尹素改,王慧慧，吳耀松，陳玉龍

?

啟膈散乙酸乙酯提取物對(duì)食管癌Eca9706細(xì)胞增殖和凋亡的影響

尹素改,王慧慧，吳耀松，陳玉龍

目的 探討啟膈散乙酸乙酯提取物對(duì)食管癌Eca9706細(xì)胞增殖和凋亡的影響。方法 按沙參∶丹參∶茯苓∶川貝母(去心)∶郁金∶砂仁殼∶杵頭糠=6∶6∶2∶3∶1∶1∶1的比例配制啟膈散，每克藥物配10 ml的比例加入95%乙醇溶液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮藥液，濃縮液與乙酸乙酯按體積比2∶1進(jìn)行萃取，獲取啟膈散乙酸乙酯提取物。Eca9706細(xì)胞與濃度分別為12.5、25.0、50.0、100.0、200.0 μg/ml的啟膈散提取物共培養(yǎng)，MTT法檢測(cè)啟膈散提取物對(duì)Eca9706細(xì)胞的抑制率。Eca9706細(xì)胞與35%抑制濃度(IC35)、50%抑制濃度(IC50)和70%抑制濃度(IC70)的啟膈散提取物共培養(yǎng)，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)啟膈散提物對(duì)Eca9706細(xì)胞的凋亡率。結(jié)果 不同濃度啟膈散提取物對(duì)Eca9706細(xì)胞的抑制率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。啟膈散提取物對(duì)Eca9706細(xì)胞的抑制率與啟膈散提取物濃度擬合曲線(xiàn)方程為Y=-1.835×10-5X2+0.006X+0.185,R2=0.996,概率法計(jì)算IC35為22.8 μg/ml，IC50為81.8 μg/ml，IC70為162.2 μg/ml。顯微鏡下觀察，隨著啟膈散提取物濃度的增加，細(xì)胞變圓、變小，貼壁細(xì)胞數(shù)目逐漸減少，細(xì)胞間隙增大，細(xì)胞碎片增多。IC35、IC50和IC70啟膈散提取物對(duì)Eca9706細(xì)胞的凋亡率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。激光共聚焦顯微鏡下顯示，啟膈散提取物作用于Eca9706細(xì)胞后，部分細(xì)胞膜呈綠色，提示早期凋亡；部分細(xì)胞膜呈綠色，且細(xì)胞核呈紅色，細(xì)胞體積變小、變圓，形成凋亡小體，提示晚期凋亡細(xì)胞。結(jié)論 啟膈散乙酸乙酯提取物可抑制食管癌Eca9706細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

食管腫瘤；啟膈散；細(xì)胞增殖；Eca9706細(xì)胞；細(xì)胞凋亡

尹素改,王慧慧，吳耀松，等.啟膈散乙酸乙酯提取物對(duì)食管癌Eca9706細(xì)胞增殖和凋亡的影響[J].中國(guó)全科醫(yī)學(xué)，2015，18(14)：1663-1666.[www.chinagp.net]

Yin SG,Wang HH,Wu YS，et al.Effect of qigesan extracted by ethyl acetate on the proliferation and apoptosis of eca9706 cell in esophageal neoplasm[J].Chinese General Practice，2015，18(14)：1663-1666.

食管癌每年新發(fā)患者48萬(wàn)例，預(yù)后較差，5年生存率低于15%[1-2]。食管癌屬中醫(yī)“噎膈”范疇，啟膈散是《中醫(yī)內(nèi)科學(xué)》等書(shū)收載的治療食管癌(噎膈)的首選方劑[3]。該方可通過(guò)磷脂酶C-γ1(PLC-γ1)介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路抑制食管癌細(xì)胞生長(zhǎng)，通過(guò)Caspase-3介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡信號(hào)誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡，可不同程度地抑制EGFR、PKCα、MARCKS、PI3K、AKT-1和NF-κBp50蛋白的表達(dá)，抑制腫瘤血管生成及免疫調(diào)節(jié)作用。有研究已發(fā)現(xiàn)，本方水煎劑對(duì)食管癌細(xì)胞有一定抑制作用，但用量較大[4-5]。為提高該方抑制腫瘤效果，對(duì)其進(jìn)行分部位提取，本研究觀察了該方乙酸乙酯提取物對(duì)食管癌細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡的影響，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥物 啟膈散參照《醫(yī)學(xué)心悟》組方，藥物組成與比例為沙參∶丹參∶茯苓∶川貝母(去心)∶郁金∶砂仁殼∶杵頭糠=6∶6∶2∶3∶1∶1∶1；藥材均購(gòu)自北京同仁堂(集團(tuán))有限責(zé)任公司，并經(jīng)河南中醫(yī)學(xué)院苗艷艷副研究員鑒定為真品。

