劉振，趙洋，楊培迪，成楊，寧靜，楊陽

DNA分子標(biāo)記檢測方法及在茶樹中的研究進(jìn)展

劉振，趙洋，楊培迪，成楊，寧靜，楊陽*

（湖南省茶葉研究所，湖南 長沙 410125）

DNA分子標(biāo)記檢測方法是分子標(biāo)記研究中的一項重要技術(shù)，直接關(guān)系到分子標(biāo)記研究的效率、準(zhǔn)確性和成本等。本文概述了現(xiàn)有DNA分子標(biāo)記檢測方法的種類及技術(shù)原理、特點和應(yīng)用情況，綜述了DNA分子標(biāo)記檢測方法在茶樹中的應(yīng)用并探討了其發(fā)展前景，為茶樹DNA分子標(biāo)記檢測方法的研究提供參考。

DNA分子標(biāo)記；檢測方法；茶樹；綜述

DNA分子標(biāo)記檢測方法是將不同分子標(biāo)記的差異片段通過電泳等技術(shù)檢測出來的方法，它是分子標(biāo)記研究中的一項重要技術(shù)。分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展促進(jìn)了分子標(biāo)記檢測方法的不斷完善?，F(xiàn)有的分子標(biāo)記檢測方法根據(jù)原理不同分為瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳、毛細(xì)管電泳、高分辨率熔解曲線分析、微流控芯片電泳等。茶樹[Camellia sinensis (L.) O.Kuntze]是一種山茶科山茶屬茶組（Sect. Thea (L.) Dyer in Hook.）的多年生經(jīng)濟(jì)作物。目前應(yīng)用于茶樹研究的分子標(biāo)記有RFLP、RAPD、AFLP、ISSR、SSR、SRAP、SNP等，主要是進(jìn)行茶樹種質(zhì)資源和遺傳育種中的遺傳多樣性、親緣關(guān)系分析、起源與演化、種質(zhì)鑒定、遺傳圖譜構(gòu)建、性狀連鎖標(biāo)記篩選等方面的研究[1-3]。本文綜述了不同分子標(biāo)記檢測方法的原理、特點及其應(yīng)用，綜述了分子標(biāo)記檢測方法在茶樹中的研究現(xiàn)狀，探討了其發(fā)展前景，進(jìn)而為茶樹分子標(biāo)記檢測方法研究提供參考。

1 DNA分子標(biāo)記檢測方法種類

1.1 瓊脂糖凝膠電泳

瓊脂糖凝膠電泳（Agrose gel electrophoresis，AGE）是以瓊脂糖凝膠為支持物的電泳方法，因其具有操作簡單、經(jīng)濟(jì)、便捷等特點，是目前常用的擴(kuò)增產(chǎn)物分析檢測技術(shù)。但是瓊脂糖凝膠電泳的最大缺陷是檢測的靈敏度和分辨率較低，有效分離范圍是0.2～2 kb，即使采用3%的瓊脂糖凝膠，估計的片段大小也有8bp的誤差[4]，很難區(qū)分差異較小的片段。同時，傳統(tǒng)的染料溴化乙錠（EB）具有強致癌性，長期接觸對實驗人員身體有害。目前已開發(fā)了如SYBR Gold，SYBR Green I，GoldViewnaII，Gelview，GelGreen，GelRed等安全且靈敏的EB替代品，EB替代品不斷更新，促進(jìn)了瓊脂糖凝膠電泳在分子標(biāo)記研究中的應(yīng)用。由于瓊脂糖凝膠電泳的低靈敏度和分辨率，其主要用于RFLP、RAPD、AFLP、ISSR等差異片段間差異較大的分子標(biāo)記方法[5]。

