葉 瑾，司 瑞，郝啟萌，付志誠，張榮慶，郭文怡

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·論著·

胰島素通過Akt/FoxO/SVV信號(hào)通路抑制缺血再灌注損傷誘導(dǎo)心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的作用研究

葉 瑾，司 瑞，郝啟萌，付志誠，張榮慶，郭文怡

目的 探討胰島素(INS)在抑制缺血再灌注損傷(IRI)誘導(dǎo)的心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞(CMECs)凋亡中的作用及其分子機(jī)制。方法 分離和培養(yǎng)大鼠CMECs，建立模擬缺血再灌注(SI/R)模型，分別選用INS、磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)特異性抑制劑渥曼青霉素(Wort)和FoxO1/3a干擾RNA處理細(xì)胞。采用隨機(jī)數(shù)字表法對(duì)大鼠CMECs進(jìn)行分組：SI/R組(5只大鼠的CMECs)，SI/R+INS組(5只大鼠的CMECs)，SI/R+INS+Wort組(5只大鼠的CMECs)，SI/R+INS+FoxO1siRNA組(6只大鼠的CMECs)，SI/R+INS+FoxO3asiRNA組(4只大鼠的CMECs)。采用末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記技術(shù)(TUNEL)檢測各組CMECs凋亡率，ELISA法檢測各組Caspase-3活性，Western blotting法檢測各組p-Akt(Ser473)、p-FoxO1(Ser256)、p-FoxO3a(Thr32)、生存素(SVV)蛋白表達(dá)水平。結(jié)果 與SI/R組比較，SI/R+INS組、SI/R+INS+FoxO1siRNA組、SI/R+INS+FoxO3asiRNA組CMECs凋亡率及Caspase-3活性均降低(P<0.01)；而SI/R+INS+Wort組CMECs凋亡率及Caspase-3活性與SI/R組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與SI/R+INS組比較，SI/R+INS+FoxO1siRNA組、SI/R+INS+FoxO3asiRNA組CMECs凋亡率及Caspase-3活性升高(P<0.01)；且SI/R+INS+FoxO1siRNA組CMECs凋亡率高于SI/R+INS+FoxO3asiRNA組(P<0.01)。Western blotting檢測結(jié)果顯示:SI/R+INS組p-Akt、p-FoxO1、p-FoxO3a、SVV蛋白表達(dá)水平均高于SI/R、SI/R+INS+Wort組、SI/R+INS+FoxO1siRNA組以及SI/R+INS+FoxO3asiRNA組(P<0.01)；且SI/R+INS+FoxO3asiRNA組SVV蛋白表達(dá)水平低于SI/R+INS+FoxO1siRNA組(P<0.01)。結(jié)論 NIS可顯著抑制IRI誘導(dǎo)的CMECs凋亡，其機(jī)制可能與激活A(yù)kt/FoxO/SVV信號(hào)通路相關(guān)，且主要通過FoxO3a的激活上調(diào)SVV蛋白表達(dá)水平，從而抑制CMECs凋亡。

胰島素；再灌注損傷；信號(hào)傳導(dǎo)；內(nèi)皮細(xì)胞；細(xì)胞凋亡

葉瑾，司瑞，郝啟萌，等.胰島素通過Akt/FoxO/SVV信號(hào)通路抑制缺血再灌注損傷誘導(dǎo)心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的作用研究[J].中國全科醫(yī)學(xué)，2015，18(9)：1012-1017.[www.chinagp.net]