1.1.2 細(xì)胞及試劑 人食管癌細(xì)胞株Eca9706細(xì)胞為河南中醫(yī)學(xué)院分子生物實(shí)驗(yàn)中心保存；MTT和胰酶購(gòu)自索萊寶生物科技有限公司，批號(hào)：20131113；RPMI 1640培養(yǎng)基購(gòu)自索來(lái)寶生物科技有限公司，批號(hào)：20131012；胎牛血清購(gòu)自杭州四季青生物工程材料有限公司，批號(hào)：121005；Annexin V-FITC /PI Apoptosis Detection Kits 購(gòu)自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司，凋亡試劑盒批號(hào)：20131226。

1.1.3 儀器 細(xì)胞培養(yǎng)箱(德國(guó)Heraeus)，倒置顯微鏡(德國(guó)Carl Zeiss Jena)，BioMate紫外線(xiàn)分光光度計(jì)(美國(guó)Thermo Scientific)，SG-603生物安全柜(美國(guó)Bake)，ELx800型酶標(biāo)儀(美國(guó)BIO-TEK)，F(xiàn)V1000S-LX81激光共聚焦顯微鏡(日本Olympus)。

1.2 方法

1.2.1 藥物提取 按上述比例稱(chēng)取藥物，以每克藥物配10 ml的比例加入95%乙醇溶液浸泡7 d，震蕩2次/d，混勻。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮藥液，濃縮液與乙酸乙酯按體積比為2∶1進(jìn)行萃取，濃縮、低溫真空干燥、刮藥、稱(chēng)重，出膏率為0.82%(最終提取出的膏狀藥物重量與藥物用量比值)。二甲基亞砜(DMSO)充分溶解，配置成100 mg/ml的母液，0.22 μm過(guò)濾除菌，-20 ℃冰箱保存，備用。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) 用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液，于37 ℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)人食管癌細(xì)胞株Eca9706細(xì)胞，2～3 d傳代1次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 MTT法檢測(cè)啟膈散提取物對(duì)Eca9706細(xì)胞的抑制率 將Eca9706細(xì)胞以細(xì)胞密度104個(gè)/孔接種于96孔板中(96孔板周邊孔棄去不用，加無(wú)菌磷酸鹽緩沖液填充)，每孔加200 μl細(xì)胞懸液(含10%胎牛血清)，置于37 ℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中孵育24 h。棄去培養(yǎng)液，分別加入濃度為12.5、25.0、50.0、100.0、200.0 μg/ml的啟膈散提物100 μl。細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，每孔加入5 mg/ml的MTT 15 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸去上液，每孔加入DMSO 150 μl，輕輕振蕩后用酶標(biāo)儀檢測(cè)，570/630 nm處測(cè)各孔吸光度(OD)值，計(jì)算啟膈散提取物對(duì)Eca9706細(xì)胞的抑制率，抑制率=(對(duì)照OD值-待測(cè)OD值)/對(duì)照OD值×100%，重復(fù)4次。

1.2.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)啟膈散提取物對(duì)Eca9706細(xì)胞的凋亡率 Eca9706細(xì)胞以細(xì)胞密度105個(gè)/孔接種于培養(yǎng)皿中,培養(yǎng)24 h后，分別加入含35%抑制濃度(IC35)、50%抑制濃度(IC50)和70%抑制濃度(IC70)啟膈散提取物的RPMI 1640培養(yǎng)液,對(duì)照加RPMI 1640培養(yǎng)液與溶解藥物等量的DMSO,細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，用不含EDTA的胰酶消化，收集細(xì)胞，4 ℃磷酸鹽緩沖液沖洗，300×g離心5 min，計(jì)數(shù)105個(gè)細(xì)胞于流式管中，加結(jié)合液Buffer重懸細(xì)胞，后加Annexin V-FITC，避光10 min，后加PI避光5 min，1 h內(nèi)采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè),分別采用Cellquest軟件、Modfit LM軟件獲取、分析數(shù)據(jù)，重復(fù)4次，記錄凋亡率(可被Annexin V-FITC染色的細(xì)胞占流式細(xì)胞儀讀取總細(xì)胞數(shù)的比例)。