1.2 聚丙烯酰胺凝膠電泳

聚丙烯酰胺凝膠電泳（Polyacrylamidc gel electrophoresis，PAGE）是由丙烯酰胺單體和少量交聯(lián)劑甲叉雙丙烯酰胺通過化學(xué)催化劑過硫酸銨（AP）和四甲基乙二胺（TEMED）催化聚合作用形成的三維空間的高聚物。聚丙烯酰胺凝膠電泳作為分子標(biāo)記研究中應(yīng)用范圍最廣的一種檢測方法，其具有以下優(yōu)點：（1）分辨率較高。聚丙烯酰胺凝膠電泳比瓊脂糖凝膠電泳的顯著優(yōu)點是更高的分辨率，可有效區(qū)分1～500 bp的核苷酸片段；（2）成本低。聚丙烯酰胺凝膠電泳所用的試劑價格低，所配套的儀器已完全實現(xiàn)了國產(chǎn)化，可以滿足普通實驗室的承受能力。但是聚丙烯酰胺凝膠電泳也有其自身缺陷：（1）檢測耗時耗力。通常在10%的凝膠電泳下所需的檢測時間大于2 h，同時加上銀染、顯色的時間，一批電泳要耗時3 h以上，而瓊脂糖凝膠電泳則只需1 h；（2）分析樣本量有限。以SSR標(biāo)記為例，一般的電泳槽最大樣本量為100左右；（3）操作復(fù)雜。該實驗包括洗板、配膠、做膠、上樣、染色、顯色、拍照等一系列手工操作步驟，操作程序復(fù)雜，對操作人員的經(jīng)驗和熟練程度要求較高；（4）不同批次數(shù)據(jù)整合困難。由于聚丙烯酰胺凝膠電泳的片段大小是依據(jù)Marker估計出的片度大小，如何準(zhǔn)確地整合不同批次品種DNA的標(biāo)記數(shù)據(jù)一直是個難題[6,7]；（5）實驗安全風(fēng)險大。丙烯酰胺是一種神經(jīng)毒劑，長期接觸可對人體健康造成危害。聚丙烯酰胺凝膠電泳雖有較多的缺點，但是作為一種分辨率高、成本低的分子標(biāo)記方法，已廣泛的應(yīng)用于包括RFLP、RAPD、AFLP、ISSR、SSR、SRAP等目前主要的分子標(biāo)記研究中。

1.3 毛細(xì)管電泳

毛細(xì)管電泳（Capillary elcctrophorcsis，CE）是一種近年發(fā)展起來的新型電泳技術(shù)，屬于電泳與色譜技術(shù)的交叉應(yīng)用[6]。它以毛細(xì)管為通道，在高壓直流電壓作用下促進(jìn)物質(zhì)在毛細(xì)管內(nèi)遷移并分離。與傳統(tǒng)的凝膠電泳檢測不同，毛細(xì)管電泳熒光檢測以峰的形式表現(xiàn)，而不是以譜帶的形式表現(xiàn)。毛細(xì)管電泳用于擴(kuò)增片段檢測分析時，須用FAM（6-carboxy-fluorescein）、TEX（tetmehlom-6-earboxy-fluoreseein）和HEX（hexachloro-6-earboxy—fluoreseein）等不同顏色的熒光染料標(biāo)記引物，利用DNA測序儀對不同熒光標(biāo)記、擴(kuò)增片段范圍不同的PCR產(chǎn)物進(jìn)行SSR熒光標(biāo)記的全自動分析，利用電腦軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和分析，精確計算出擴(kuò)增片段的大小，實現(xiàn)了分子標(biāo)記與毛細(xì)管電泳技術(shù)的結(jié)合[8]。

毛細(xì)管電泳的主要優(yōu)點是：（1）能夠準(zhǔn)確讀出擴(kuò)增等位基因的大小，便于多批次的數(shù)據(jù)采集和分析；（2）高通量檢測。聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測方法在利用一套電泳設(shè)備情況下，每人每天最多可檢測200個樣品?；贏BI 3130 XLDNA測序儀，在一種熒光標(biāo)記毛細(xì)管電泳的情況下，每次可同時檢測16個樣品，耗時約0.5 h，每人每天可檢測768個擴(kuò)增產(chǎn)物。若同時采用4種熒光標(biāo)記進(jìn)行毛細(xì)管電泳，則每人每天可檢測3072個擴(kuò)增產(chǎn)物。由此可見，熒光標(biāo)記毛細(xì)管電泳檢測效率要遠(yuǎn)高于常規(guī)的聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測技術(shù)，在樣品數(shù)量較大時，優(yōu)勢更明顯[7]；（3）利用與遺傳分析系統(tǒng)相匹配的計算機軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)一處理，操作簡便，實現(xiàn)了分子標(biāo)記研究的高效與自動化。毛細(xì)管電泳雖優(yōu)勢明顯，但也有其缺點：（1）成本高。DNA測序儀價格昂貴，并不是一般實驗室都有能力配備。同時，熒光標(biāo)記引物的合成費用相對較高，而且保存時間只有1年，而一般引物可保存3年左右。（2）異常峰。電泳檢測結(jié)果中偶爾會出現(xiàn)異常峰，在一定程度上降低了數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和可靠性[8,9]；毛細(xì)管電泳作為一種新型電泳技術(shù)，因具有高效、自動化等優(yōu)點，已在煙草、水稻、豌豆、大麥、油菜等植物的遺傳研究中有了廣泛的應(yīng)用[10-12]，其中最多的是同SSR分子標(biāo)記結(jié)合，開展不同作物毛細(xì)管電泳技術(shù)的優(yōu)化與品種的鑒定等研究[13,14]。