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缺血再灌注損傷(ischemia reperfusion injury，IRI)是急性心肌梗死患者溶栓和冠狀動(dòng)脈介入治療過程中出現(xiàn)的重要臨床現(xiàn)象，其抵消了血管再通給患者帶來的臨床受益，嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致患者病情惡化甚至影響遠(yuǎn)期預(yù)后，因此，如何有效預(yù)防并減少IRI是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)[1-4]。研究報(bào)道，細(xì)胞凋亡是IRI的重要機(jī)制之一，以往研究表明，胰島素(INS)可通過絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(Akt)/內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)/一氧化氮(NO)細(xì)胞生存信號(hào)機(jī)制抑制IRI誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞或血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，發(fā)揮心臟保護(hù)作用[1-2]，然而其是否能抑制IRI誘導(dǎo)的心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞(cardiac microvascular endothelial cells，CMECs)凋亡及其相關(guān)機(jī)制少有報(bào)道。FoxO1/3a是近年發(fā)現(xiàn)的FoxO家族蛋白，參與體內(nèi)多種生理活動(dòng)，特別是對(duì)細(xì)胞凋亡的調(diào)控發(fā)揮重要作用[3-5]。本課題組在前期研究中已證實(shí)INS可通過上調(diào)凋亡抑制蛋白生存素(survivin，SVV)表達(dá)，從而抑制CMECs凋亡[3]，但其相關(guān)分子機(jī)制是否與激活FoxO1/3a相關(guān)仍不明確。本實(shí)驗(yàn)通過建立CMECs的IRI模型，觀察INS在抑制IRI誘導(dǎo)的CMECs凋亡中是否與激活A(yù)kt/FoxO1/FoxO3a/SVV信號(hào)通路相關(guān)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和材料 清潔級(jí)健康雄性SD大鼠25只，體質(zhì)量150～200 g，由第四軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。胎牛血清、DMEM低糖培養(yǎng)基購自北京索萊寶科技有限公司。末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記技術(shù)(terminal dexynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling，TUNEL)試劑盒購自Roche公司。磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)抑制劑渥曼青霉素(Wort，100 nmol/L)抗體購自Abcam公司。INS、Akt、p-Akt(Ser473)、FoxO1、p-FoxO1(Ser256)、FoxO3a、p-FoxO3a(Thr32)及SVV抗體均購自Cell Signaling公司。FoxO1/3asiRNA、NC siRNA購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 大鼠CMECs的分離培養(yǎng) SD大鼠脫頸處死后在無菌環(huán)境下取出心臟，剪取心尖部，置入75%乙醇中浸泡15 s以滅活心內(nèi)膜外細(xì)胞。將實(shí)驗(yàn)所需心肌組織剪碎呈1 mm3，加入Ⅱ型膠原酶(0.2 g/L)3 ml，置入37 ℃水浴鍋中消化5 min，再加入胰蛋白酶(0.25 g/L)4 ml消化5 min；最后DMEM低糖培養(yǎng)基終止消化，以1 200 r/min離心15 min(離心半徑為3.5 cm)。棄上清液，DMEM(20%FBS)無糖培養(yǎng)基重懸后接種于25 cm2培養(yǎng)瓶，于37 ℃、5%CO2恒溫孵箱中培養(yǎng)，孵育6 h后第一次換液，以后每2 d換液1次。2～3 d后細(xì)胞呈鋪路石狀長滿培養(yǎng)瓶底并行細(xì)胞傳代。當(dāng)細(xì)胞呈對(duì)數(shù)生長期時(shí)作為下一步實(shí)驗(yàn)所需細(xì)胞。

1.2.2 模擬缺血再灌注(SI/R)模型的建立與分組 建立SI/R模型，將培養(yǎng)液更換為缺血液，置于37 ℃三氣孵箱內(nèi)孵育，2 h后取出培養(yǎng)瓶。按隨機(jī)數(shù)字表法對(duì)大鼠的CMECs進(jìn)行分組：(1)SI/R組(5只大鼠的CMECs)，再灌注時(shí)更換正常培養(yǎng)液；(2)SI/R+INS組(5只大鼠的CMECs)，再灌注加入含INS的培養(yǎng)液；(3)SI/R+INS+Wort組(5只大鼠的CMECs)，缺血前15 min給予PI3K抑制劑Wort(100 nmol/L)，再灌注加入含INS的培養(yǎng)液；(4)SI/R+INS+FoxO1siRNA組(6只大鼠的CMECs)，缺血48 h前給予FoxO1siRNA-脂質(zhì)體復(fù)合物溶液；(5)SI/R+INS+FoxO3asiRNA組(4只大鼠的CMECs)，缺血48 h前給予FoxO3asiRNA-脂質(zhì)體復(fù)合物溶液。隨后根據(jù)不同分組更換培養(yǎng)液，然后37 ℃、5%CO2孵箱內(nèi)孵育4 h后檢測。