1.2.5 激光共聚焦檢測(cè)凋亡小體 Eca9706細(xì)胞以細(xì)胞密度105個(gè)/孔接種于激光共聚焦專(zhuān)用的小培養(yǎng)皿中,培養(yǎng)24 h后，加入含IC35、IC50和IC70啟膈散提取物的RPMI 1640培養(yǎng)液,對(duì)照加RPMI 1640培養(yǎng)液與溶解藥物等量的DMSO,細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，吸去培養(yǎng)液,用磷酸鹽緩沖液沖洗兩次，加500 μl的Buffer，后加Annexin V和異硫氰酸熒光素(FITC)，避光10 min，后加PI避光5 min，激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)，Viewer軟件分析圖片。

2 結(jié)果

2.1 啟膈散提取物對(duì)Eca9706細(xì)胞的抑制率 不同濃度啟膈散提取物對(duì)Eca9706細(xì)胞的抑制率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見(jiàn)表1)。啟膈散提取物對(duì)Eca9706細(xì)胞的抑制率與啟膈散提取物濃度擬合曲線(xiàn)方程為Y=-1.835×10-5X2+0.006X+0.185,R2=0.996,應(yīng)用概率法計(jì)算IC35為22.8 μg/ml，IC50為81.8 μg/ml，IC70為162.2 μg/ml(見(jiàn)圖1)。

Table 1 Comparison of Eca9706 cell inhibition rates among qigesan extractives of different concentrations

濃度OD值抑制率(%)對(duì)照1.18±0.23-啟膈散提取物12.5μg/ml0.89±0.2125±6 啟膈散提取物25.0μg/ml0.77±0.1635±8 啟膈散提取物50.0μg/ml0.62±0.1047±12* 啟膈散提取物100.0μg/ml0.43±0.0363±8*△ 啟膈散提取物200.0μg/ml0.31±0.0373±11*△▲F值-19.021P值-<0.001

注：-為無(wú)此數(shù)據(jù)；與啟膈散提取物12.5 μg/ml比較，*P<0.05；與啟膈散提取物25.0 μg/ml比較，△P<0.05；與啟膈散提取物50.0 μg/ml比較，▲P<0.05

2.2 細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變 顯微鏡下觀察，正常Eca9706細(xì)胞呈橢圓形、多邊形、鋪路石樣貼壁生長(zhǎng)，胞質(zhì)飽滿(mǎn)，典型的上皮細(xì)胞形態(tài)；隨著啟膈散提取物濃度的增加，細(xì)胞變圓、變小，貼壁細(xì)胞數(shù)目逐漸減少，細(xì)胞間隙增大，細(xì)胞碎片增多(見(jiàn)圖2)。

圖1 不同濃度啟膈散提取物與Eca9706細(xì)胞抑制率的關(guān)系

Figure 1 Relation between Eca9706 cell inhibition rates and qigesan extractives of different concentrations

注：A為對(duì)照，B為IC35啟膈散提取物，C為IC50啟膈散提取物，D為IC70啟膈散提取物

圖2 不同濃度啟膈散提取物對(duì)Eca9706細(xì)胞形態(tài)的影響(×100)

Figure 2 Effects of qigesan extractives of different concentrations on the form of Eca9706 cells

2.3 啟膈散提取物對(duì)Eca9706細(xì)胞的凋亡率 IC35、IC50和IC70啟膈散提取物對(duì)Eca9706細(xì)胞的凋亡率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001，見(jiàn)表2)。

2.4 凋亡小體 激光共聚焦顯微鏡下顯示，啟膈散提取物作用于Eca9706細(xì)胞后，部分細(xì)胞膜呈綠色，提示早期凋亡；部分細(xì)胞膜呈綠色，且細(xì)胞核呈紅色，細(xì)胞體積變小、變圓，形成凋亡小體，提示晚期凋亡細(xì)胞。與對(duì)照比較，IC50啟膈散提取物造成Eca9706細(xì)胞早期凋亡和晚期凋亡的細(xì)胞數(shù)量明顯增多(見(jiàn)圖3)。