1.4 高分辨率熔解曲線分析

高分辨率熔解曲線分析（High resolution melting curve analysis，HRM）是在飽和熒光染料和高精度熒光定量PCR儀基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一項新型基因分型技術(shù)。HRM的主要原理是利用特定的熒光染料可插入DNA雙鏈中，在雙鏈升溫的過程中DNA雙鏈解鏈熔解、熒光減弱，在變?yōu)閱捂湑r較為急劇，不同DNA序列的長度，GC含量以及堿基互補性差異，從而形成不同熔解曲線，進(jìn)而直觀反映了目標(biāo)DNA序列的變異[15]。對于非飽和熒光染料，在DNA雙鏈熔解過程中，釋放出的熒光染料可再次摻入未解鏈的DNA雙鏈，使得熒光變化不能精確反映DNA序列的變異[16]。相反，飽和熒光染料可飽和的摻入DNA雙鏈中，熔解過程中釋放的熒光染料不會繼續(xù)與DNA雙鏈結(jié)合，所以熒光變化能夠直觀準(zhǔn)確的反映DNA片段特征[17]。

HRM的技術(shù)優(yōu)勢主要表現(xiàn)在以下方面：（1）分辨率高?？梢詸z測出一個堿基的差異。趙均良等[18]通過PAGE與HRM技術(shù)對水稻分子標(biāo)記基因型分析結(jié)果表明，對于PAGE不能分辨的標(biāo)記，HRM能清晰分辨。毛細(xì)管電泳技術(shù)與高分辨率熔解曲線分析的檢測效率研究結(jié)果表明，高分辨率熔解曲線分析具有較高的核苷酸多態(tài)性檢測能力，在同一物種的不同品種間的檢測結(jié)果更加準(zhǔn)確，效率更高[19]；（2）高通量。1次可同時檢測10～384個樣本；（3）高效省力。所有的實驗操作可在2 h內(nèi)完成，且結(jié)果可由機器直接輸出，方便、清晰；（4）準(zhǔn)確性高。HRM是通過機器直接讀數(shù)，避免了瓊脂糖凝膠電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳對于一些“模糊”條帶的判讀受人為因素影響；（5）成本低。不需設(shè)計探針和進(jìn)行引物標(biāo)記，大大節(jié)約了引物開發(fā)成本。

高分辨率熔解曲線分析作為一種新型基因分型技術(shù)，在植物中的應(yīng)用才剛剛起步，主要在種質(zhì)鑒定、SNP標(biāo)記開發(fā)、遺傳圖譜構(gòu)建、突變掃描、基因分型等研究領(lǐng)域[19]。Mader等[20]首次成功的將高分辨率熔解曲線分析技術(shù)應(yīng)用于牛至屬的種質(zhì)資源鑒定中，結(jié)果表明，該方法可有效的進(jìn)行種質(zhì)資源鑒別。朱巖芳[5]利用SSR高分辨率熔解曲線分析方法對Y兩優(yōu)689、株兩優(yōu)06、錢優(yōu)l號和他們的兩個親本進(jìn)行了鑒別，結(jié)果表明3個雜交品種與兩親本呈現(xiàn)完全不同的熔解曲線，高分辨率熔解曲線分析技術(shù)可有效的進(jìn)行水稻品種的鑒別。蘭青闊等[21]通過HRM分析和焦磷酸測序確認(rèn)，獲得3個SNP位點，并對市售的12個雜交黃瓜種進(jìn)行分型鑒定，結(jié)果表明，3個SNP位點適用于其中11個市售品種的純度鑒定。目前利用高分辨率熔解曲線分析進(jìn)行遺傳圖譜構(gòu)建和基因定位的植物包括白羽扇豆、二棱大麥、蘋果和黑麥草等[22]。隨著HRM技術(shù)的不斷完善，高分辨率熔解曲線分析技術(shù)將會成為植物分子標(biāo)記研究領(lǐng)域的熱點[23,24]。