1.2.3 siRNA的合成與轉(zhuǎn)染 大鼠CMECs FoxO1siRNA mRNA上游引物為5′-GAGGAUUGAACCAGUAUAATT-3′，下游引物為5′-UUAUACUGGUUCAAUCCUCTT-3′，F(xiàn)oxO3asiRNA mRNA上游引物為5′-GCACCAUGAAUCTGACCGAUT-3′，下游引物為5′-UCGGUCACAUUCAUGGUGCGT-3′，NC siRNA mRNA上游引物為5′-UCUUCTGUCAGUGUCTCGUGT-3′，下游引物為5′-CGCUGACACTUCCGGAGUACT-3′。轉(zhuǎn)染前24 h，將CMECs接種在6孔板上，每孔約5×106個(gè)細(xì)胞，使每孔細(xì)胞飽和度在轉(zhuǎn)染前達(dá)到70%～80%，使用不含雙抗的培養(yǎng)液，按轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。將FoxO1/3asiRNA及NC siRNA分別和Lipofectamine2000按4∶100 mg/L的比例，用250 μl轉(zhuǎn)染專用液Opti-MEMI稀釋，孵育5 min后，稀釋的siRNA和Lipofectamine2000混勻，常溫孵育20 min，然后將500 μl混合物加入細(xì)胞培養(yǎng)基中，輕輕混勻，37 ℃培養(yǎng)6 h，將培養(yǎng)液吸出，加入新鮮培養(yǎng)基。

1.2.4 TUNEL染色法 成功構(gòu)建SI/R模型，收集細(xì)胞并制備爬片，根據(jù)TUNEL試劑盒說明書要求進(jìn)行染色操作。光學(xué)顯微鏡下觀察，每張爬片隨機(jī)選取8個(gè)視野(×200)進(jìn)行計(jì)數(shù)，分別計(jì)算總的CMECs數(shù)和凋亡細(xì)胞數(shù)，計(jì)算平均值。凋亡率=凋亡細(xì)胞數(shù)/總的CMECs數(shù)×100%。

1.2.5 Caspase-3活性檢測 按試劑盒說明操作，以6孔板培養(yǎng)CMECs，待細(xì)胞貼壁達(dá)80%左右后分組實(shí)驗(yàn)。碧云天BCA試劑盒測定蛋白水平，各組取150 μg CMECs與Caspase-3底物反應(yīng)，以測定405 nm處的吸光度值(A)作為實(shí)驗(yàn)值，同時(shí)取細(xì)胞裂解液與Caspase-3底物反應(yīng)測定A405作為本底值。Caspase-3活性=實(shí)驗(yàn)值A(chǔ)405-本底值A(chǔ)405。

1.2.6 Western blotting法檢測p-Akt、p-FoxO1、p-FoxO3a、SVV蛋白表達(dá)水平 分離培養(yǎng)細(xì)胞，并成功構(gòu)建模型后，將各組細(xì)胞重懸至細(xì)胞裂解液中，4 ℃裂解細(xì)胞，以1 000 r/min低溫離心15 min(離心半徑為13.5 cm)。取上清液，BCA法測定蛋白水平，各組上樣60 μg，100 ml/L聚丙烯酰胺電泳分離并轉(zhuǎn)至硝酸纖維膜，含5%脫脂奶粉封閉1 h，兔抗FoxO1、FoxO3a抗體(1∶1 000)4 ℃孵育過夜，TBST溶液洗膜3次，15 min/次。室溫下加入辣根過氧化物酶標(biāo)的山羊抗兔二抗(1∶500)孵育2 h，洗膜3次。以β-actin作為內(nèi)參照標(biāo)化FoxO1、FoxO3a表達(dá)，以GAPDH作為內(nèi)參照標(biāo)化SVV蛋白表達(dá)，Western blotting的結(jié)果采用Gel-pro Analyzer 4.5軟件進(jìn)行灰度分析。