Table 2 Comparison of Eca9706 cell apoptosis rates among qigesan extractives of different concentrations

濃度凋亡率(%)對(duì)照1.35±1.13 IC35啟膈散提取物7.92±1.24* IC50啟膈散提取物12.65±1.21*△ IC70啟膈散提取物20.26±1.18*△▲F值151.967P值<0.001

注：與對(duì)照比較，*P<0.05；與IC35啟膈散提取物比較，△P<0.05；與IC50啟膈散提取物比較，▲P<0.05

注：A為對(duì)照的明場(chǎng)，B為對(duì)照的熒光，C為IC50啟膈散提取物的明場(chǎng)，D為IC50啟膈散提取物的熒光

圖3 激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)結(jié)果(×400)

Figure 3 Results of laser confocal microscope test

3 討論

食管癌屬中醫(yī)“噎膈”范疇，痰氣交阻是噎膈發(fā)生的主要病機(jī)，痰氣交阻證是其最常見(jiàn)證候之一。在1979年1月—2011年12月中國(guó)知網(wǎng)(CNKI)收錄的有關(guān)中醫(yī)診治食管癌的223篇文獻(xiàn)中，痰氣交阻證占13個(gè)食管癌證型的19.7%(14/71)[6]。啟膈散是行氣化痰法治療食管癌的代表方劑，是清代名醫(yī)程鐘齡《醫(yī)學(xué)心悟》中為治療噎膈而創(chuàng)制，原書(shū)說(shuō)本方：“通噎膈，開(kāi)關(guān)之劑，屢效?！?/p>

本方水煎劑對(duì)食管癌細(xì)胞有一定抑制作用，但用量較大[4-5]。為提高該方抑制腫瘤效果，對(duì)其進(jìn)行分部位提取。本研究發(fā)現(xiàn)，啟膈散乙酸乙酯部位可有效抑制食管癌細(xì)胞增殖(IC50=81.8 μg/ml)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。臨床啟膈散只以水煎劑應(yīng)用，會(huì)丟失很多有效成分。因此，有必要結(jié)合現(xiàn)代藥理藥效學(xué)指標(biāo)對(duì)啟膈散的提取工藝進(jìn)行深入研究。

逃脫細(xì)胞死亡是癌的特性之一，其中凋亡是死亡的主要形式，發(fā)揮對(duì)腫瘤發(fā)展的天然限制作用。但腫瘤細(xì)胞可以許多策略減弱或繞過(guò)凋亡，如失去TP53的腫瘤抑制功能、增加抗凋亡調(diào)節(jié)因子的表達(dá)，在腫瘤發(fā)展成為高惡性及耐受治療過(guò)程中發(fā)揮重要作用[7]。對(duì)此，有研究發(fā)現(xiàn)許多天然藥物提取物可通過(guò)干預(yù)細(xì)胞凋亡起到抑制腫瘤作用[8]。本研究通過(guò)激光共聚焦顯微鏡觀察到，Eca9706細(xì)胞經(jīng)啟膈散乙酸乙酯提取物作用后發(fā)生早期和晚期凋亡現(xiàn)象。

綜上所述，啟膈散乙酸乙酯提取物可抑制食管癌Eca9706細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，但其作用分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

[1]Ferlay J，Shin HR，Bray F，et al.Estimates of worldwide burden of cancer in 2008:GLOBOCAN 2008[J].Int J Cancer，2010，127(12)：2893-2917.

[2]Enzinger PC，Robert RJ.Esophageal cancer[J].N Engl J Med，2003,349(23)：2241-2252.

[3]周仲英.中醫(yī)內(nèi)科學(xué)[M].北京：中國(guó)中醫(yī)藥出版社，2003：223-230.

[4]Si FC，Chen YL.Effects of qigesan and its constituents on phospholipase-C-γ1-mediated signaling in esophageal carcinoma cell line Eca109[J].World Chinese Journal of Digestology，2007，15(24):2583-2588.(in Chinese) 司富春，陳玉龍.啟膈散及其拆方對(duì)食管癌細(xì)胞Eca109 PLC gamma1介導(dǎo)的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響[J].世界華人消化雜志，2007，15(24):2583-2588.