1.5 微流控芯片電泳

微流控芯片電泳（Microchip electrophoresis，ME）是一種采用微細(xì)加工技術(shù)，在幾平方厘米的芯片上，制作電泳微流通道結(jié)構(gòu)及其它功能單元，以實現(xiàn)集微量樣品分離、檢測于一體的微型實驗室技術(shù)[25]。該技術(shù)產(chǎn)生于20世紀(jì)90年代，由Manz等最先提出“微全分析系統(tǒng)”的概念。與聚丙烯酰胺凝膠電泳相比，微流控芯片電泳可以僅消耗pL級樣品，在數(shù)分鐘甚至更短時間內(nèi)完成上百個樣品的分析，并且可以在線進(jìn)行樣品的預(yù)處理和全過程分析，此外，ME具有比熒光檢測更高的靈敏度，結(jié)果更加精確。但是，微芯片電泳所需的成本高，首先微芯片電泳儀的價格昂貴；其次，實驗所用的各種試劑盒價格也比較高，這些因素制約了微芯片電泳技術(shù)的普遍應(yīng)用。

劉金華等[26]采用微流控芯片分析儀結(jié)合t檢驗進(jìn)行分析，成功地鑒定了黃山松DNA多態(tài)性片段中的3個等位基因，認(rèn)為該方法與一般的凝膠電泳技術(shù)比較，具有效率高、速度快、靈敏度好和樣品用量少等優(yōu)點，并且可同時完成定性定量分析，使獲得的信息量和準(zhǔn)確性有了較大提高。張莎莎等[27]采用微芯片電泳技術(shù)和聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)對玉米自交系8112等SSR分子標(biāo)記的PCR擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行了比較，結(jié)果表明，微芯片電泳具有無毒性、操作簡單、靈敏度和準(zhǔn)確性高，重復(fù)性好等優(yōu)點。目前微流控芯片電泳技術(shù)還處于不斷的改進(jìn)階段，隨著進(jìn)樣、分離和檢測等系統(tǒng)的完善，微流控芯片電泳技術(shù)將在今后科研工作中擁有更加廣闊的前景。

1.6 其他

伴隨著SNP等第三代分子標(biāo)記技術(shù)的興起，與之相適應(yīng)的檢測技術(shù)也在近幾年得到了快速的發(fā)展，目前進(jìn)行SNP檢測的方法主要有異源雙鏈技術(shù)、變性的高效液相色譜法、變性梯度凝膠電泳、焦磷酸序列分析等[28]。但是，這些方法各有其優(yōu)缺點，在實際應(yīng)用中，可根據(jù)試驗?zāi)康暮途唧w需要，通過做預(yù)試驗進(jìn)行方法優(yōu)選，或?qū)⒉煌椒ńY(jié)合應(yīng)用，取長補短，進(jìn)而取得理想的研究結(jié)果。隨著計算機程序化分析的不斷發(fā)展，各種檢測技術(shù)的優(yōu)化組合及新技術(shù)應(yīng)運而生，可以預(yù)測，準(zhǔn)確、快速、經(jīng)濟(jì)和有效將是未來分子標(biāo)記檢測手段發(fā)展的必然。