2 結(jié)果

2.1 各組CMECs凋亡率比較 5組CMECs凋亡率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。組間兩兩比較：與SI/R組比較，SI/R+INS組、SI/R+INS+FoxO1siRNA組、SI/R+INS+FoxO3asiRNA組的CMECs凋亡率均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與SI/R+INS組比較，SI/R +INS+Wort組、SI/R+INS+FoxO1siRNA組、SI/R+INS+FoxO3asiRNA組的CMECs凋亡率均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；且SI/R+INS+FoxO1siRNA組的CMECs凋亡率低于SI/R+INS+FoxO3asiRNA組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；SI/R組與SI/R +INS+Wort組的CMECs凋亡率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見圖1、表1)。

2.2 Caspase-3活性比較 5組細(xì)胞Caspase-3活性比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。組間兩兩比較：與SI/R組比較，SI/R+INS組、SI/R+INS+FoxO1siRNA組、SI/R+INS+FoxO3asiRNA組的Caspase-3活性均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與SI/R+INS 組比較，SI/R+INS+Wort組、SI/R+INS+FoxO1siRNA組、SI/R+INS+FoxO3asiRNA組的Caspase-3活性均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；且SI/R+INS+FoxO1siRNA組高于SI/R+INS+FoxO3asiRNA組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；SI/R組與SI/R +INS+Wort組的Caspase-3活性比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見表1)。

注：末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記技術(shù)(TUNEL)染色陽性為凋亡細(xì)胞，呈綠色熒光；4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)對(duì)所有細(xì)胞核進(jìn)行染色，呈藍(lán)色熒光

圖1 TUNEL法檢測CMECs凋亡率(×200)

Figure 1 CMECs apoptosis rate detected by TUNEL

Table 1 Comparison of apoptosis rate of CMECs and activity of Caspase-3 in each group

組別例數(shù)CMECs凋亡率(%)Caspase-3活性SI/R組525.64±1.62175.00±12.46SI/R+INS組57.06±0.97*41.60±7.50*SI/R+INS+Wort組525.14±1.61△157.60±14.17△SI/R+INS+FoxO1siRNA組615.91±1.84*△127.66±20.84*△SI/R+INS+FoxO3asiRNA組417.60±7.30*△▲108.50±8.69*△▲F值133.6166.16P值<0.01<0.01

注：與SI/R組比較,*P<0.01;與SI/R+INS組比較,△P<0.01;與SI/R+INS+FoxO1siRNA組比較,▲P<0.01;CMECs=心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞

2.3 CMECs中p-Akt、p-FoxO1、p-FoxO3a、SVV蛋白表達(dá)水平比較 Western blotting檢測結(jié)果顯示，5組細(xì)胞p-Akt水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)；組間兩兩比較：與SI/R組比較，SI/R+INS組、SI/R+INS+Wort組、SI/R+INS+FoxO1siRNA組、SI/R+INS+FoxO3asiRNA組p-Akt水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；SI/R+INS組p-Akt水平較SI/R+INS+Wort組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與SI/R+INS+Wort組比較，SI/R+INS+FoxO1siRNA組、SI/R+INS+FoxO3asiRNA組p-Akt水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見圖2)。5組細(xì)胞p-FoxO1、p-FoxO3a水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)；組間兩兩比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見圖3、4)。5組SVV蛋白表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001);組間兩兩比較：與SI/R組比較，SI/R+INS組、SI/R+INS+Wort組、SI/R+INS+FoxO1siRNA組、SI/R+INS+FoxO3asiRNA組SVV蛋白表達(dá)水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與SI/R+INS組比較，SI/R+INS+Wort組、SI/R+INS+FoxO3asiRNA組SVV蛋白表達(dá)水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與SI/R+INS+Wort組比較，SI/R+INS+FoxO1siRNA組、SI/R+INS+FoxO3asiRNA組SVV蛋白表達(dá)水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；SI/R+INS+FoxO1siRNA組SVV蛋白表達(dá)水平較SI/R+INS+FoxO3asiRNA組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而SI/R+INS+FoxO1siRNA組與SI/R+INS組的SVV蛋白表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見圖5、表2)。

3 討論

血管內(nèi)皮細(xì)胞是血液與組織之間的生理屏障，承擔(dān)著至關(guān)重要的生理功能，對(duì)維護(hù)機(jī)體穩(wěn)態(tài)十分重要。CMECs與其他內(nèi)皮細(xì)胞相比，在形態(tài)和功能上均具有顯著特異性[6]。研究發(fā)現(xiàn)，在IRI中CMECs凋亡明顯早于心肌細(xì)胞，提示CMECs是IRI中最早并最先波及的部位，因此保護(hù)CMECs是早期抑制IRI的關(guān)鍵因素[7-8]。