[5]Cai XR，Li JJ，Wang QK，et al.Antitumor effect of Qigesans extract[J].Hebei Journal of Traditional Chinese Medicine，2009，31(9)：1379-1380.(in Chinese) 才曉茹，李際君，王慶凱,等.啟膈散對(duì)荷瘤鼠的腫瘤及其免疫調(diào)節(jié)作用[J].河北中醫(yī)，2009，31(9)：1379-1380.

[6]Si FC，Liu ZY.Analysis on TCM syndrome types and prescription rules of esophageal cancer[J].China Journal of Chinese Medicine，2012，169(6)：655-657.(in Chinese) 司富春，劉紫陽(yáng).食管癌中醫(yī)證型和用藥規(guī)律分析[J].中醫(yī)學(xué)報(bào)，2012，169(6)：655-657.

[7]Hanahan D,Weinberg RA.Hallmarks of cancer:the next generation[J].Cell，2011,144(5):646-674.

[8]Yan H,Wang X,Niu J,et al.Anti-cancer Effect and the underlying mechanisms of gypenosides on human colorectal cancer SW-480 cells[J].PLoS One，2014，9(4):e95609.

(本文編輯：吳立波)

Effect of Qigesan Extracted by Ethyl Acetate on the Proliferation and Apoptosis of Eca9706 Cell in Esophageal Neoplasm

YINSu-gai,WANGHui-hui,WUYao-song，etal.

MolecularBiologicalExperimentCenter,HenanUniversityofTraditionalChineseMedicine，Zhengzhou450046,China

Objective To investigate the effect of qigesan extracted by ethyl acetate on the proliferation and apoptosis of Eca9706 cell in esophageal neoplasm.Methods Qigesan used in the study was confected by the set recipe(adenophora stricta∶red sage root∶poria cocos∶fritillaria cirrhosa with core removed∶curcuma aromatic∶fructus amomi shuck∶rice bran=6∶6∶2∶3∶1∶1∶1).With the proportion of 1 gram of qigesan/ 10 ml ethanol solution,qigesan was mixed with 95% ethanol solution.A rotary evaporator was used to concentrate the mixed liquor.After mixing the concentrated liquor with ethyl acetate as the volume ratio of 2∶1,we got the finished qigesan extractive.Eca9706 cells was co-cultured with the extractives of 12.5,25.0,50.0,100.0 and 200.0 μg/ml concentrations,and MTT method was used to test the inhibition ratios of Eca9706 cells caused by the extractives of different concentrations.Then Eca9706 cells were co-cultured with the extractives of 35% inhibition concentration (IC35),50% inhibition concentration (IC50) and 70% inhibition concentration (IC70),and flow cytometry was employed to test the apoptosis rates of Eca9706 caused by the extractives.Results Qigesan extractives of different concentrations induced different (P<0.05) inhibition ratios of Eca9706 cells.The curve-fitting equation for inhibition ratios of Eca9706 cells and the concentrations of qigesan extractives was Y=-1.835×10-5X2+0.006X+0.185(R2=0.996).After calculating by the equation,we found that the concentrations for IC35,IC50 and IC70 were 22.8 μg/ml，81.8 μg/ml and 162.2 μg/ml respectively.Through a microscope,we observed that,as the concentration of qigesan extractives increasing,Eca9706 cells became rounder and smaller,the amount of adherent cells decreased,the intercellular space expanded and the cell debris increased.IC35,IC50 and IC70 extractives caused significantly different (P<0.001) apoptosis rates of Eca9706 cells.Through a laser scanning confocal microscope,we noted that,with the influence of qigesan extractives,some Eca9706 cells turned green,which suggested early apoptosis,and some Eca9706 cells turned green in cytomembrane and red in cell nucleus with shrinking volume and rounder shape,which suggested apoptotic body and late apoptosis.Conclusion Qigesan extractive could significantly inhibit the proliferation of Eca9706 cells and induce Eca9706 cell apoptosis.

Esophageal neoplasms;Qigesan； Cell proliferation； Eca9706 cell； Apoptosis

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(81173177)；河南省高等學(xué)校重點(diǎn)科研項(xiàng)目(15A310020)

450046河南省鄭州市，河南中醫(yī)學(xué)院科研處分子生物實(shí)驗(yàn)中心

陳玉龍，450046河南省鄭州市，河南中醫(yī)學(xué)院科研處分子生物實(shí)驗(yàn)中心；E-mail：cyl172621@163.com

R 735.1

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2015.14.015

2014-11-25；

2015-04-02)