2 分子標(biāo)記檢測方法在茶樹中的應(yīng)用及展望

2.1 應(yīng)用情況

瓊脂糖凝膠電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳是茶樹分子標(biāo)記研究中應(yīng)用最廣的檢測方法。瓊脂糖凝膠電泳由于分辨率低，對于檢測等位位點相差幾個堿基的特異標(biāo)記比較困難，因此主要應(yīng)用于茶樹RFLP、RAPD、ISSR等標(biāo)記的檢測。隨著AFLP、SSR、SCAR等特異分子標(biāo)記在茶樹中的應(yīng)用，分辨率更高的聚丙烯酰胺凝膠電泳也開始廣泛的應(yīng)用于茶樹分子標(biāo)記研究中，該方法的應(yīng)用極大的促進(jìn)了茶樹遺傳背景研究、指紋圖譜構(gòu)建、關(guān)聯(lián)標(biāo)記篩選和遺傳圖譜構(gòu)建等研究的開展[29]。聚丙烯酰胺凝膠電泳雖然相對瓊脂糖凝膠電泳的分辨率有了很大提高，但是這種技術(shù)不能準(zhǔn)確讀出片段大小，并且試驗周期長、操作復(fù)雜、樣本量有限。伴隨著熒光標(biāo)記、SNP標(biāo)記等新型標(biāo)記技術(shù)在茶樹中的應(yīng)用，聚丙烯酰胺凝膠電泳已不能滿足于相關(guān)試驗的需要。為了促進(jìn)熒光標(biāo)記方法在茶樹中的應(yīng)用，黃建安等[30]采用TP-M13-SSR技術(shù)對42個茶樹品種的16個SSR位點進(jìn)行遺傳分析的結(jié)果表明：此法具有簡便、可靠、低成本及高通量的優(yōu)點，且隨著所分析SSR位點數(shù)的增加，降低成本的效果更加顯著。同時，隨著第三代分子標(biāo)記SNP出現(xiàn)，為了促進(jìn)SNP在茶樹遺傳育種中的應(yīng)用，張成才等[31]使用SNaPshot技術(shù)對10個SNP在茶樹品種中進(jìn)行分型進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)6個SNP分型結(jié)果與測序結(jié)果一致，準(zhǔn)確率為60%，表明SNaPshot技術(shù)對茶樹SNP的分型準(zhǔn)確性高、重復(fù)性好，可用于茶樹遺傳多樣性分析以及茶樹遺傳圖譜構(gòu)建等方面的研究。

2.2 展望

每種檢測方法都有其優(yōu)缺點，因此不同研究可以根據(jù)自身試驗?zāi)康暮驮囼灄l件，在準(zhǔn)確、實用、經(jīng)濟(jì)和快速的基礎(chǔ)上，選擇理想的分子標(biāo)記檢測方法。茶樹種質(zhì)資源豐富，隨著茶樹分子標(biāo)記研究的深入，遺傳作圖、性狀關(guān)聯(lián)標(biāo)記篩選等將是茶樹分子標(biāo)記研究的熱點，而瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)等由于受分辨率低、操作復(fù)雜、有安全風(fēng)險等限制，不僅不能滿足于大規(guī)模樣本量分析，而且不能滿足SNP等第三代分子標(biāo)記的研究需要，因此為了促進(jìn)分子標(biāo)記技術(shù)在茶樹種質(zhì)資源和遺傳育種等方面的研究深入，茶樹毛細(xì)管電泳、高分辨率熔解曲線分析和微流控芯片電泳等新型分子標(biāo)記檢測體系的建立與完善將成為茶樹分子標(biāo)記研究的熱點。

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Method for Detecting DNA Molecular Markers and Their Application in Tea Plant (Camellia sinensis)

LIU Zhen，Zhao Yang，YANG Pei-di，CHENG Yang，NING Jing，YANG Yang*
（Hunan Tea Research Institute，Changsha，Hunan 410125，China）

Methods for detecting DNA molecular markers were an important technology in molecular marker studies, which directly related to the efficiency, accuracy, and the cost effectiveness of molecular marker studies. In this paper, the existing detection methods for DNA marker and their principles, characteristics and applications were summarized, and applications and prospects in tea plant were also reviewed to provide some references for their future researches.

DNA molecular markers; detection method; tea plant; review

S571.1

A

2015-02-16 初稿；2015-04-29 修改稿

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項（CARS-23）、湖南省科技重大專項（2014FJ1006）

劉振（1981-），男，助理研究員，研究方向為茶樹種質(zhì)資源與遺傳育種。

*通訊作者：楊陽（1963-），男，研究員，研究方向為茶樹種質(zhì)資源與遺傳育種，E-mail: yangyangsir@126.com