zhang X Y.The research and prospect of the Chinese medicine’s treatment to mastitis in dairy cows [J].Chinese Journal of Veterinary Drug,2004,38(2):43-46.(in Chinese)

[11] 周新民，周廣生，王子軾，等.中藥“乳炎靈”注射液對奶牛隱形乳房炎的治療試驗 [J].中獸醫(yī)醫(yī)藥雜志，2003(6)：38-40.

Zhou X M,Zhou G S,Wang Z S,et al.The test of the treatment of the injection “Ruyanling” to cow mastitis [J].Journal of Traditional Chinese Veterinary Medicine,2003(6):38-40.(in Chinese)

[12] 董 祿.瓜蔞散加減治療牛乳房炎 [J].中獸醫(yī)醫(yī)藥雜志，2007(2)：53-55.

Dong L.Gualou powder for treating bovine mastitis [J].Journal of Traditional Chinese Veterinary Medicine,2007(2)：53-55.(in Chinese)

[13] 李定剛.紫花地丁對奶牛乳房炎病原菌的抗菌活性成分研究 [D].陜西楊凌：西北農(nóng)林科技大學，2006.

Li D G.Antibacterial constituents to pathogenic bacteria of cow mastitis fromViolayedoensisMakino [D].Yangling,Shaanxi:Northwest A&F University,2006.(in Chinese)

[14] 丁月云.王不留行、黃芪對奶牛乳腺上皮細胞體外增殖與分泌功能影響的研究 [D].南京：南京農(nóng)業(yè)大學，2008.

Ding Y Y.Study on the effects of extracts ofSemanvaccaria,Astragalusmembranaceuson the proliferation results and secretion function of cow mammary epithelial cells culturedinvitro[D].Nanjing:Nanjing Agricultural University,2008.(in Chinese)

Effects of Chinese herbal extracts on proliferation and total protein content of cow mammary gland epithelial cells

LUO Ying,ZHOU Guan-yu,FENG Shi-bin,WANG Xi-chun,WU Jin-jie

(CollegeofAnimalScienceandTechnology,AnhuiAgriculturalUniversity,Hefei,Anhui230036,China)

【Objective】 The purpose of this experiment was to study the effects of Chinese herbal compound perfusion and the single herbal extracts on proliferation and total protein content of cow mammary gland epithelial cells.【Method】 Purified cow mammary gland epithelial cells were obtained by using the original organization block adherent method,and the Chinese herbal compound perfusion and extracts of major constituents(Herbviolae,Radixastragali,Herbalycopi,Herbapaederiae,andFructuschebulae) were prepared.Different levels (5,10,15 and 20 mg/mL) of compound perfusion and extracts were used to treat mammary gland epithelial cells of cows at exponential growth stage.The optimum effective concentration of compound perfusion was determined and was used to treat cow mammary gland epithelial cells.Then,the cell activities were measured by MTT method and TP values were detected at 1,3 and 5 d.【Result】 Purified cow mammary epithelial cells were obtained by the original organization block adherent method and trypsin digestion method.After treatment with different Chinese herbal extracts for 6 days,the cell proliferation was significantly promoted by extracts ofHerbalycopiandHerbapaederiaeas well as compound perfusion at 10 mg/mL level (P<0.01).Total protein content of cow mammary gland epithelial cells was significantly enhanced by extracts ofHerbalycopi,HerbapaederiaeandFructuschebulaeas well as compound perfusion at 15 mg/mL level (P<0.01).【Conclusion】 Chinese herbal perfusion and extracts at suitable concentrations could promote the growth and protein secretion of cow mammary gland epithelial cells.

cow mammary gland epithelial cells;proliferation;Chinese herbal extract;total protein (TP)

2013-09-22

國家農(nóng)業(yè)科技成果轉化資金項目(2011GB2C300020)

羅 瑩(1990-)，女，安徽滁州人，在讀碩士，主要從事奶牛乳腺細胞培養(yǎng)以及中藥研究。 E-mail:lyzferik@hotmail.com

吳金節(jié)(1962-)，男，安徽望江人，教授，主要從事動物診療技術及營養(yǎng)代謝病研究。E-mail:wjj@ahau.edu.cn

時間:2014-12-12 09:30

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.01.027

S853.7

A

1671-9387(2015)01-0014-07

網(wǎng)絡出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20141212.0930.027.html