Fox基因即Forkhead，命名起源于1989年首次發(fā)現(xiàn)果蠅的“叉頭”，是上述叉頭轉(zhuǎn)錄因子的總稱，F(xiàn)oxO是Forkhead轉(zhuǎn)錄因子家族中的亞族，F(xiàn)oxO1、FoxO3a是人類O亞家族4個(gè)同源基因中的重要成員，其通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控手段，在細(xì)胞的生長、分化、代謝、凋亡和免疫等方面起關(guān)鍵作用[9-11]。PI3K/Akt是細(xì)胞內(nèi)重要的促增殖和抗凋亡的經(jīng)典信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，可通過影響下游細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白和凋亡相關(guān)蛋白等效應(yīng)分子的活性實(shí)現(xiàn)其激活，導(dǎo)致細(xì)胞周期的失控和細(xì)胞凋亡的異常[12]。研究證實(shí)，F(xiàn)oxO1、FoxO3a是Akt的主要靶蛋白[13]。文獻(xiàn)報(bào)道，Akt從不同位點(diǎn)上磷酸化FoxO1、FoxO3a，在結(jié)構(gòu)蛋白14-3-3的協(xié)調(diào)作用下，使得FoxO1、FoxO3a發(fā)生核排斥，從細(xì)胞核內(nèi)易位并滯留于細(xì)胞質(zhì)中，伴隨轉(zhuǎn)錄激活靶基因活性表達(dá)的降低，使得FoxO1、FoxO3a活性受到抑制，從而促進(jìn)細(xì)胞生長和增殖，抑制凋亡[13-17]。筆者在研究中發(fā)現(xiàn)，INS可通過激活PI3K/Akt信號(hào)通路促使FoxO1、FoxO3a發(fā)生磷酸化，抑制IRI誘導(dǎo)的CMECs凋亡，這與Daly等[18]的研究發(fā)現(xiàn)類似，但其下游分子尚不清楚。SVV是近年發(fā)現(xiàn)的一個(gè)抑制細(xì)胞凋亡的重要分子，筆者前期研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)，IRI本身可刺激心肌細(xì)胞表達(dá)少量的SVV，而INS也可通過激活PI3K/Akt信號(hào)通路抑制心肌細(xì)胞凋亡，同時(shí)證實(shí)，顯著提高SVV蛋白表達(dá)水平后，可抑制IRI誘導(dǎo)的CMECs凋亡[3,7]，但 FoxO1/3a是否通過參與此信號(hào)通路并調(diào)節(jié)SVV蛋白表達(dá)水平來誘導(dǎo)CMECs的增殖與凋亡尚不明確。

圖2 Western blotting法檢測p-Akt水平

圖3 Western blotting法檢測FoxO1表達(dá)量及p-FoxO1水平

Figure 3 FoxO1expression and FoxO1Phosphorylation level detected by western blotting

圖4 Western blotting法檢測FoxO3a表達(dá)量及p-FoxO3a水平

Figure 4 FoxO3aexpression and FoxO3aPhosphorylation level detected by western blotting

注：SVV=生存素

圖5 Western blotting法檢測SVV表達(dá)量

注：與SI/R組比較,*P<0.05;與SI/R+INS組比較,△P<0.05;與SI/R+INS+Wort組比較,▲P<0.05;與SI/R+INS+FoxO1siRNA組比較,★P<0.05；SVV=生存素；-代表不存在

本實(shí)驗(yàn)中，通過建立CMECs SI/R模型，分別應(yīng)用PI3K特異性抑制劑Wort、FoxO1/3a干擾RNA處理細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)在SI/R后，p-FoxO1、p-FoxO3a水平降低，給予INS培養(yǎng)液后，p-FoxO1/3a水平及下游分子SVV蛋白表達(dá)水平均升高；分別給予FoxO1/3a干擾RNA后發(fā)現(xiàn)，p-FoxO1、p-FoxO3a、SVV蛋白表達(dá)水平均降低，且SI/R+INS+FoxO3asiRNA組SVV蛋白表達(dá)水平低于SI/R+INS+FoxO1siRNA組。由此推測，INS通過PI3K/Akt/FoxO信號(hào)通路，促使CMECs內(nèi)FoxO1/3a發(fā)生磷酸化，且主要為FoxO3a磷酸化，從而顯著上調(diào) SVV蛋白表達(dá)水平，抑制IRI誘導(dǎo)的CMECs凋亡；同時(shí)也在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，加入PI3K/Akt特異性抑制劑Wort后，CMECs凋亡率升高，推測在IRI誘導(dǎo)的CMECs凋亡中尚有其他信號(hào)通路存在。

綜上所述，INS可通過Akt/FoxO/SVV信號(hào)通路抑制IRI誘導(dǎo)的CMECs凋亡，同時(shí)為INS治療IRI提供重要的理論依據(jù)。對(duì)于其他信號(hào)通路如何調(diào)控IRI誘導(dǎo)的CMECs凋亡加重心肌IRI的機(jī)制，還有待于后續(xù)研究。

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(本文編輯：高曉歡)

Research on Insulin Inhibition of Cardiac Microvascular Endothelial Cells Apoptosis Induced by Ischemia Reperfusion Injury through Akt/FoxO/SVV Pathway

YEJin,SIRui,HAOQi-meng,etal.

DepartmentofCardiology，XijingHospitalofFourthMilitaryMedicalUniversity，Xi′an710032，China

Objective To explore the effect and mechanisms of insulin(INS) inhibition of apoptosis of microvascular endothelial cells (CMECs) induced by ischemia reperfusion injury(IRI).Methods CMECs were isolated from the hearts of adult rats to establish IRI model.INS,Wortmannin(Wort) and FoxO1/3asiRNA were used to process the cells.The CMECs were randomly divided into SI/R group (CMECs of 5 rats),SI/R+INS group(CMECs of 5 rats),SI/R+INS+Wort group(CMECs of 5 rats),SI/R +INS+FoxO1siRNA group(CMECs of 6 rats) and SI/R+INS+FoxO3asiRNA group(CMECs of 4 rats).TUNEL was used to detect the apoptosis rate of CMECs in each group.ELISA was used to detect the activity of Caspase-3 in each group.Western blotting method was used to detect the levels of p-Akt (Ser473),p-FoxO1(Ser256) and p-FoxO3a(Thr32) and the protein expression of SVV.Results Compared with SI/R group,apoptotic index and Caspase-3 activity were significantly lower in groups of SI/R+INS,SI/R+INS+FoxO1siRNA,SI/R+INS+FoxO3asiRNA(P<0.01);but the apoptotic index and Caspase-3 activity in SI/R+INS+Wort group showed no significant difference compared with SI/R group (P>0.05);compared with SI/R+INS group,apoptotic index and Caspase-3 activity was significantly increased in groups of SI/R+INS+FoxO1siRNA and SI/R+INS+FoxO3asiRNA,and the apoptotic index in SI/R+INS+FoxO1siRNA group was significantly higher than that of the SI/R+INS+FoxO3asiRNA group (P<0.01).Western blotting analysis showed that p-Akt level,p-FoxO1level,p-FoxO3alevel and SVV protein expression in SI/R+INS group were significantly higher than groups of SI/R,SI/R+INS +Wort,SI/R+INS+FoxO1siRNA and SI/R+INS+FoxO3asiRNA (P<0.01);and the SVV protein expression in SI/R+INS+FoxO3asiRNA group was significantly lower than that of the SI/R+INS+FoxO1siRNA group (P<0.01).Conclusion INS can significantly inhibit the apoptosis of CMECs induced by IRI,and the possible mechanism may be the activation of Akt/FoxO1/SVV pathway,and it is mainly through the up-regulation of SVV based on the activation of FoxO3a.

Insulin;Reperfusion injury;Signal transduction;Endothelial cells;Apoptosis

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81070126)

710032 陜西省西安市，第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院心內(nèi)科

郭文怡，710032 陜西省西安市，第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院心內(nèi)科；E-mail：guowenyi@tom.com

R 322.13

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2015.09.008

2014-09-26；

2015-01-01)